Сравнительная характеристика мутантных форм протеиназы вируса иммунодефицита человека тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНОВ ЛЕНИНА, ОКТЯБРСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

л „ ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

и Л

На правах рукописи

СУВОРОВ Леонид Иванович

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МУТАНТНЫХ ФОРМ ПРОТЕИНАЗЫ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА.

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных

веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в Национальном Институте Рака США

Научный руководитель :

кандидат химических наук С.В.Гульник

Научный консультант:

доктор химических наук А.А.Байков

Оффицналыше оппоненты:

доктор химических наук: Л.М.Гинодман доктор химических наук В.И.Тишков

Ведущая организация: Институт вирусологии им Д.И.Ивановского РАМН

Защита состоится «2й марта 1996 г. в ¡6_ часов на заседании диссертационного Ученого совета Д.053.05.47 при Московском Государственном Университете им М.В.Ломоносова по адресу: 119899, ГСП-3, Ленинские горы. Институт физико-химической биологии лм. Белозерского МГУ, аудитория 501

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан "_" февраля 1996 года

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Лктуешьшхл-ь проблелш. В псхувдасе двадцатилетие XX века синдром гриобр1ггснпого иммунодефицита человек^ 0ЩД1 стал одним самых разрушительных заболеваний человечества за всю сто историю. Несмотря на то, что жизненый цикл вирус инзчуподефздгга человека (H3V) и его структура детально изучены, вопрос о создании эффективных антивирусных препаратов остается открытым. Логичными кшневямн д(я таких лекарств пвллзитсл ферменты, закодированные в геноме вируса -протеиназа, обратная трапсааоггаза н интеграза. Каждый га аих абсолютно необходим для формирования зрелого инфекционного вируса. Ингибиторы протеин азы и обратной трапскилгазы уже используются как лекарства против ОТИД Однако высокая вариабельность генома вируса создает предпосылки для быстрого образования мутантвых форц устойчивых к действию лекарственных средств. Было гкжгзано, что иптесипзая терапия СПИД, с использованием ингибиторов протемшы и обратной трапехрипташ быстро приводят к образованию устойчивых вариантов вируса, которые во всех случаях коррелируют с мутациями в генах, кодирующих соответствующие ферменты В случае антнгцютеиназной терапии также отмечены, игутацин полнбелка gag/gag-pol в местах раезцеплення протеиназон. Для дальнейшего совершенствования терапевтических средств направленных на лечение СПИД необходимо понять механизм возникновения мутантикх форм HIV и их отличия от дикого типа вируса. Иятерсс представляет также сравнение между собой различных мутантных форм и возможность оценки их перекрестной усгоГтпюстн к действию разлшнш шпйггороа

füGoxii сосл-ой,и в сравнительной характеристике 20 рахгеппмх мутантши форн ьданикаютоа в результате инпибнгорной терапия in vivo и in vitro, и дикого типа Ш7-1 протекназд а также в построении эмпирической модели позполяюшеи оценивать хинеттескис про&туи^стса различных ыутастпих форм по отношению друг к другу и к дикому типу HIV-1 протсиаазы с присутствии различи« ингабитороа

Научная новюиа а практическая значимость роботи. Кинетически охарактеризованы 20 мутштая ■ форм НГ/-1 лротеииазы Определены константы 1Шп(5ировашш этих иутавтшк форм питью различными шгиЕжтораьш (А77003, KNI272, АВТ538, L735,524, Ro31-8959), три последних ингибитора успешно прошли вое стадии клинических испытаний. Введена новая Эмпирическая характеристика цутаитных форм -витальность (КД с т, позволяющая осуществлять

предварительную оценку оффектиигости дейзтши шгнбигора па мутантше формы HJV-1 протеин азы, а так же даюидо возможность предсказывать пжащвдлшые мутации при антипротешшной термсяс

Ап)цн>лцш1 работы. Материалы днзоертаищи докладизались ва IV Международном cinavwijyiw na вопросам шфушеш устойчизооя a Сардшпя (Ипивк}, 1995 г, и на IV Сшшэзцуне го вопросам вирусной устойчивости, г. Ашялэзаа: (Q1IAX 1995 г.

OSvk и структура работы. Диссертация общим объёмом страниц состоит ю введения, обзора литературы (посвящен мутантным формам HIV-1 протеин азы и сё ингибиторам), обсуждения результатов, экспериментальной части и вшодоа Она содержит 10 таблиц, 29 рисунков и.список цитируемой литературы ( ссылок).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1, Выделение и очистка IJTV-1 п?огеннсяы и ос мутанта их форм.

Рехомбинантную протеин азу HIV-1 получали экспрессией, в E.coli в фурме тггсец гклюпент Для солыобилизация протейная* го теляд включения использовалась гсетракция 8М раствором вючевины. Дальвсйгаал очистка достигалась в одну стадию шиопообмепвой хроматографией па Q-Scpharow Fast Flow. После диализа чистота ¡слученного <$ериснта для бЬлышшства мутантов и дикого типа прогеиназы оославляла ¡е меаш 90%. Из 1 л культуралшой среда получали 3-10 мг очищенного фермента.

2. Условия эксперименте.

Определение кинетических консгапт гидролгеа флзоороттнного субстрата Lyn-\!a-Arg-Val-iyr-Nph-Glu-Ala-Nl9-NH2 HIV-1 прстешазой и её иутаятными <$орками 1тюгодигось при 37°С и рН 6.2 в присутствии 1.25М (MLtbSCXe. Кинетические кршыс JHJ3I подучены с использованием слехтрофжюримстра Aminco Вомтпи>-2 (SIM Instruments, Lic.). Начальные скорости гидролша, определялись по уравнениях

Vo=ÍS/(F100%-F0%)]-[AF/At]

Где Vo — началжая скорость реакции S-начэльная концентрация субстрата ?юои и Fo>h- фяооресцекция полностыо расаргоезного и нерасщепленното субстрата хютестстеопго; £AF/At] - начальная скорость реакции в единицах флюоресценции.

К« к Vm„ «фсдсяапхь по уравнению Михаэтежа-Мсатет с шшиовзлш крограьазы Enzfiter/вераш 1.05/. Для рассчета 'шщрщафщ активного фершя: определяли титрованием прочно связншшщикися шлгботораки Ro31-8959, A770Q3.

прочно оаязашюноисн ингишгорсш определяли, испол^ул штематшесг— модель, опналлеиук! уравнением Моррисона:

Y=V0/^Et({[K1(l+S/K^)fH-It-Et]'í+4K1(l+S/iífn)Et} ^-[^(H-S./K^)-^!^^}) Где V » V, начальные скорости, реакции в ¡рнсгутствнс и отсугсггак

. Т' ■

ингибитора, К,- константа Михазлиса-Мептен, á S, Ej к t • ,к0кц«праща субстрата, активного фермента и ингибитора, ссютветстоепно.

3. Влияние рЫи ионной силы на юшршчссккс констант HTV протоаши.

Данные-о зависимости кинетических констант HIV-1 протеиназы от рН и bejheoíí силы весьма противоречивы. Так было показано, что рН влияет только па кса (Billich et al.), только на К„ (Richards et al.), или na оба параметра (Ido et al., Polgar el d. ) При этом большинство исследований было проведено или с наюльтозашген ' широкого интервала рН при одном фиксированном значении шиной сиш или Еарьиросалос» ииченмг ионной силы, а величина рН' оставалась неизменной. С • целш систематизировать имеющиеся дашие вами бши щучена зависимость кшетгаедак констант гадролша KARVYNphEANbNHj и KARVYNpbQANleNIIj диким «том HIV-1 протеиназы в широком интервале рН 3.0-7,0 при доух фженровашшх значениях гошюн силы умеренной - 0.2М NaC¡ и высокой - 1.25М (NtL^SO*

ч

Рисунок 1. График зависимости Ки (а), кса (б) и kcJ К^, (iy тдрошш

KARVYNphEANJeMîi HJV-l лротриказон з условиях yiwípeimoft и высокой mmioii сппи

Полученные данные представлены на рисунках 1(а-в) и 2

¡íowrairra Михаэлиса для субстрата KARVLNphEANleNIfc практически не

зависит от рН в интервале 3.5-6.0 и начинает медлешо возрастать при рН>б.5 яри

высокой ионной силе (рис. la). При умеренной ионной силе Km начинает возрастать при

более кислых рН4.5-5.0, увеличиваясь скачкообразно при рН 6.0. рН-Зашкавюсть '/гс* н

ксл!К*, имеет куполообразную форму при обеих ионных силах (рис. 16,t¡), чта вероятно,

связано с ионизацией карбоксильных групп двух остатков Asp активного центра. В

настоящее время общепринятым является мнение, что увеличение ионной силы приводит

т

к возрастанию активности HJV протеииазы (Ido et al., Polgar et al., Richards et al. ). Наши результаты показали что зависимость активности H1V-1 протенпазы от рН носит комплексный характер. Так при гидролизе KAR^LNphEANláNHj протеолитшескал константа kctfiím практически ве зависит от значения ионной силы гри рН 4.S (рисунок 1а). При значещек рВ»4.5 активность протсиназы возрастает с возрастанием ионной силы Наибольшее различие достигается при рН 6.0. При этом значении рН при высокой ионной аше наблюдается опгицум активности, в то вреш как при умеренной ионной силе протешаза сохраняет несколько процзятов от максимальной активаосги В то же время при рН<4.5 наблюдается обратная картина: активность протеииазы уменьшается с увеличением ионной силы Таким образец, при переходе от умеренной к высокой йодной ame наблюдается сдвиг- шпщуда активности в область щелочных рН.

Остаток Olu в положении Pj является наиболее часто встречающимся для субстратов HIV-1 протешшэч расщепляемая связь которых содержит два гидрофобных

члгат;"а (Dizrai et :d. ). Полутотя» nasit в условиях уверенной даотой сипи 4С9-гдагагага п абсолютной пвл)гшпс лрстеолнппесхон коисгаптн h^fK,, для едеплтокп субстратов, имеющих единственное различие б положен!« Р»° - (Glu ига Gin) - лото демонстр'.фует лрепотштетьлость легко ионизируемой Glu и полосни« Р3 - рисунок Ь и 2.

"ncyirort 2. Застаг.тости ¿-„.уК« гщролва ICARVYNphQANlelffli диким типом. HIV-1 протегаазн от рН.

. 4. Сровшггелькое тучеим» ютепиеских параметров «утаяшк ^оум 1UV-1

проте:а:аил.

Высокая скорость репликацш вируса имуинодефицита человека (Coffin et al. 1995 ), ( продолжительный период болезни. а также относительно токая точность работы вирусной обратной трансктвтиы (1 ошибка на 10000 пар оснований) (Ji et aj. 1992 ), создают предпосылки для сисокон вариабельности геном вируса. В настоящее время известии жгонесгтособньк варианты WT IIIV-I протеиназц одиночные или кратные, содержащие зажни в 77 ;о 99 анзпкнаглотвых остатков. Некоторые ю

этих вариантов могут стать доминирующими мутациями е результате селективного отбора в присутствии различных ингибиторов.

Нами было экспрсссированно, выделено и очищено 20 различных одиночных н кратных мутантных форм HIV-1 протеиназц, найденных in vivo или in vitro при .юлолыодашш ингибиторов KNI272. АВТ538, А77003, Roj 1-8939, включающих как ряд мутаций внутри активного центра (R8Q; V32I; V82A,F,I; I84V и их смешанные производные) так и несколько мутаций не затрагивающих активный центр (M46FJ; V77I; L9UM). Мы поставили своей задач«'! исследовать возможную зависимость между кинетическими свойствами мутантных форм и их появлением при применении ингибиторов.

■iЛ Влияние мутаций не каталитическую активность H1V-1 прогеинат

Значения кинетических. констант гидролиза флюорогашого субстрата l.ysAlaArgValTyT-NphGluAlaNleNH2 WT HIV-1 протеиназы и ее мутантнчми формами приведены в таблице L

Протеолнгическин коэффициент для всех мутантов, за искточением

V321/V82Í, убывает по сравнению с диким типом в 1.2-14.8 раза. Основной вклад в уменьшение протеолнтичкекого коэффециента вносит увелшение Км (до 9.4 раза для V32I/I84V). Значительно меньшее влияние мутации оказывают на kcit • Для • 8 да 20 мутантов R8Q, V32I, M46I, V82F(T), M46I/I84V, V32I/V82I и .V32W84V значения км практически не отличались от значения ксч для WT, а для 184V была в 1.6 раза выше. Для остальных 11 мутантов ксг1 была в 1.5-3.0 раза ниже, чем для \VT. Слабое влияние нутаций на может иметь веские причини при высокой концентрации

в

субстрата внутри вирусной частицы начальная скорость гидролиза может быть близка к Vmn н не зависеть от К^. Количество молекул Gag-полибека (Р55й*е+ Р1бОч,8р0') на вирусную частицу приблилггельно равно 2800. Предполагая, что рад(гус вирусной частицы равен 50 нм, концентрация Gag-полибелка будет блшка к 10 мМ (Giilnik el al 1995). . В таких условиях км может быть главным параметром определяющим Эффективность протеилязы по расщеплению субстрата, принимав что K„«10 мМ. Следует заметить, что мы не располагаем информацией о величине Ко в условиях ín vivo.

Таблица 1. Кинетические константы дикого типа и мутантов HTV-1 протенназы.

Протеина» . ■ K„ м«М к,.» с"1 k..VK_,miclVt1»c"1

WT 3.7(1.0) 42.3(1.0) 11.4(1.0)

R80 15.5(4.» 39.8 (0.94) 2,6 (0.23)

V32I 3.7 CI O) 35,3 (0.83) 9.5 (0,831

M46F 2 3(0.6) 23.4 (0.55) 10.2(0.85)

M46I 9.3(2 51 47.3(1.1") 5.2(0.46)

V77I 4.4 (1.2) 19.2(0.46) 4.4 (0.38)

V82A -7.1(1.9) Sí.6(0 46) 2.8 (0.25)

V82F 14.3 (4.0) 44.0 (1.0) 3.0(0.25)

V82I 7.1 П.9) 24.0 (0.6) 3.4 (0.30)

V8ÍT 5.9(1.6) 34.5 (0.S2) 5.S (0.51) '

I84V 17,1 (4.61 68.0(1.6) 4.0(0.35)

L90M 4.0(1.1) ■ 29.6 (С) 7.4(0.65)

M46F/V82A 3.0 (0 8) 16.4(0,39) 5.5 (0.48)

M461/VS2F 4.6(1.3) 31.5(0,74) 7.0(0.6!)

M46M84V 21.2 (5.7V 40.0 ("0.951 1,9(0.17)

V32I,V82I 2,0 (0.5) 36.0(0.85) . 18,0 (1.5&)

V32M84V 34,8(9 4) 52.0 (1,24) 1.5 (0,13)

V32F(184V : 13.0(3.6) 23.3(0,55) 1.8(0.16)

V82Trt84V 21.2(65; 18.9(0.44) 0.78(0.0'')

V32I<'M46L'T84V 5.7 (1.5) : 31.0 (0.731 5.4 (0.47)

V321/K45I/F53U A71VnS4V,'LSSM . 20.0(5.4) 15.3(0.36) 0.77 (0.07)

В таблице дшеий тип протепнагц обоивчев клк WT. Для панмелогаши мутаито» ис»юлыогава следующее обозиаченпв: пергая букга ооотктгеиует амгеюпктюте » диком типа, п»>ра -тложоюло v лосладоителикхли, последив {Tyirea - *лшаскиомте аз которую преюопия имгаа, Огвощевие констант мутмгт» и дикого типа приодет > скобках.

43 Bjiíüímsc мутаций на (змшшаинс штбэториц.

Заачешю консгапт ивтбировапкя 20 мугагп-ных форм и дикого типа IÍIV-1 протешаэы шгыо ишмбкторами KNI272, А77003, АВТ538, L735.524, Р„о31-8959 прс.дстпвленк в таблице 2.

Таблица 2. Константы ш.тиЗпрзваиш: WT и мутантов IIIVl протешюлх jDinrSirrosaiwi KNI272, А77003, ЛВТ538, L-735,524, Ru31-8959.

tlyoTeraioMí KNI272 A77003 ABT538 L735.524 Ro3t-8S59

WT 9. 8ílM 1.0 8.!nM 1.0 9.3лМ 1.0 З.бпМ 1.0 7.0nM 1.0

R 80 3.2 165 23.1 8.2 4.3

V32I 53 16.4 3.4 S.0 1.6

M46F 14 22 0 5 4.7 0.8

MA6I 6.5 4.8 /J) 4.3 3.6

V77T 1.0 2.7 2.1 4.1 1.2

V82A 5 2 14.3 10.4 21.6 3.7

V82F 0.4 20.0 23.5 84.7 0.7

V82I 1.8 23,5 1.5 6.9 2.6

VS2T 5.4 32.8 20.7 36.9 2.1

I84V 32.0 9.1 . C.7 10.0 S.8

L90M 0.9 8.5 1.9 4.9 3.7

Í.Í46P/V82A 2.7 12.B 6,8 17 S 2.1

M46I/V82F 0.9 7.0 2.(5 6S> i.O

M4t>W84V 29.0 19.4 9.4 21.5 V.Í

V32I/V82I 5.0 19.5 2.7 3.0 1.1

V32M84V 15C.0 108.0 63.Í 80.3

VS2F.184V 7.3 763 201.7 ¡23.8 6.7

V82T/I84V ¡32.6 1853 129.0 130.0 32.1

V32I/M46M84V 3.3 4,! 1.3 2.P 1.0

V321/K45I/F53L/ A7)Vfl84V/L89M 258.0 170.0 43.7 14.С

Жнряын шрифтом юиелеан тачошт дял wyiairros обшружешшк in vitra шш irs vivo. Курсююм irax&taau зютааш дгл мутазтов ве в&йдсшак в чистсм виде, во ведущих к сккм cocías« fctyramoi ииблюдяющтчл » urrmí вэдз шш «хвдяще с состаи уеамво сущхтгуювщх. Норшльтш шрифтом шшю; знак-щи К, вгутааггоя ве вандсших в пржутсгени данного шгыйигорз. ' ■

Как видно ю таблицы 2 дня KNÍ272 основной вклад в увеличение консганты инг«5ироваиоия вносит V32I и 184V, которые юкдат К, в 5.3 и 32.0 большую чем WT соответствеццо. двойного мутанта V32I/184V в 156 раз выше чем .для \VT. Для А77003 принципиальное значение имеют нутации R8Q, V32I, V82A, V82I, V82T и их

лявампмг прошвоянкг, Мапсппалнюе увеличение К сшивают 1№3 (165 раз) я дюшоЛ мутант УЗ'ШШУ (135.2 раза).' Для соединения АВТ538 особенно гажии мугядп: н положении 82 (А,!7) ц в несколько меньшей степени 134У; нмпмсшую устотлл;ость цюлапглт двойной г.г/тапт У82Р/184\' с К; в 201.7 раза выше чей для \УТ. ДллЬ-735,52'1 основной вхлад в усслтетя К; вносят мутации в положении 82 (А,Р,Т) и их смешанные производные \/82РЯ54\'( VZ2Tll?ЛV, которые имеют константы иятбнровагаи в 123.8 и 130.0 раз большие пел \УТ соответственно. Для 11оЗ]-89'9 пи одна одиночных мутаций не оказывала 'заметного влияния на ЕС; 1:11560 усто<г,Е1гм к действо зтого кппклггора оказался двойной мутант \/82Т/184\/, К, п 32 рата Сол,иге _ чем для \УТ. Изменение констапт ингнбированил для разлит« коибипацт! мутшпчвпгкмггор может быть объяснено исходи ¡а различной структуры штбиторов, а также ш спгшфпеааЕх структурных шменелш вшиваемых мутациями п различных участках кармана свгаипания акппзпогб центра фермента. Напри,кр, в случае А77003 важную роль ирает также злекторостатичессое язаишдеГкггвле мезду пиридиновыми кольцами ингибитора в галожсшшх Рз и Ра и Лщ8/10В* \УТ протегагазь/ (Кгр1сп е! а1. 1994, Но а1. 1994). Для ПВО-мутанта замена полояаггелшо заряженного арпшшья на более короткий и нейтральный глкуташш приводит к потере электростатшеского контакта с лирнцивовымн коледами ннгибитора, что приводит к увелшеюпо К, в 165 раз. КМ272 и КоЗ 1-8959 не имеют иисама груш в шгюжетш Рэ, а группы, находящиеся в положении Р3 ориентированны таким образец что не

• " Нумерация ocrs.7r.os в протягано Еедетсг лет пер пай суЛедишдо от 1 до 99. для второй от 101 до 199.

контактируют с Arg8. Как следствие замена аргинина 8 на глкггамин не приводит к значительным шмекениям в константах ингибирования для этих ингибиторов.

42 Витальность мутпнтньк формШУ-1 аротошазы

Уменьшение чувствительности мутанта к действию ингибитора может быть описано через отношение констант ингибироваши мутанта и WT. Однако зто отношение отражает только часть реальной картины селективного отбора мутантов под действием ингибиторов. Для того, чтобы вирус .мог существовать, мутантный фермент, помимо пониженной чувешггельности к ингибитору, должен обладать определенным минимальным уровнем активности Протеолигшеская эффективность фермента описывается через отвошение Если предположить, что активность WT

HIV-1 протеиназы оптимальна для вирусу, любое уменьшение ^/Кщ приведет к понижению жизнеспособности вируса. Из двух мутавтных " форм с одинаково уменьшенной чувствительностью к ингибитору (К,) больший шанс появиться в результате селективного отбора при действии этого ингибитора на вирус имеет та, у которой выше каталитическая эффективность (¿wKe). Для сравнения селектшного преимуществ различных мутантов, в присутствии определенною ингибитора с WT и друг с другом мы ввели новую величину - витальность (vita), описываемую уравнением:

В таблице, 3 представлении рассчитанные значения витальности для 20 lO'TajmibK форм HIV-1 протеиназы в присутствие 5 различных ншибт-ороа

Тебящл 3. Витальность (\т1я) мутантов ШУ1 протсгежм.

Протеши за кта272 А7700Э АВТ538 1,735,52А Ко31-8959

\УТ 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

Р80 0.7 38.0 5,3 1.9 1.0

УЗ 21 АА 13.6 - 2.8 6.6 ' 13

М46К ' 1.2 1.9 0.5 4.0 0.7

М461 ' 3.0 22 0.9 2.0 1.7

УТ,1 0.4 1.0 0« 1.6 0.5

У82А 1.3 3.6 2.6 5.4 0.9

У82И 0.1 5.2 6.1 22.0 0.2

У821 0.6 7.0 0.5 2.1 0.8

У82Т . 2.8 16.7 10.5 18.8 1.1

134У 11.2 3,2 2.4 3.5 2.0

Ь90М 0.6 5,5 1.2 3.2 2.4

1.3 62 3.3 8.6 1.0

илытг? 0.53 4.3 1.6 42 0.6

М461Л84У 4.9 3.3 1.6 3.7 0.8

У321/У821 9.4 30.8 4.3 4.7 1.8

\'32Ш4У 203 14.4 5.3 10.4 1$

12 12.2 32 3 19.8 /./

У82ТЛ84У . 9.0 13.0 8.8 9.1 22

У3217М461Л84"/ 1.6 2.1 0.6 1.4 0.5

У321.1'.45№5?Ь/ 18.1 11.9 3.0 3.9 1.0

Вкгагавост» ОТ ЮТ-1 пртеизаш яргаагг» м 1. Обозначение авалогтлно таблице 2.

При действии определенного ингибитора на вирус больший шанс поститься в результате селекции имеет та мутантная форма для которой индекс витальности выше. Например, для К№272, согласно нашим данный наиболее предпочтительными являются мутации 184У,У321Л84УиУ321/К45№53Ь/А71У/184У/Ъ89М

4.4 Соотношение индекса витальности н вероотости появления мутвмгимх форм НГУ-1 нротеиназы при действии ингибиторов тШто.

Величина индекса витальности коррелирует с экспериментальными данными по селекции мутантных форм НГУ-1 протеиназы в присутствии ингибиторов Например, при действии 0.33 мкМ КМ272 на культуру вируса ЬА-1 появляются одиночные мутации

V32I и I84V. Уселтешк коццеатращм Еаге&ггора до 0,5 ыкМ приводит к доминированию дгхншого «мутанта V32W64V (Anderson et с!. 1994). При ксхщецтрации ингибитора 8 ыкМ генерируются кратка ьгутацк; одна ш которых V32I/K45I/F53L/A71V/I84V/L89M (Anderson & Mitsuya 1995). Все зга мутаптпые фортал имеют относительно высокие индексы vitality - 4.4 (V32I), 11.2 (IS4V), 20.3 (V32I/IB4V) и 18.1 (V32I/K451/F53L/A71V/184V/L89M). Для срашшши, ыутаитншз фрш ¡шхогда из наблюдающиеся при действии KNI272 - R8Q, M46F, V77I, У82(АД1), L90M ¡екют иадекс витальности шггераале 0.1-1.3. Для ингибитора А77003 R8Q яшксгся наиболее часго встречающейся ьгутацией как в качестве одшочпой так и в виде кратких мутаций (Но et al. 1994, Kilian et al. 1994). Индекс иттальцосги для этого кутмпи имеет 1шшысшее значение -38 (таблице 3}. Две другш цутацга! V32I и V82I также встречающиеся при действии данного гшпгоятора «а вирус (Kiäplaa et al. 1994) толк имеют относительно высокие шдексы шпаялхости - 13.6 (V32I) и 7,0 (VS2I). Для двойного мутанта V32I/V82I индекс витальности достигает велзкшш 30.8. Среди мутантов, обнаруженных при истльзовании linnsSiiiopa АВТ538 in vitro и in vivo иа1более часто ветре чается штив V32F1S4V (Markovvitz et til. 1995). Эю хорошо коррелирует с подученными нами дашшшс' индекс шггалыюстп для V32F/134'V составляет 32.3, это второе по абсолютной ьелзишге значение в таблице 3. По отдельности V82F и I84V также обладают относитега,по высокими индексами витальности 6.1 (V82F) и 2.4 (I84V). Вместе с тем юзестно, что первым продуктом селективного отбора in vitro для АВТ538 валяется I84V (Markowitz et al. 1995);

увеличкля хомотграции ишнбнгора в среде приводит к селекции друп« Myiaimii, преимущественно кратких, во имеющих в своём составе I84V (Markowitz el. al. 1995).

По-нидимсму динамка возникновения и трансформации мутаций, возникающие в результате селястнзвого отбора, такова, что первыми появляются мутации о относительно невысокими индексами витальности, но обладающие достаточно шюокой каталитической активностью (>30% WT) - K4V. Следующим шагом является отбор кратных мутаатоа с исключительно высокой устойчивостью (К^/К^) и относительно невысокой актишосгш (<15% WT). В основном это мутации затрагивающие активный центр остатки в пэло-кениях 32,82,84. Примером такого рода мутаций являются V32I/I84V, V82F/1844, V8ZT/I84V. Последяей стадией селективного отбора, гю-видимиму, является гоявлеяие мутантов несущих помиш мутаций аминокислотных остатков активного центра (R8, V32, <348,150, V82,184) многочисленные и разнообразные мутации лежащие вне активного центра (ЫО, L24, М46, L63, А71, L90), выполняющие функцию как компенсаторных*, так и повышающих устойчивость. Такие мут.янтнье формы обладают высокой устойчивостью к действию инпйитора, послужившего основой селекция Сгкдует отмгппъ также, что каталитическая эффективность иижет. контролироваться как когтгнсаторныки мутациями внутри гена протеннази так и нутациями в субстрате протешазы gag-poi гаипгбелке (Lemcrre eL al. персональное сообгцегнк) и в рсгуллторних участках, повышающих экспрессию (Erickson 1995).

' " Под коЕШЕпсаторпыма иы гошваеа иутацни приводящие в комплексе с другими иутапяжм с улучшению каталитической эф$ектшнгасгн феркеята.

Корреляция между величиной гадекса юггалшости и погалжисм цутапта в экспериментах in vivo и in vitro проиллгслфнровашш ка' рисупке 3 Для каждого ингибитора все аутаитные формы были разделены на три группа В первую группу били включены мутанты, которые никогда ис наблюдались в присутствии данного niiné'irropa (нормальный шрифт в таблиице 3). Вторая группа включала в себя мутанты найдениью как сами по себе (жирный шрифт в таблице % так и несущие в себе часть реально сущгствующих (курсив в таблице 3). В третью группу юшш мутанты реально наблюдавшиеся для данного гашбитора (жирный шрифт в таблице Э В зависимости от ингибитора среднее значение для гру)ггы 2 было в 1.5-3.3 а для группы 3 в 2.5-11.1 раза выше чем для группы 1. Ингибиторы, шгацне вшзетв средт« значения витальности для первой группы ягляются чувстшгельиыш к тппаялышы изменениям структуры протешшы Примером такого рода ияпйиторов является А77003. Высокие значения витальности для мутантов второй группы являются указателем того, что ишлбитор не эффективен в присутствии широкий группы кратных мутаций** 1,735,524 Низкие значения для групп 1,2 . /шляются -костшим признаком "унтг^шшносги" иштйггора. Значения третьей группы показывают насколько ^ффектниен шшбшор по отношению мутации возникающих в его присутствии

Ишшн с.'шмш! кратаому мутанту достаточно содержа!» хотя бы одну муташво у.точшую к дчьниму imriroiiTopy, чтобы весь кутает в цйлом обладал пкоп >лонччвоеггью.

KNS272

а Я

V* Л77003 &

! в>

в

0 АВТ538

$

■8 а

Я 3

1735,524 " ¡SS3

■Ro31-8359 a "23

выводы

1 Изучена зависимость кинетических коасгагг гидролиза НГ\М протеиназой флюорогеняого субстрата КАКУУЫрЬЕАМвИНз от рН и ионной силы раствора. Показано, что зависимость имеет кодоксный характер. При рН<4.5 активность протеиназы убывает, при рН=4.5 практичоски но зависит, & 1фи рЕ>4.5 возрастает с увеличением ионной силы

Изучены кинетические параметры гидролиза флюорошшоп) субстрата КАР-УтарЬЕЛТЯеШЬ 20 нугантвыми формами и дш тишм ШУ-1 г;щгннази Показано, что уменьшение активаостк ьгутантпьк форм протедпаза грокссодоя пренмуицсхггвснно за счет увеличения К«, о то время как шигвя&тся нкшмительно. Рассчитанная концентрация и 88£?ро] гюлибежоа сцутри юфтала ахлавляет 10 мМ. В этак уешвиях скорость расщегогаии субстрата, боязэждо, близка к V«,,,!! независит от К«,.

3. Определены константы инпйирования 20 иутаитких форм и-дикого типа НОМ протеиназы пятью различными шпйкгораки (4 из них находятся на раиггвгак стад»«« клинических испытании!. Все мутанты (кратные и одиночные) актшлого центра продемонстрировали высокий уровень перекрёстной устойчивости к действию различиях шниРтирии. *** исключена нги Ив31 8^9, доторнь еюхрапягт овокг* октава оста я» питии иию практщоспа* вев* мутаций мел юного центра.

18

югабкгороя, и исключением Ro31-8959, который сохраняет свою эффективность по оп:о!ч; :гзо практически все* мутаций активного центра.

4. Селективное пренмутчмгп» мутанта по сравнению с диким типом в nptsr.yrcrci!s ингибитора, тажет бш» опнсапо через изменсиич константы связывания и южаевив каталитическом Эффективности мутанта. Дли сраинсния »»жду шбой различных мутантнш форм HTV-1 протеиказы. возникающих в результате селективного отбора. Еведеяа повая Эйпкрнчссжая величина витальность (vita), описываемая уравнением vitaKK^™/K^)MynOT/(K^cn/K«)wT-

В бэлыпкЕспя случаев наблюдается корреляция между величиной 'BírranMiocm" и гадпатажем мутаята в присутствии данного икпмбкгора.

Полученный набор путавших форм HIV-1 протснказы и представленная кинетическая sюде(ш иогуг быть жгюльзованы д/и начального схриштга иигибнгоров протепназн с целью выявления препаратов, сохраняющих активность в отношении широкого спектра мутантов.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор благодарит Beishan Liu за предоставлена плззкнд для Экспресса'! протсиаазн Алену Гущину .••а существенную помощь в взделекки и очистке щатгтази н её мутантных форм Pavel Majer за синтез флюорогенного субстрата для киаепкеоа« исследований, а также T.N. Bhat, Betty Yu и МтЕпскзоаза «злела» дискуссии

N

1 Sergei V (Mnik, I>eonid 1. Suvorov. Bei&han Liu, Betty Yu, Bary Anderson, Hiroski Mitsuya, uikI JoiiIi W. Erickson. Kinetic Characterization end Cross-Resistance Patterns of HIV-1 Protease Mutimts Selected under Drug Pressure Biochemistry, 34(29), 9282-9287,1995.

2. J V.N. Vara Pas ad, Elizabeth A. Lunney, Donna Ferguson, Peter J. Tummino, J. Ronald Rubin, Eric L. Reyaer, Barbara H. Stewart, Robert J. Quttendorf, John M. Domagala, Leonid I Sirvorov. Sergei V. Gulnik, Igor A. Topol, T.N. Bhat and Jonh Erieksoa. HIV Protease Ishibitore Prossessing a Novel, High-Affinity, and Achiral Pi'/Pj' Ligand with a Unique Patter of in Vitro Resistance. Impotance of a Conformationally-Restricted Template in Design ofEnzime inhibitors. J. Am. Chem. Soc., 117(45), 11070-11074,1995.

3. Hongmei Mo, Martin Markowitz, Pavel Majer, Stanley K. Eurt, Sergei V. Oulnik, Leonard 1. Suvorov. John Erickaon, and David D. Ho. Design, Synthesis, and Resistance Patterns of MP 134 and MP167, Two Novel Inhibitors of HIV Type Protease. J. AIDS Research, , 12(1), 55-C1,

1996.

____Участок множительной техники ОНЦ РАМН

Подп. к печати \92.96 Заказ 23- Тира« 400 экз.