Стабилизирующий эффект полианионов и анионных ПАВ на промежуточные продукты катализируемого пероксидазой окисления бензидинов и его использование в мембранном иммуноферментном анализе тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

Московский ордена Ленина, ордена Октябрьской Рзволшии и ордена Трудового Красного Знамени государственный университет имени М.В. Ломоносова

Химический факультет

на правах рукописи УДК 576.8.077+543.426

ВДИМИРСКйЯ Евгения Анатольевна СТАБЙЛИЗЙРУИШК ЭФФЕКТ ПОЛИДНИОБОВ И АШОНКЬЕ ПАВ НА ПРОМЩУТОЧШЗ

продукты кагажзируэюго лероксидавои окисжда взввдшнов и его использование 3 мшбраеноы имунсяегшготш анализе

(03.00.15 - химическая кинетика н каталяз}

Автореферат диссертации на соискание ученой степзая кааддата имическкх наук

Москва - 1993

/'. >0^ / / '-/г//^

Работа вшйдненз на кафеетз химической экзимолопга Химического факультета

Научные рушвоякт&ли: доктор (5еологечэских кзук Егоров A.M.

кандидат биологических наук Гавриловз Е.М.

Официальные ошонэнты: доктор шмяческих наук СавищЕй А.П. кандидат химических наук Еурочкин И.Н.

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт гнстаримзяталькой кардиологии кардиологического научного центра РАМН

Защита диссертации состоится _1933 г.

в час, на ззгвданш специализированного совета Д.053.05.76

в Московском Государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: П98ЭЭ, ГСП, т.Москва, Ленинские горы МГУ, Химический факультет, кафедра ' ззшчаской знзимологии, ауд. 202.

' С диссертаций мокно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан "_"____1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат хвмических наук / ' О.ХГ Кост

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одам из перспективных поправления развития тмунофвркентного анализа (ИФА) биологически активных соединений является разработка методов на основа мембранных носителей. Это позволяет существенно упростить процедуру анализа, сократить его время, а также дает возможность проводить детекцию ферментной метки как инструментально, так и визуально. Фериент, используемая з качестве метки долкен обладать шсоксЗ агмзвостью и катализировать реакцию, дэвдуп окраинный к малорзегаорижй продукт. Зтнм требованиям удовлетворяет, в частности, пероксидаза из корней хрэна (ПК). Однако лишь нэкоторне из нзззетннз субстратов ПХ дают верастЕэргаый продукт окисления к мсгут бить использованы в мембранном МФА, отечем, чувствительность суяествухжд методик часто недостаточна для детектирования гребуеннг сэеданзЕйй:. Поэтому, поиск новнх пасоко чувствительных систем детекции является актуальной задачей.

Существенной проблемой: ИМ является спещйЕчзость используемых антител. Одно ез рэшениЯ этой проблемы состоит в яспользозаши да иммунизации жизотюх коютгзгз гормон - Соло::-Еожель, имеющего достаточно высокое соотношение горлои/балек. В судествуладах методах синтеза это достигается за счет нерационального увеличения избытка исходного горюпа над белком, нро?ге того рэакщя проводится в водно-оргэнцчесяс; сг.;осях, что moss г привадит s частичной денатурации. Селкз. Поэтому актуальной является разработка зоных подходов к синтезу стерозднкх коньюгагов, поззавгших сузестБанно упростить саму методику и более экономично использовать реагенты.

Цель работы. Среда субстратов Ш, латах окргиенаке продукт» окисления, ванауя rpynrrj' составляют замененные бенздЕявы. Известно, что их окисление идет lepss цромэауточные каткок-радикальные и/или мерихиноидные частицы, обладающие высокой степенью делокаля-гишт электронов к, как следствие, иптексиваой акрастой. Как правило эти частицы мало стгбклькы и быстро преьрацашея в менее окрашенные конечные продукта окисления. Очевидно. чзо один из возможных путей повыэешя чувствительности детвктЕрущих систем - это поиск уелош2, з когорйх реакция останавливали» бы на образовании промежуточных частед, что и являлось целью давкой работы.

Логично было предполагать, что катионвые промекуточные частник можно стабилизировать в присутствии отрицательно заряженных полигонов. Гюзтому в работе изучалось влияние отрицательно заряженных полиэ^ктрсли-гов и анионных поверхностноактивных вешеств (ПАБ) на катализируемое ПХ окисление соединений бензшинового ряда с целью разработки высоко чувствительны! систем детекция для мембранного КФА. нз основе возмогши эффектов стабилизации.

Другим асде:схс:,5 работы была разработка метода синтеза конъю-гата протестерон-ЗСА в обращенных мицеллах ЛОТ в октане.

Научная новизна работы. Проведено систематическое исследование катализируемого ИХ окисления замещенных бевзидшов в присутствии отрицательно зарякзнннх лолиэлектролигов и аиионных ПАВ в гомогенных и гетерогенных условиях. Показано, что введение в реакционную систему зт5п соединенна приводит к стабилизации шггэесиеео окраяенных промежуточных продуктов окисления диаминов. Этот эффект объяснен электростатическим взаимодействуем катионнях форы данных промежуточных соединений с адсорбированными на мембранах поязаш:-онамн млн юцелкака анионных ПАВ в растворе.

Осуществлен сэнтез коньигатз орогестерон-БСА в среде обращенных шщелл АОТ' в октане.

Научная и практическая значимость. Найден способ стабилизации промежуточное частац реакций окисления зашцавЕнх бензидянсз б присутствии Ж.

Разработана нвтодика синтеза конъюгата Прагесгерон-БСА в обращенных юцеялаг АОТ в октане, обладающая рядом преимуществ то сравнению с традиционными методиками.

Предложен новей, осЕованннй на э^кте стабилизация промежуточных частиц, вадаант мембранного нммуноферментного анализа прогестерона, позвашЕий быстро и с высокой чувствительностью (1 нг/мл) определять данный гормон.

Адробадия работы. Материалы работы были представлены на VI Всесоюзном сзкшзиуне по инженерной эязимологш (Москва,1991), Международном конгрессе "25 лет шмунофзрментнсй ТсХнологе" (Афины, 1991), Ыевдународном конгрессе "Современная энзкмологкя: проблемы и тенденции развития" (Варна,1991)

Публикация. Ш материалам диссертации опубликовано б печатных работ.

Сруктуоа диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (4 главы), гкспериментальной части, описцвгшей материалы и метош исследования, результатов и их обсужЕеквя (5 глав), выводов, списков цитируемой литературы и сокраззниЯ- Работа изложена на 109 страницах, содершт 33 рисунка и 7 таблиц. Сеисок литературы включает 101 ссылку.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТУ

• 1. ОКШИЖЕ ЗИМаКШХ: ШЩЩОВ Б ПРИСУТСТВУЙ ЛЙССТТРАКСТЛЬЗАТА КаГРйЯ. КАТАЛЙЗКРУЗЮЕ ПЕЮККШЗОИ, КОВАЛВДНО (ДЯЗАйНСН С МЕМБРАННЫМ НОСИТЕЛЕМ В настоящей работе было изучено окисление срло-дяашзидйна (ОД), тетраметилбензидкна (ТМБ), орко-толиднна (ОТ) з бензидкна, катализируемое ИХ, ковалзятно связанной с капроновой кекбраной з присутствия декстрансулъфата натрия (ДС, мол. во с БОСОСО). Было обнаружено, что во всех случаях присутствие полимера приводило к !Ому, что реакция останавливалась аа образовании иженгавзо окра-пенного промежуточного продукта окисления.

Наиболее подробно данный эффект изучался памз на примере пе-роксидазього окисления СД. При окисления ОД в присутствии ЕХ коночным продуктом регкцшт является хелтоксричневоз соединение II, Схема 1. При проведении рзакции в присутствии ДС ноблх-лзлось возникновение интенсивно окрашенных темнозеленых, а не коричневых пятен, что указывает на образование другого продукта окисления в данных условиях. Сопоставление электронных отигсатейьннх спектров поглощения пятен, (рис.1) с известными из литература- спектрами поглощения I и II в растворе показало, что в отсутствие е з присутствии ДС образуется соединения I и II, соответственно.

Из спектров, представленных на рис. 1, шдпо, что для характеристики типа образующегося продукта окисления. удобно воспользоваться соотношением оптических плотностей в максимумах поглощения при 335 и 475 нм, которое мы обозначим как А305/475 • Для выяснения роли заряда ш исследовали влияние нейтрального у. катионнсго декстранов на процесс проявления мембран (рис. 2). Видно, что зйфект наблюдается только в случае анионного декстрака. Для стабилизация I требуется некоторая оптимальная

з

концентрация ДС {рис. 2). Начальный участок данной зависимости можно объяснить возрастанием сорбции ДС на мембране при увеличении его концентрации в растворе. Спад величины -¿335/475 в области

МеО._

ОМе

ОЫе

IfeC

н.

(OMÖb^J

. ЫеСч__ОЫе

I

ОМе

386, 704 nm

Шеи.

Ие< г №i=

Ь КеОч ЖеО,

Olie CMs OMa

II

Схема 1. Схеяэ нгроксидззного окисления о-дианизщщна

высоких жонцэнграций ДС, по-видимому, связан с э£фзктом свикашя поверхностного потенциала в результате роста концентрации цротивс-ионов, что бзло подтверядеЕо снижением А38д/475 ли факсирован-ной концентрации ДС в результате добавления КсГ.

Кы исследовали также влияние других полжшеонов. Если при тех же условиях использовать вместо ДС поливинилсульфат натрия (ПЕС), то наблщэешй эффект вполне аналогичен описанному выше. В этом случае стабилизация наблюдается при более низкой (в рассчете на мономер) хоЕдеетрецзи полаыона, что ыоянэ объяснить более зысокой плотеостьэ заряда в ИБС. по сравнешы с ДС.

В то же время, при использовании полисульфонатов картина меняется. Hai® было изучено влияние на реакпав окисления ОД подастЕролсугьфоЕатов натрия разлитой молекулярной кассы (354000; 4000; 1600 Б), а таете мономера, В случае конокера вообще отсутствовал какой-либо эффект, а в случае полимеров получались очень плохо воспроизводимые результата: иногда стабилизация

'сл. ед.

80 (—

I

ео !-

I

400 500

Рис.1 Элоктгюннае отражательные спектры поглощения продуктов перохскдэзпого окисления- ОД:

1) в присутствии 1СГ3 М ДС,

2) в отсутствие ДС.

Л386/475

^ с, _ 4

2.0 1.5 - V о ^ -

1.0 2

0.5 . -%- 1 1 : 1

О 5 Ю 15 5

[Б], М*10 Рас.2 Зависимость величины А 336/Л75 от кощентрацж добавленного пошмера: 1) ДС; 2) ДЭАЗ - декстргн хлоркд; 3) декстран.

промежуточного продукта наблкдалась, иногда нет.

Если вместо ОД в качестве субстрата для ПХ испшьзозать ТР.Е, СТ клч бензидкн, то в првсутствня ДС ироисподкт оЗрззаЕанЕв нерза-тзоришх продуктов окисления данных, субстратов, ииегетс ектонсиено сижок* окраску. Исследование отражательных спектров, а такхе зависимостей ИЕГвнсиБЕОсти окрашЕв&няя от хоицектрзцда ДС и рК показало, что для ОТ 2 ТШ> яаяболез вероятшш скрйЕенпзгс продуктами окисления являются состветствугаяте ка'жж-рзвжаля. По-видимому, для них роль ДС сводится к осапденшо (иж соосезденж) катаонрого продукта реалгог. 3 аиучгв бензэдша мн имеем качественно такую хе картину, как для ОД.

Различия в поведении субстратов «окно объяснить относительно более высокой отаймьностью каигоя-раджалов К-Е к 0? по сравЕЗШГО с радикалами, образованными из ОД и бензидана. В случае ТМБ причина этого - полное метилирование атомов азота. Лия ОТ возможно играет рель стгр:таекй{ аффект орто-метилглой группы.

На примере ОД нет! былг изучены зарасимости тии продукта от концентрации: штюбонзованного фермента при разлетных концэнтра-циях ДС. Океза^ось, что оптимальная концентрация ДС зависит от концентрации фзрмента: Чш вчпге последняя, тем Солее вксокая концентрация ДС требу ег-ся для получения стабильного соедянения I ряс.З.

.. Ъвв/475

Рис.3 Зависимость величины А 36/475 от концентрации ПХ на мембране в присутствии:

1) Ю^М 1С; 2) КГМ ДС; 3) в отсутствие ДСлрН 4.5).

2.0

—Г°

о

в 2

■j

_j_и

ноль*

*2Ро-15

2. ОКИСЛЕНИЕ ШХИВХШВ БЕНЗЩККОЗОГО РЯДА В ГОМОГЕННЫХ УСЛОВИЯХ В

Для получения промежуточного продукта не в связеееон с мембраной состоянии, а в растворе, что позволило Сы изучить кинзтичес-кие закономерности оисанного выие эффекта, была сделана попытка цровзсти аналогичную реакцию в присутствии ДС но в гоюгенша условиях. Одна.та, в широком интервале' концентраций ДС и фермента реакция не останавливалась на промежуточном сседашенга, а всегда доходила до конца. Это иозет быть связано с тем, что полииояк ДС принимают- в растворе внгявугую хснформащш и не образует достаточно больших гидрофобных участков, на которых могло бы сорбироваться промежуточное соединение. В гетерогенных условиях для этой цела служит гидрофобная капроновая матрица. Ms предположили, что в растворе необходимое сочетание гидрофобной микросрэды с поверхностным потенциал»; маяно получить, если использовать мщеллярную среду, т.е. вместо полимерного ДС использовать анионное ПАВ, например, додецилсульфат нгяркя при концентрациях вше КЕМ.

Наш бала изучена зависимость типа продукта окисления ОД от концентрации ДСН, ряс.4. Оказалось, что при том zs значении рН, что и в случае ДС иа мембранах, имеется диапазон концентраций ДСК, при которых происходи? накопление цромезуточаого продукта и со временем в этих условиях выпадает зеленый осадок.' Спектры соединений, получакЕйхся з отсутствие и з присутствии ДСН полностью соответствуют рассмотренном выше спектра;.! продуктоз, получалдахся при

доюутста додздиоглшта натрмя ;дсю.

а

, Е зав/4 7 5

п 1 1 ] р

).0

в — о

-1_11111

0 12 3 4 5 6

С ДСН 3, К*1СГ3

Рис.4 Зависимость величины А звб/475 от концентрации ДСН при рН 4.5.

д

2^386/475

2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

[ ДСН ], М*10~

Рис.5 Начальный участок зависимости представленной на рис.4.

2.с

окислении ОД в гетерегенных условиях.

Для изучения вопроса о тем, влияет ли ДСН непосредственно на фзрмент, либо только на нефермептативные процессч дальнейшего превращения промегуточного иминошюна, вместо ПХ был использован низкомолекулярный катализатор Ре(111)нопропорф5р2н. При различных концентрациях. ДСП спектры продукта окислений ОД полнос-гыз соответствовали спектру продукта I, схема 1. Гакш образом, можно сделать вывод, что изменение продукта окисления ве связано с возмокеш воздействием ДСН на фержззт, например, игменешек конформацаи его активного центра при ззатаодейетвии ДСН (или ДС) с белковой частью молекулы фзрмента.

Другой подход к изучении влияния ДСН на ферментативную реакцию состоит в сопоставлении кинетических параметров процзсса, найденых в отсутствие и в присутствии ПАВ. Так как коэффициенты экстинкции продуктов I и II в данных условиях не известны, ш были вынуждены ограничиться сопоставлением величин К^ по обои;.; субстратам (диамину и %02), да определения которых не требуется знать абсолютную скорость реакции.

Килетика реакций окисления ОД и Оензздиза исследовалась по начальным скоростям. { Значения К, по Е^О^ и субстрату приведены з табл. 5.

Из приведенных данных видно, что величина К^ не изменяется при проведеЕеи реакции в присутствии ДСН, что тоже позволяет сделать вывод о том, что ПАВ (или полимер) взаимодействуют не с

Таблица 5. Кинетические параметра окисления ОД и 'бензидина перекисью,водорода, катализируемое ПХ, в отсутствие и в присутствии

1 • 10"т1 ДЯ в случае ОД и 2-10"~М ICH в случае бензидина. Условия эксперимента: 25й С, 0.1 М К-штрзтный буфер рн 4.5. Относительная ошибка определения Ку во всех случаях составила + 1

Vм • • Vм

по субстрату по

оубстрат в 0ТСуТСТВие в присутствии в отсутствие в присутствии ДСН ДСН ДСН ДСК

ОД 3-Ю"5 2.4-Ю"5 1.1-10-3 1.25-1Q-3

ОД (Лебедева 1.9-10"5

O.B. И др.1977) , , с _д

бензидин 1.7-10 4 1.8-10 4 8.9-10 ° 1.4-10 4

ферментом, а с окисленной на первой стадии молекулой субстрата.

Дополнительные результаты были получены при использовании алкилсульфонатов натрия. Нами было изучено влияние на реакцию пероксидазЕОГО окисления ОД таких ПАВ, как додецилсульфонат натрия, гексилсульфонат натрия и бутилсульфонат натрия. В случае додецилсульфеяата натрия реакция сильно задергивается на образовании промежуточного соединения, но впоследствие выпадает коричневый осадок. При использовании двух других соединений вообще не наблюдалось никаких эффектов, а в ходе реакции накапливался только конечный продукт II.

Полученные данные позволяют сделать вквод о том, что стабилизирую^ эффект проявляет только мицеллы ПАВ, как - это предполагалось выше.- Действительно, гексилсульфонат и бутилсульфонат при использованных концентрациях яе образуют мицелл и не оказывая? влияния на ход реакции. При рассмотрении данных для ДСН необходимо отметить, что наши эксперт,¡енты проводились в 0.1 М калиа-цитратном буфере. При увеличении концентрации противоионов НКМ снижается . Так, в присутствии 0.1 М KCl, ККМ да

Рис.Б Спектры поглощения продуктов пероксндазного окисления ТМБГ1) в отсутствие ДСН . 2) в присутствии 6-10-оМ ДСН. (рН 4.5)

300

•400

500

ДСН равна 1-7-10 3

натрия на реакции окисления ОД, начиная с его концентрации 3.7-10-2 М, т.е. с заведош более высокой, чем ККМ

\59°пш 700

М . Добавки высокогидрофобных веществ, таких как замещенные бекзиднна, также снижают ККМ. Этим можно объяснить тот факт, что в наших условиях эффект стабилизации промежуточного соединения под действием ДСН начинал проявляться уже при концентрация ПАВ примерно 2- Ю-4 М. Ход кривой с перегибом в области низких концентраций ДСН (рте.6) наглядно шшострирует процесс мицэллообразования с сильно пониженной ККМ (около 2-Ю-4 М). В случае додецилсульфонзта натрия, величина ШШ в воде равна 1.15 -10 М , и при увеличении концентрации противоионов она тоже должна уменьшаться. Нами было изучено влияние додецилсульфоната

разной б этих

условиях. Тот факт, что реакция тем на менее прошла до конца позволяет предо ловить, что стабилизация про;.* е жу точного • цродукта происходит при его вклпчении в поверхностный слой мицеллы, а Ее в гидрофобное ядре, так как существенную роль играет природа головной группа -молекулы ПАВ. Необходимо отметить, что степени диссоциации для додецилсульфоната натрия с для ДСН шею довольно близкие значения (а=0.404 для додецилсульфоната натрия , и а=0.49 для ДСН ) и различив в их поведении нельзя отнести за счет электростатических факторов. Различие в поведении сульфатов и сульфонатов отмечалось также для полимерных систем.

■ Аналогичные исследования влияния ДСН были проЕзденп для ТШ5, бензидкка и ОТ. На рис.6 приведены спектры поглощения продуктов окисления НЯЗ в отсутствие и в присутствии ДСН. Добавление ДСН к раствору, содержащему, продукт окисления ИБ, полученный в

отсутствие j£H, приводило к изменению спектра поглощения, а именно к исчезнозеыш полосы при 460 пш и переходу к спектру продукта, полученного в отсутствие ДСН. "В случае ОД спектр продукта, полученного в отсутствие ДСН не менялся при введении в раствор ПАВ.

Из этих наблюдений можно заключить, что в данном случае ДСН влияет не на тип продукта, а на его состояние в растворе. Спектр продукта реакции в мицеллах очень близок к спектру катион-радикала ТМБ, описанжау в литературе. По-видимому, в водном растворе происходит гашение как микроокруз;ения катион-радикалов, так и их степени ассоциации.

Созершеню аналогичным образом вала себя реакция с ОТ, для которой мояда таюке предположить образование катион-радикала в качестве продуета окисления как в отсутствие, так и в присутствии ДСН.

При окислоеии бензидина, как и ОД, спектр продукта, полученного в отсутствие ДСН не изменялся при его зведении в раствор. Таким образом, в данном случае в отсутствие и б присутствии ПАВ образуются различные продукты. При длительном окислении в обоих случаях выпадал черный осадок, ко при сканировании спектров продукта в ходе реакции в отсутствие ДСН, не нэйщцалось изменения спектра. Поэтому ш не ыокем утверздать, как в случав ОД, что ДСН'" стабилизирует промежуточный продукт окисления бензидина. Спектр продукта, полученного в присутствии ДСН содержит полосы, характерные для кггаок-радикала бензидина. Таким образом, можно заключить, что ДСЯ. являясь анионным ПАВ, стабилизирует катион-радикал, а в отсутствие ДСН, возмсгзо, наблюдается спектр мерихинона.

В то sb время, для орто-фенилендиамина и З.З'-диашно-бензидина при проведении реакции окисления в присутствии ДСН стабилизации-какого-либо промежуточного соединения не наблюдалось. Для этих субстратов, к сожалению, нет точных данных о структуре продуктов окзеления. Иохно предположить, что первично образующиеся катион-рздшшы и/или иминохинондные частицы претерпевают здесь иные превращания, по отношению к которым анионные ПАВ и полианионы не обладают стабилизирующим действием.

В общем, влияние ДСН иа ход пероксидазного окисления в растворе характеризуется теми же закономерностями, что к влияние

ДС на реакции в адсорбированном на мемсране состоянии, однако, исследование в гомогенной системе позволяет дать более полную картину наблюдаемых эффектов.

3. СИНТЕЗ КОНШГАТА ПРОГЕСТЕРОН-БСА В СРЕДЕ С ОБРАЩЕННЫМИ МШЬШШ АОТ В ОКТАНЕ Конъюгаты, используемые для получения антиснвороток должны содержать 20-40 молекул прогестерона на 1 молекулу БСА. Для достикзния требуемого соотношения мовно использовать два подхода: увеличение избытка сгэровда и (или) времени реакции. При использовании обращенных мицелл АОТ появляется еще одна возможность - увеличение объема внутренней полости мицеллы.

Синтез кояъюгата проводился по методу активированного эфира. If-гидроксисукцинимидный: эфир 11а-гидроксипрогестерона получали обычным способом в ДМФА, а стадию конъюгировзния проводили в растворе АОТ в октане, содержащем различные количества воды. Выделение коньигата осуиетвляли осаждением ацетоном. При зтом весь нес-вязэвшийся стеровд оставался в растворо, и для очистки ковъю-гата не требовалось длительного многократного диализа, необходимого при традиционной методике.

Внутренний радиус мицеллы, гм, можег быть зачислен с помощьв следующего выражения

рм (2) = 4 + 1.5 w0 (1 )

где wQ - это молярное соотношение Н^О и АОТ в мицеллярнсм растворе

wQ = [HgOl / [АОТ1 (2)

Приблизительный радиус белковой молекулы, если принять, что она представляет собой сферу с плотностью 1.2 г/см3, для БСА (мол.вес 67000) составляет 28 2, что соответствует v»0=16 в соответствии с уравнением (2).

Кавдая молекула БСА содержит около SO аминогрупп , которые могут быть использованы для модификации. Таким образом, обьем t.ra-цеялярноЗ полости должен быть достаточно большим, чтобы уместить одну молекулу БСА И 60 молекул N-гидроксисукцинимидного зфира

-7

11

11а-гидроксипрогестерона (мол. вес 528.5). Мы предположили сферическое распределение молекул активированного стероида вокруг молекулы БСА и - его плотность примерно 1 г/см3. С помощью этой модели

Таблица 2. Моляшое соотношение прогзстеоон/БСА в конъюгатах, синтезированных в" обтащенных мицеллах 0.3 и АОТ в октане (метод А) при различных молярных соотношениях [активированный стероид]/(БСА) и [Н^ОШАОТ].

номер [активированный стероид] [Н?0] ' прогестерон

эксперимента----- -

• [БСА] [АОТ 3 БСА

1 50 18.5 12

2 100 18.5 32

3 200 18.5 42

4 100 27.7 38

5 100 37.0 47

6 100 _* 10

* Синтез проведен в смеси вода/ДМФА

мы нашли эффективный радиус полости 32 Я и требуемую величину и0=18.5. При использовании. 0.3 М раствора АОТ это соответствует 9.1 объемных % воды (соотношение объемов октан/1^0 = 10/1).

Количество молекул прогестерона, связанных с молекулой БСА определяли спектрофотометричзски. При у?0=18.Б и увеличенных соотношениях [активированный стерокдШБСА] оно приближается к общему количеству белковых аминогрупп, табл. 2, ряды 1-3. Экстраполяция к бесконечно больней концентрации активированного стероида дает число 52, которое довольно близко к овдаемой величине если принять во внимание ошибку з определении числа связанных молекул гормона.

Для приготовления конъюгатов с большим числом связанных молекул гаптена обычно используют большой избыток .активированного сте- , роида над белком. Б системе с обращенными мицеллами мы можем достичь такого же результата увеличивая относительное количество воды, т.к. это приводит к увеличению объема мщеллярной полости ж,

л

как следствие, к увеличению количества молекул активированного стероида вблизи белковой молекулы. Табл. 2 показывает результаты, полученные при увеличении »0, эксперименты 4 и 5, которые подтверждают эту идею. Однако, следует отметить, что (это верхний предел содержания 1^0 в обращенных мицеллах з нашем случае, т.к. дальнейшее увеличение количества приводило к разделению фаз.

Когда кокъюгаты были синтезированы в обнчных условиях в водно-органической смеси при 100-кратном избытке активированного стероида, то удавалось присоединить только 10 молекул-прогестерона к одной молекуле БСА, табл. 2,Л 6.

Таким образом, синтез конъюгатав в обращенных мицеллах позволяет как упростить процедуру синтеза и выделения продукта, так и. получать коньягаты с болзе высоким соотношением гормон/БСА, чем в водно-органической смеси.

4. СИНТЕЗ И (ТРАВЛЕНИЕ ШШШЮГИЧБСЖОЯ АКТИВНОСТИ КОШГАТОВ 1дС-ГК, (Гаь)о-ш:, УаЬ-ПХ

Одной из основных проблем мембранного МФА является получение реагентов, обеспечивающих максимальное превышение полезного сигнала над фоновым. Основной вклад з величину фонового сигнала вносит неспешфичесная сорбция конгюгата. Нами был проведен синтез трех типов конгюгатов различающихся молекулярной массой, для чего использовали целуя молекулу а также ее (?аЬ)2- к

РаЪ-фрагменты. Была изучена иммунологическая активность данных типов конъотатов в методе прямого твердофазного ИФА на полистироль-ных планшетах, а также связывание этих же конъюгатов с иммуноглобулином К, иммобилизованным на мембране. Полученные данные свидетельствует о том, что наиболее высокой иммунологической активностью обладает конгмгат, содержащий целую молекулу а Рэ.ь-ПХ - достаточно низкой. В экспериментах на- мембранном носителе конъю-гат хотя и дает высокое значение специфического сигнала,

однако обладает слишком высоким уровнем зеспецяфкческого взаимодействия с носителем. Коньюгат РаЬ-ШС при низком фоновом сигнале имеет и слабый специфический сигнал. Наиболее эффективным для работы с мембранным носителем оказался коньюгат (РаЬ)2-ШС, т.к. только он позволяет подучить максимально разницу между полезным и фоновым сигналом.

ДАБ КБТГ

ОД

ОД+дС-

ОТ+ДС

ТМВ+ДС

бевзедин+ДС

& &

® О

©

& &

© ©

© &

о &

га-

■ф

ь

-4?

Рис.7 Сравнение пероксидззных субстратов. ПХ была* ковалентно связка в различных концентрациях с капгонозой мембвазой н помещена в субстратные растворы до полного шзвития окраски. Сгрипы были сканированы через 1 час.

пег

5. АНШТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ОКИСЛЕНИЯ СОЕШЕНМ 5ЕК5?ШДЮ30Г0 РЯДА В^ПРИСУТСГБЮ? ДС

Рис. 7 позволяет сопоставить характеристики ряда детектирующих систем для Ж, коЕызгировашой с 1@з е коволентно ю&юбилизо-ванвой на капроновой мембране. Видно, что использование комбинации субстратов с ДС обеспечивает наиболее высокую чувствительность при полном отсутствии фона. Такие система позволяют детектировать 4.7 лкг И.2-Ю"16 моль) ГК в конъюгате.

Найденная на® система детекнии бнла использована при разработке мембранного анаякза прогестерона. Антитела бь*-яи получены против конъюгата 11а~кщшсшрогестерона с БСА, ^тезированного в обргшенных ьшеллаг АОТ в октане, а синтез конъюгата црсгесте-рон-ПХ осуществлялся по традяцоннэму методу активированного эфира. После проведегня ишунолопезссой реакции часть стрипов была проявлена с использованием в качестве субстрата ДАБ, а часть - с использованием смзск ОД и ДС. Полученные окрашенные пятна были про-сканированы на приборе, измеряющем плотность отраженного света.

Из полученных данных следует, что использование предложенной нами субстратной системы позволяет работать с раствором прогесте-рон-ПХ в'концентрации 4 зг/мл (10" К) и получать достаточно четко различимое изображение, в то время как при использовании ДДБ мы не мояем работать с концентрацией конъюгата ниже, чем 20 нг/мл (5-10" Щ. В даном анализе необходимо, чтобы 2нг/мл свободного прогестерона могли кошсурпровать и Еатеснять коаъкггат про-гестерон-ПХ, для чего они должны быть в сопоставимых концентрациях. Поэтому возможность при использовании нашей субстратной сис-

i \

темы работать с концентрацией 4 нг/мл (Ю-10 М) является очень полезны« результатом.

Была изучена также модельная системы для определения прогестерона. Нэк и в предыдущем эксперименте, часть стрмтоз была проявлена ДАБ, а часть - ОД в смеси с ДС. Оказалось, что при проявлении ДАБ из-зз недостаточной чувствительности метода детекции нам не удается детектировать концентрации прогестерона нихе 16 нг/мл. Б то уз время, при использовании нашей субстратной системы нам удалось зафиксировать концентрацию прогестерона равную) 1 нг/мл. Таким образом, предложенная наш система детекции позволила разработать модель мембранного ИФА для определения требуемых низких концентраций прогестерона.

Другзя особенность предложенной методики состоит в возможности создания "двухцветной" детектирующей системы. Как видно из рис.3 имеется довольно узкая область концентраций фермента, в которой происходит смена продукта окисления и, как следствие, цвета штна при (Таксированной концентрации ДС. Гак, в условиях рис.3 увезщчонкз концентрации ИХ з 2 раза приводит з случае ОД я перехода от темно-зеленой к келто-коричнавой окраске (в случае других рассмотренных выше субстратов происходит менее контрастный переход, что является менее наглядным). Этот интервал перехода могзо регулировать концентрацией ДС.* при более низкой концентрации ДС требуется менияря ксзцэетрзция ИХ для окисления субстрата до конечного продукта. Таким образом, появляется возможность очень простой я четкой визуальной детехцяп пороговых концентраций антигенов, что необходимо во многих случаях применения I®А, когда требуется дзть яолокптельшй или отрицательный ответ по уровню содержания определяемого компонента.

выводи

1. Окисление замещенных бенззшнов под действием ковалентно иммобилизованной пероксидазы в присутствии декстрансульфата натрия приводят к образованию интенсивно окрашенных продуктов, идентифицированных на основании данных отражательной электронной спектроскопии как соответствующие катион-радикалы либо кершошош.

2. Влияние декстрансульфата объясняется связыванием промежуточных продуктов окисления бензидкаов с адсорбированным на поверхности гидрофобного носителя нолианионом, в результате чего стабилизируется их вротонированные формы, имеющие низкую реакционную способность в дальнейших превращениях.

3. Аналогичный эффект в растворе оказывает мицеллы анионных DAB. Кинетическое исследование гомогенен систем показывает, что кшцеяла не влияет на каталитическую активность персксвдазы.

4. Разработана методика синтеза жкшогата прогестерон-БСА, попользованного для иммунизации кивотных, в среде обращенных №щелл АОТ в октане. Показаны преимущества данного метода.

5. На основе обнаруженного эф^ема стабилизации промежуточных продуктоз окисления ариламкнов в тр^сутстЕзк отрицательно заряженных далиэлектролЕтоз разработан высокочувствительный вариант мембранного ет^унофэрмгятного анализа прогестерона. Показан нознсаность создания "двухцветной* детектирующей система с использованием данного эффекта*

Основные работы ^шссертацонной работа Ялтегрской В.А. отражены в следуших публикациях:

1. G&vxilova E.LÍ. .Yatsinirskay.? Е.Л.: Fopova lí.II., Sorokina N.Y., Egorov A.M. МеиЬгапэ Enzyse 1пашпоаЬа8л íor Inmunoglobulíns G, A and К in Hunan Blood Ssruai. // В сб. материалов "In teraatioEai cong/^as "2? Years of Irmuaoer"izymat ic technique", Athena, 1991» r.B8.

2. Яшмирская S.A., Муртазин P.P., Кам Б,Б. Мембранный икнуноферментный анализ с хемзшашнесцентной детекцией. // В сб. материалов vil Всесоюзного симпозиума по ишенерной энаимояогии, Москва, 1991, С.143.

3. Яаимирская 2.А.. Гавряловз Е.М., Сорокина К.В. Мембранный »¡ькунофериектшЯ анализ иммуноглобулина М // В ей. мете риалов VII Всесоюзного симпозиума по иижеичрноЯ знзимэлогетп, Москва,

4. Sorokir.a II.V., Згмсхп 5.Л. , Vatciiaii-akaya Е.Л. , Gavrilova В.К. Reagents for itrnruioohemiop-l analysis of progesterone // В Сб. материалов международной конференции "Uodem enaymology: Problems sniiTrsndc", Tama, 1991, 1.143.

5. Яцишрская Е.Л.. Попова K.H., Газрилова S.M. гпгап;о-химическле основы мембранного имкузмферментного анализа IgM. // Биотехнология, 1992, н 2, с.67-70.

Ш1 I. С.140

СПИСОК ШЯЮЛЬЗОВАБШ В РАБОТЕ СОКРАЩЕНИЙ

ОД - срсю-дианизидип ОТ - СрЯО-ТОЛИДИН

ДАБ - З.З'-дкЕшиноОензкшш ТМБ - и.н.Н'.К'-тетраметЕЛОенгшин ЛС - декстрансульфат натрия ДСН - додецилсульфат натрия ПВС - ноливикилсульфат натрия БСА - бнчий сквароточчнй альбумин ИХ - пероксидаза нз корней хрена

- икм?ноглобулзл о ПАВ -поЕерхностноактквное вещество ККН - критическая концентрация кицеллообразовгния КФА - шмуноферментннЕ аважз