Структурно-функциональное исследование антимикробных пептидов морских беспозвоночных тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. АКАДЕМИКОВ М М ШЕМЯКИНА И Ю.А ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

Баландин Сергей Владимирович

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ МОРСКИХ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ

02 00 10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2008

Работа выполнена в Учебно-научном центре Института биоорганической химии им академиков ММ Шемякина и ЮА Овчинникова Российской академии наук

Научный руководитель

Официальные оппоненты

кандидат химических наук Овчинникова Татьяна Владимировна

член-корреспондент РАН, доктор химических наук Габибов Александр Габибович

член-корреспондент РАН, доктор химических наук Кочетков Сергей Николаевич

Ведущая организация, институт биохимии им А Н Баха Российской академии наук

Защита состоится. 2008 г в /О часов на заседании

диссертационного совета Д 002 019 01 при Институте биоорганической химии им. академиков М М. Шемякина и Ю А Овчинникова Российской академии наук по адресу 117997 ГСП-7 Москва, В-437, ул Миклухо-Маклая, 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М Шемякина и Ю А Овчинникова Российской академии наук

Автореферат разослан ^ 2008 г.

Ученый секретарь д иссертационного совета, доктор физико-математических наук

В А. Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Эндогенные антимикробные пептиды (АМП) - эволюционно древние факторы врожденного иммунитета, играющие ключевую роль в защите многоклеточных организмов от инфекции. Вся эволюция многоклеточных протекала в непрерывном контакте с патогенной микрофлорой, поэтому наличие эффективных защитных механизмов было необходимым условием их выживания Сходные по строению и функции пептиды были выделены из тканей беспозвоночных и позвоночных животных, а также растений. Позвоночные животные, начиная с челюстных рыб, приобрели в процессе эволюции способность вырабатывать антитела Однако даже эти животные в первые минуты и часы взаимодействия с патогеном могут полагаться только на врожденные механизмы антимикробной защиты У беспозвоночных, лишенных лимфоцитарного иммунитета, биосинтез защитных молекул пептидной природы представляет собой один из главных механизмов противодействия инфекции Поэтому поиск и исследование новых АМП у эволюционно древних видов животных является перспективным для понимания закономерностей функционирования иммунитета у высших позвоночных и человека

К настоящему времени определены первичные структуры около тысячи природных АМП, исследованы пространственные структуры некоторых из них, построены модели взаимодействия АМП с мембранами и внутриклеточными мишенями. По мере углубления наших знаний об этих веществах становится все более очевидным еще один аспект их функционирования, состоящий в регуляции иммунных процессов и регенерации тканей.

Фундаментальные структурно-функциональные исследования АМП тесно связаны с их важным прикладным значением Природные пептиды могут стать прототипами новых антибиотиков широкого спектра действия, способных решить

проблему резистентности к существующим антимикробным средствам. Поразительная генетическая изменчивость и скорость размножения микроорганизмов являются факторами, создающими для человека серьезные проблемы в борьбе с возбудителями инфекционных заболеваний. В связи с этим поиск природных АМП и создание новых пептидных антибиотиков на их основе являются актуальными задачами современной биологической науки Традиционно применяемые антибиотики микробного происхождения, решая основную задачу, связанную с инактивацией микроорганизмов, вызывают и ряд нежелательных побочных эффектов, таких как состояние иммунодефицита, эндотоксемия, повсеместное развитие резистентности со стороны микроорганизмов. Есть основания полагать, что АМП при использовании их в качестве антибиотиков будут лишены перечисленных недостатков Более того, многие катионные АМП обладают эндотоксин-нейтрализующей и иммуномодулирующей активностью. Развитие резистентности патогенов к АМП значительно затруднено, поскольку требует внесения серьезных изменений в структуру и электрофизиологические свойства клеточной мембраны, в целом снижающих конкурентоспособность резистентных штаммов. Являясь факторами, повышающими проницаемость мембраны, АМП усиливают действие традиционно используемых антибиотиков Все это является предпосылкой для создания антимикробных препаратов на основе природных молекул. Первые представители этой группы лекарств уже проходят клинические испытания Дальнейшие структурно-функциональные исследования АМП, вырабатываемых различными видами животных, могут внести существенный вклад в развитие этого перспективного направления медико-биологической науки.

Цель и задачи исследования.

Цель работы состояла в структурно-функциональном исследовании антимикробных пептидов морских беспозвоночных В качестве объектов

исследования были выбраны представители двух типов беспозвоночных, морской червь Aremcola marina [тип - кольчатые черви (Annelida), класс -многощетинковые (Polychaeta)] и медуза Aurelia aurita [тип - кишечнополостные, класс - сцифоидные (Scyphzoa)]. Предметом исследования были структура и свойства антимикробных пептидов, содержащихся в целомоцитах Aremcola marina и клетках мезоглеи Aurelia aurita, а также методика получения этих пептидов в искусственных экспрессирующих системах, технология их выделения и очистки

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи

определить последовательности кДНК, кодирующих АМП, сконструировать системы для их гетерологичной экспрессии, разработать методику их выделения и очистки; исследовать антимикробную активность этих веществ

Научная новизна и практическая ценность работы.

Подавляющее большинство известных в настоящее время АМП животного происхождения были выделены из тканей млекопитающих, земноводных и насекомых. Арсенал АМП других классов животных до сих пор остается малоисследованным. В ходе проведенной работы были исследованы структура и свойства АМП из представителей двух таких классов - многощетинковых кольчатых червей и сцифоидных медуз Полученные нами результаты позволяют говорить о принадлежности данных веществ к двум новым структурным семействам АМП Эти сведения обогащают наши знания о природных молекулярных факторах врожденного иммунитета беспозвоночных животных и могут стать основой для дальнейших исследований пространственной структуры и механизмов биологической активности этих веществ, а также могут представлять ценность для исследований в области молекулярной эволюции АМП животных

Нельзя исключать и возможности создания препаратов на основе данных пептидов для использования в медицинской и ветеринарной практике в качестве антибиотиков широкого спектра действия

Апробация работы и публикации.

Результаты исследования были представлены на IV и VI Гордоновских международных конференциях по антимикробным пептидам (Барга, Италия, 2003, 2007), на VII и VIII чтениях, посвященных памяти акад. ЮА Овчинникова (Москва, 2004, 2006), на III съезде Общества биотехнологов России им Ю А. Овчинникова (Москва, 2005), на IV Московском международном конгрессе «Биотехнология' состояние и перспективы развития» (Москва, 2007), на XV, XVI, XVII, XVIII и XIX зимних молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2003 -2007)

По теме диссертации опубликовано 13 работ Структура и объем работы.

Диссертационная работа изложена на 177 страницах, содержит 26 рисунков и 4 таблицы, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и библиографического списка, включающего 365 наименований

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Определение полных последовательностей кДНК, кодирующих предшественники антимикробных пептидов ареницинов из морского кольчатого червя Arenwola marina, и соответствующей им полной аминокислотной последовательности препроареницинов.

Методом RACE (быстрой амплификации концов кДНК) были амплифицированы сначала 3'-концевые, а затем 5'-концевые области транскрилтов, кодирующих ареницины В работе использовалась модификация метода RACE, основанная на эффекте супрессии ПЦР, а в случае 5'-RACE - также на эффекте переключения матрицы в ходе обратной транскрипции Структуры ген-специфических праймеров для З'-RACE выбирались на основании данных по аминокислотной последовательности зрелых пептидов (полученных ранее секвенированием по методу Эдмана) с учетом вырожденности генетического кода и данных по частоте использования кодонов у A marina и филогенетически близких организмов Продукты ПЦР были клонированы и просеквенированы Анализ установленной нукпеотидной последовательности позволил определить полную первичную структуру предшественников ареницинов.

Структура полноразмерной кДНК (около 1300 по) предшественника ареницина-1 была получена путем сопоставления результатов секвенирования 3'-и 5'-концевых фрагментов (рис 1) Последовательность, кодирующая вторую изоформу пептида (ареницин-2), была установлена по единственному 5'-концевому клону и, следовательно, являлась неполной в области З'-UTR Структуры кДНК были зарегистрированы в банке данных по нуклеотидным последовательностям GenBank под номерами AY684856 и AY684857 В обоих случаях анализ нуклеотидной последовательности показал наличие открытой рамки считывания, кодирующей предшественник АМП размером 202 аминокислотных остатка (регистрационные номера в банке данных по

1 САОАбАТССА ааСАСАТССС САТАСвТСАА СЗСГвАвСАв ТТТСАвАвАА бТСТССАТАв АвТСТСТОбА ТАбССАвТЙА

81 тссттвсвет СТСССАССАА бТТЗССАААС ТТ(ЗАСА(ЗСАА вСССАбААвА СВСАТАввСС ЭАвАТАеТТв ТвАТСААССА

•1 МТЗТО810А\'ХДТ1. 1 1 А 1 Р С V N О 1 Н

161

И

241

321

•1 •СБУ М VI Р Н А К Й 1.1 в V 5 1 РВ А 6 ЕС У 110

401

-1

481

•Й У Е Э А 1 0 У УК А ЕР Я РУТ 0 1 N 1. 1. А Р . Е V Я Е

МЗкМЮ (3-ЯАСЕ)

и •Е А С сг В К в У У V 1. ЕК 8 ЭО 0 N N Е Р ЕК Я И V С

641 АввССТЗССА ЩЩЩШ в'ГвТАСТЗаС ТССАвАДОАЗ ШШШЖ^вШДрН

МЭ и МЮ (УЯАСЕ) повтор 1 повтор 1

УУАУ^/РУРбУ ЬУНУРВС«'

721 |вТСТАС©САТ АС&ТСАС0вТ СС(5А6(ЗТаТ(3 СТевТбСБТТ АССбААввТб ттев^Щ 111

повтор 1 повтор! повтор 1 повтори

801 САвАССССвА СвОТАвССАв АССССбАСбв САСССАвАСС ССбАСвАСАТ ССАСТТТСАС бвСАТССАСТ вТСАвббСАТ

881 СТАСТвТСАС бвСАТССАСТ вТСАСбОСАТ ССАСТвТСАС ввСАТССАСТ вТСАСввСАТ СТАСТвТСАС вОСАТССАСТ

¿е'пеция в некоторой клона*

га в гор II повтор И

961 вТСАСбвСАТ ССАСТвТСАС 6<5САТССАСТ бАвААССвАС вАТТСТбСАв СССТСАвАвТ вТвАССАТТТ ТОАААТбвОА

Депс ция в некоторых клона* ГИ2«(6Т(АСе) М2715ВАСеУ

1041 ТСААТвАСАТ ТТТСТАСТТТ СААвТАТТАТ ТСАААААТВТ (ЗАТТвТТТТЗ ААСААТТАСА ААТТТАЗТСА АСвААбТТвТ ...............

1121 СТвТАСАСТТ ТвССТАСААА бСАСвТААТА СТАТгаХ^ ТТАТТССАСТ АССТАвСТТА 6АТАТТСАСА АСТТСААвСС

1201 АЭАСАССТТВ ВТСАТеСААТ ТАТОТТОВСА ТАААЭААААС ТТТТАТАААТ АСАААААААА ААААААА

Рис. 1. Последовательность кДНК, кодирующая предшественник ареницина-1, и соответствующая ей аминокислотная последовательность препроареницина-1. Участки транслируемой области, кодирующие отдельные функциональные домены предшественника, выделены цветом: темно-серым - сигнальный пептид, светло-серым - продомен, черным - зрелый пептид. Указаны сайты отжига праймеров, использованных для амплификации концов кДНК, повторяющиеся последовательности двух типов (I и II), а также отличия, наблюдаемые в разных клонах (в области сигнального пептида и З'-иТЯ).

аминокислотным последовательностям SwissProt - Q5SC60 и Q5SC59) Участок, соответствующий зрелому пептиду (21 аминокислотный остаток), расположен в С-концевой области предшественника С помощью компьютерный анализа с использованием алгоритма SignalP 3 0 (http //www cbs dtu dk/servxces/SignalP/) выявлена вероятная N-концевая сигнальная последовательность белка (25 аминокислотных остатков), необходимая для его транспортировки в эндоплазматический ретикулум Длина фрагмента между сигнальным и зрелым пептидами составила 156 аминокислотных остатков На границе между продоменом и зрелым пептидом выявлен дипептид из катионных остатков (Lys-Arg), что указывает на возможное участие протеиназы из семейства фурина в процессинге проареницина

При сравнении кДНК двух изоформ ареницина были обнаружены нуклеотидные замены, в отдельных случаях приводящие к аминокислотным заменам (рис 2) Секвенирование клонов, содержащих 5'-концевые области кДНК, показало, что некоторые из них кодируют цистеин в положении 10 сигнального пептида, в то время как другие, включая единственный клон, содержащий последовательность ареницина-2, кодируют тирозин Наблюдаемую замену можно объяснить не только внесением мутации на стадии ПЦР, но и наличием двух различных копий гена ареницина-1 в геноме A marina.

Зрелые ареницин-1 и ареницин-2 содержат по 21 аминокислотному остатку каждый и имеют расчетные молекулярные массы 2758,5 и 2772,5 Да, совпадение которых с экспериментальными значениями масс молекулярных ионов говорит об отсутствии посттрансляционных модификаций у этих пептидов. С-Концевая карбоксигруппа ареницинов не амидирована, данная модификация оказывается возможной лишь при наличии в структуре предшественника остатка глицина, следующего непосредственно за концевым остатком зрелого пептида Более половины остатков, входящих в состав зрелых ареницинов, имеют ярко

препроареницин-1 препроареницин-2

.ргАВАНдайгаЕ

||1|§||||§|

щ&^сжвёщтц

101 150

151 202

Рис. 2. Сравнение аминокислотных последовательностей предшественников ареницина-1 и аренидина-2. Темно-серым цветом выделен сигнальный пептид, светло-серым - продомен, черным - зрелый пептид. В рамки заключены аминокислотные замены. Один из вариантов препроареницина-1 содержит остаток цистеина в положении 10 сигнального пептида.

выраженные гидрофобные свойства. Катионный характер молекулы обусловлен присутствием шести остатков аргинина. Несмотря на то, что подобный аминокислотный состав характерен для многих пептидных антибиотиков, полученная аминокислотная последовательность не имеет гомологии с известными представителями этой группы молекул. Уникальная особенность аренипинов состоит в формировании ими больших 18-членных циклов, замкнутых дисульфидной связью.

Размеры продомена препроареницинов значительно превышают длину соответствующих участков, встречающихся в предшественниках других АМП. Поиск в базах данных по аминокислотным и нуклеотидным последовательностям (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) позволил обнаружить сходство продомена предшественника ареницина с продоменами предшественников хондромодулинов - факторов роста и дифференцировки хрящевой ткани и ингибиторов ангиогенеза из различных видов позвоночных. Степень гомологии достигает 25% идентичных или 46% эквивалентных остатков; при этом для выравнивания

последовательностей длиной около 130 аминокислотных остатков достаточно введения всего нескольких разрывов (рис 3).

Более подробный анализ, основанный на сравнении последовательности с моделями Маркова, построенными для известных консервативных доменов (http //smart.embl-heidelberg de), указал на принадлежность препроарешщинов к группе белков, содержащих домен BRICHOS. Последний был идентифицирован в ряде функционально несвязанных друг с другом белков человека, ассоциированных с различными заболеваниями помимо хондромодулинов, участвующих в патогенезе хондросаркомы, к ним относятся белки семейства BRI, мутации которых наблюдаются при наследственной деменции, а также гастрокин-1 (белок СА11), пониженная экспрессия которого отмечается при раке желудка, и сурфактантный белок SP-C, снижение уровня экспрессии которого ассоциировано с расстройствами дыхательной системы О древнем происхождении домена BRICHOS говорят факты обнаружения гомологичных участков в базах геномных и EST (Expressed Sequence Tag) последовательностей иглокожих, круглых червей, насекомых и ланцетников.

Разнообразие фенотипических проявлений, связанных с BRICHOS-содержащими белками, не позволяет делать сколько-нибудь определенных выводов о функции домена на основании сведений о функции целой молекулы В то же время наблюдается сходство в механизмах процессинга всех этих белков Большинство из них являются секретируемыми белками, расщепляемыми по сайту из сдвоенных катионных остатков и несущим склонный к агрегации С-концевой фрагмент, стабилизированный дисульфидной связью. Ранее было высказано предположение о том, что домен участвует в процессинге содержащих его белков Эта гипотеза может служить для объяснения функции продомена предшественника ареницина Однако гомология белковых предшественников ареницинов и хондромодулинов может нести и более глубокий биологический

X * 70

Ar-1 VNGE----KXÈVNEQESTREI IRQAGGDGVEGSVM^IÛHAKGIjI SWS X PRAGj^^Çl GGVDKÇJL^|5AQEÎéL

Ar-2 VNGE------KVËV^^jlOTIxfeAGGDGVEGSVMVIDIiZiKGLIIWSIPRAGECYLIGGVDKCLPDAQELL

BtChM INGKLQDG3MKID/,вП'ЛЬЕТЩМ—gSBAjlEA^VNpFQHéïTGIRPAGGEkcYIKAQVï. VGT1T

HsChM IN GKLQDGSME XI^cdbllSBI—Ss3l|raB^I№aii^XeXKEIlGGBKCYXKAQVKARX PEVGAî|t XlChM ÏNGKV2EGS№IDSGA.|TEfe—^T§N^E^^E^HSFQI^ÏTGXRFTGGEKCi:IKAQAKAHXPDVDS^T OcChM INGKI.QDGS 4NLETFKM—GSGA^EÂîEVmFQN^TGIRFAGGEKCïTKAQVKARVPEVGa^T

MmChM XNGKLQDGSME ХЕД VNNLETFKM—GSÇSAKEAÎEVNB FKNèÎTGIRFAGGEKC\ IKAQVi VGTjgT

RnChM INGRLQDASMEXDAANNI.ETFÉM—^Sj^ApEÀXËVNpFQN&ITGIRFAGGE^^ÎÎKAQVKARIPEVSTGT GgChM xWSKVQDGSMEIDAGNNLETFKT—GSGSEEftîrë^BFQIi^iTGIRFAGGEKCYIKAQPKARVPEVDAjT TnChM --■-------ÎÎÈMQAANNMERFST—

71 * 139

Ar-1 HÏFQSAQGSADGEGV-----ESALDTVKAEDRPVTOLNLIAPEVREACQGKSVYÏïbÉKSSGD№?ÉPÉKR

Ar-2 HYFRS7iQGSADGEGV------QSALD7fVK;-i : ULNLLAPEVRfaCQGKSVYWLEKjSGD|fflp^g

BtChM К—gSISSELBGKIMPVKYBEMSLIWV-:, CiMSFLSSRVLELCGDLPXBWLKPTYPKEIQRBB»

HsChM к—psxssiaJGadbvKZBEiisr.x|V-> лм^в^81Д^х,с<жьрхртже^рквхв1ж8 ххсш к—^glsfeledeimpakfdensliwv-am)qpvkdssflspkiqelcadlpifw^rp1ypke|^rg

OcChM Q—QSISSELËGKIMPVKHE' ''QDNSFLSARVLELCGDLPIFWLKPTYPKEXQRERR

MmChM К—QSIS-ELEGKXMPVNYEEHS&IWV-AVDQPVKDS SFLS SKI LÇLÈGDLPI tWIKPMYPKEI^R^^p RnChM К—§SIS-ELÇGIÇIMPVKYEENSI,IWV- ? rCDNÇF^ëSltïX^FÙGDLPXF^fbKPMYPKEXPrHH

GgChM К—ASLSSDLEDEXMPVRbT>ENSbI^-3Ù№EPIKKNGF^^^

TnChM R—iiMTFELEDgV>lPAKF-EDNX,IWV-AVDTPVSbsSFXSSKXKELCGDLPIFWbRPAYSGSAQRKRR

Рис. 3. Сходство продомена предшественников ареницинов с предшественниками хондромодулинов. Сокращения: Аг-1, Аг-2 - предшественники ареницина-1 и ареницина-2; Bt - Bos taurus, Hs - Homo sapiens, XI - Xenopus laevis, Oc -Oryctolagus cuniculus, Mm - Mus musculus, Rn - Rattus norvégiens, Gg - Gallus gallus, Tn - Tetraodon nigroviridis. Звездочками отмечены консервативные остатки цистеина.

смысл В настоящее время известно о способности многих АМП млекопитающих вызывать хемотаксис лейкоцитов Группой авторов под руководством профессора В Н Кокрякова получены предварительные результаты, свидетельствующие о наличии сходной хемотаксической активности ареницинов по отношению к целомоцитам пескожила

2. Определение полной последовательности кДНК, кодирующей предшественник антимикробного пептида аурелина из сцифоидной медузы Aurelia aurita, и соответствующий ей полной аминокислотной последовательности препроаурелина.

Амплификация 3'-концевого участка кДНК аурелина по указанной выше методике не позволяла получить искомый фрагмент в одну стадию ОТ-ПЦР Вероятной причиной этого послужило низкое содержание соответствующей мРНК в тканях медузы Продукты RACE были успешно реамплифицированы с внутренними ген-специфическими праймерами (semi-nested PCR) Секвенирование клонированных фрагментов длиной около 300 п о показало, что они содержали последовательность, кодирующую С-концевую область зрелого аурелина, и область З'-UTR. Длина З'-UTR варьировала в клонах, полученных с разными наружными ген-специфическими праймерами Причиной полиморфизма могли быть некорректная инициация синтеза кДНК в A-богатой области З'-UTR (in vitro), либо использование альтернативного сигнала полиаденилирования (in vivó)

Дальнейшие эксперименты по амплификации и секвенированию 5'-концевой области кДНК позволили установить полную структуру транскрипта длиной около 500 п о (рис 4). Анализ нуклеотидной последовательности показал наличие открытой рамки считывания, кодирующей предшественник антимикробного

1 ввТАСААССА САТСАвввТС ТОСАТАААЗТ САСвТТСАСА САвТСАСТвв САААСТОАТС АТАТТКСААС ЦН

•г РКУ ЬУЦГАА! LCMSIL.VCAEDEVNL.QA

81

.2 9 1 Ё Е в Р М'ЕА 1 В 8 В 0 АА С в 0 В АНе Н 1С Е-

161 СААМ^АА^^ЙАССТАТ авЧйойАМт.темссдблс

•г 1) и 12(р«анпицзикация продуктов У-ЙАСЁ) •Е 3 ? К . в Р С К ОЭ б ВЫ б V К 1 В А N С К К Т С 0 1 С-

241 |ААССТТТААО АСТТ.ТТТеСА АА^АТТСАеб АСССААСеСД СТААААСТСА (ЗЭ.ЭСАААТТв СААСААААСА ТЗСвеАТТАТ|

•2 • С ' ¿пьтернагиеил* смгнап ро1<|А

321 ¡^ГААвСЗЗАТ АТТОвАААТТ САВАввАСТП ТвАТвАбСАА АбСААССАТв ЛААТАЛАвТА АСТвТТАввА ААвввААААв ......1 Й (реампп ириклци я п'^д^ а АСЕ] " """ ■ ^.......................53 Й А С Е)................................

401 ................................ АААТТТАвСА бАТОСААбТв СТАвССАСТв САТАТСАААТ АААТАААТАА АТАААТААСТ АААТ8ТАСТС ССААвТАЙТТ

481 ААТЭААТвАА АТАСССАААА АААААААААА АААААААААА АААААА

Рис. 4. Полная последовательность кДНК, кодирующая предшественник антимикробного пептида аурелина из А.аигНа, и соответствующая ей аминокислотная последовательность препроаурелина. Участки транслируемой области, кодирующие отдельные функциональные домены предшественника, выделены цветом: темно-серым - сигнальный пептид, светлосерым - продомен, черным - зрелый пептид. Показаны сайты отжига праймеров, использованных для амплификации концов кДНК, а также сигналы полиаденилирования.

пептида аурелина, состоящий из 84 аминокислотных остатков Шесть 3'-концевых и четыре 5'-концевых клона кодировали один и тот же белок, немногочисленные нуклеотидные замены не совпадали в разных клонах и, вероятнее всего, были вызваны ошибками синтеза на стадии ПЦР Зрелый пептид длиной 40 аминокислотных остатков локализован в С-концевой области предшественника непосредственно за последовательностью Arg-Ser-Arg-Arg, представляющей собой типичный сайт протеолиза для конвертаз семейства фурина С помощью программы SignalP 3 0 была обнаружена вероятная N-концевая сигнальная последовательность, отщепляемая при гидролизе связи А1а22 - Glu23

Антимикробный пептид аурелин из A aurita имеет расчетную массу молекулярную массу 4296,95 Да, близкую к экспериментально полученному значению m/z [М+Н]+ 4297,8 Да Исходя из этих данных, аурелин не должен содержать посттрансляционных модификаций Результаты секвенирования нуклеотидной последовательности кДНК подтвердили наличие в структуре пептида шести остатков цистеина Это стало основанием для предварительного отнесения аурелина к семейству дефенсинов - наиболее распространенному и консервативному семейству АМП Однако уникальный порядок расположения остатков цистеина в аурелине отличает его как от дефенсинов, так и от всех других семейств цистеин-содержащих АМП Его ближайшими гомологами в настоящее время можно считать группу токсинов из яда морских анемон (класс Anthozoa, тип Coelenterata), блокирующих калий-селективные каналы нервных клеток Выравнивание последовательностей, хотя и требующее введения относительно большого числа разрывов, позволяет убедиться в наличии 30-40% сходных остатков Следует отметить, что все представители рассматриваемого семейства токсинов являются катионными пептидами

Перечень структур, гомологичных аурелину, не ограничивается токсинами морских анемон Близкий по структуре гексацистеиновый мотив с неизвестной функцией, обозначаемый в разных источниках как домен NC6, SXC, Toxi или

БЫСТ, был идентифицирован в ряде белков позвоночных и беспозвоночных животных Мотив присутствует главным образом в секретируемых муцин-подобных гликопротеинах и ферментах (астацин-подобных металлопротеиназах, тирозиназах, миелопероксидазах)

Препроаурелин имеет типичное для предшественников многих АМП строение вслед за «классическим» сигнальным пептидом, несущим положительный заряд на И-конце, следуют анионный продомен и зрелый катионный пептид, отщепляемый по сайту из сдвоенных основных остатков. Сходными структурными чертами обладает предшественник НшК -единственного токсина этого семейства, последовательность кДНК которого была депонирована в ОепВапк Гомология предшественников токсина НшК и аурелина наблюдается лишь в области зрелых пептидов, в то время как сходство сигнальных участков и продоменов ограничивается одинаковым распределением заряженных и гидрофобных остатков

Структурное сходство аурелина с пептидами из морских анемон наводит на мысль о вероятной способности этого пептида блокировать ионные каналы. Выводы об истинной биологической роли аурелина могут быть сделаны лишь после того, как будет определен характер его экспрессии и локализации в тканях медузы, однако уже сейчас можно попытаться объяснить совмещение свойств антимикробных пептидов и нейротоксинов в одной молекуле В настоящее время известен ряд фактов гомологии и функционального сходства между специализированными АМП и пептидными токсинами Наиболее убедительным объяснением такого сходства служит гипотеза о дивергентной эволюции этих молекул Существование общих эволюционных предшественников у представителей именно этих классов пептидов представляется биологически целесообразным Несмотря на разную направленность действия, условия их функционирования предъявляют сходные требования к структуре и физико-химическим свойствам Электростатическое взаимодействие пептидов обоих

классов с мишенями на поверхности клетки оказывается возможным благодаря суммарному положительному заряду молекул, а мембранолитический эффект обеспечивается их амфифильностью Стабильность функционально активной конформации поддерживается дисульфидными связями, что особенно важно в растворах с высокой ионной силой Дисульфидные связи обеспечивают компактную укладку пептидной цепи, повышающую устойчивость обогащенных лизином и аргинином пептидов к действию внеклеточных протеолитических ферментов Молекулы обоих классов после синтеза на рибосоме направляются в эндоплазматическую сеть клетки и накапливаются в специализированных гранулах Их секреция в окружающую среду или полости организма может происходить конститутивно либо в ответ на стимуляцию Кажется логичным предположить, что в этих целях могут быть задействованы одни и те же механизмы процессинга и секреции, требующие наличия одинаковых сигнальных последовательностей в структуре белкового предшественника Анионный продомен, присутствующий в последовательностях предшественников аурелина, ряда нейротоксинов и многих АМП, может участвовать в нейтрализации токсичности С-концевого участка, соответствующего зрелому пептиду, либо служить сигналом для адресной доставки в специализированные органеллы -лизосомы или книдоцисты

3. Гетерологичная экспрессия и очистка ареницина-2

Основой для создания системы экспрессии послужили плазмиды серии рЕТ и штамм Е coli BL-21(DE3) и его производные Было показано, что экспрессия в Е coli ареницина-2 без каких-либо дополнительных аминокислотных последовательностей приводит к быстрому лизису клеток Вследствие этого были проведены эксперименты по экспрессии пептида в составе гибридных белков. По имевшимся литературным данным нельзя было сделать однозначного вывода о предпочтительности использования того или иного белка-носителя В качестве

таковых были опробованы несколько полипептидов, в первую очередь тиоредоксин А и бактериальная кетостероид-изомераза (KSI) Для получения зрелого пептида была использована реакция расщепления полипептидной цепи бромцианом по остатку метионина В первой серии экспериментов были созданы конструкции pET-KSI-Ar2, pET-MIS-Ar2 и pET-KSI-MIS-Ar2, предназначенные для получения гибридных белков в составе телец включения Агрегации продуктов должно было способствовать включение в качестве партнеров нерастворимого гидрофобного белка KSI, анионного фрагмента MIS, нейтрализующего положительный заряд ареницина, и сочетания этих фрагментов Опыты по экспрессии данных конструкций в штаммах BL-21 (DE3), BL-21 (DE3) pLysS/pLysE и Rosetta (DE3) при изменении различных параметров роста и индукции показали устойчивый, но низкий уровень синтеза KSI-содержащих белков, составлявший не более 5% от суммарного клеточного белка Выход бежа, содержащего анионный участок (KSI-MIS-Ar2), был выше по сравнению с KSI-Аг2

Очистка KSI-MIS-Ar2 сводилась к получению нерастворимой клеточной фракции и отмывке ее буфером, содержащим 1% Triton Х-100 и 4M мочевину Очищенные тельца включения подвергались расщеплению бромцианом в 80% трифторуксусной кислоте На электрофореграмме продуктов реакции появились полосы, соответствующие белку-носителю и отщепленному ареницину (рис 5-А) Масс-спектрометрический анализ смеси продуктов реакции методом MALDI показал наличие фрагмента с молекулярной массой, соответствующей зрелому ареницину, замкнутому в цикл дисульфидной связью (2772,0 Да) (рис 5-Б)

С целью облегчить очистку гибридного белка была создана конструкция для его экспрессии с N-концевой последовательностью из восьми остатков гистидина (pET-His8-KSI-MIS-Ar2). Одновременно был достигнут более высокий по сравнению с pET-KSI-MIS-Ar2 выход продукта Однако аффинная хроматография

Рис. 5. Расщепление гибридного белка К81-М15-Аг2.

А. ПААГ-электрофорез в трис-трициновой буферной системе: 1 - смесь белков-стандартов молекулярных масс; 2 и 3 - сумма продуктов реакции с СНВг; 4 - фракция, растворимая в 30% ТФУ; 5 - нерастворимая фракция клеточного белка, подвергшаяся обработке СМВг. Б. Масс-спектр фракции, растворимой в 30% ТФУ.

на

Ni-NTA агарозе не позволила достичь степени очистки выше 50% (рис. 6).

Помимо систем для экспрессии, в которых в качестве партнера использовалась KSI, были созданы конструкции с использованием тиоредоксина (Тгх) и целлюлозо-связывающего домена (CBD) на основе векторов рЕТ-32а(+) и рЕТ-34Ь(+), соответственно, однако лишь в первом случае выход рекомбинантного белка (10-15%) оказался сравнимым с выходом KSI-MIS-Ar2. С помощью направленного мутагенеза внутренний остаток метионина в структуре тиоредоксина был заменен остатком лейцина (TrxL). Работа в данном направлении привела к созданию конструкций pET-TrxL-Ar2b и pET-His8-TrxL-Ar2b, превосходивших рЕТ32-Аг2а по уровню экспрессии в клетках E.coli BL-21(DE3) (20-25% против 10-15%). Вопреки ожиданиям, тиоредоксин-содержащие белки

Рис. 6. Экспрессия и очистка 8хН13-содержащих белков на колонке с ЫьЫТА агарозой. Выделение рекомбинантного белка Шз8-К81-М18-Аг2: 1 - клеточный лизат, 2 - проскок, 3 -элюат. Выделение рекомбинантного белка Н1з8-ТгхЬ-Аг2: 4 - клеточный лизат, 5 - проскок, 6 - элюат.

накапливались в клетке в тельцах включения даже при проведении эксперимента в условиях, обычно способствующих повышению растворимости белка (при пониженной температуре инкубации, низкой концентрации индуктора, при добавлении глюкозы в питательную среду).

Очистка Н1з8-ТгхЬ-Аг2 проводилась с помощью металло-хелатной хроматографии на М-ИТА агарозе в буфере с 6М гуанидином (рис. 6). 1 мл суспензии смолы удерживал около 5,5 мг фракции, обогащенной рекомбинантным белком. В процессе диализа из 6М гуанидина белок количественно выпадал в осадок, не приобретая сколько-нибудь заметной растворимости в воде. Масс-спектрометрический анализ продуктов расщепления Н188-ТгхЬ-Аг2 бромцианом показал, что помимо пика, соответствующего ареницину-2, появляется новый фрагмент с массой, равной массе димера ареницина-2, который мог образоваться за счет межмолекулярных дисульфидных связей. Кроме того, отмечалось постоянное присутствие фрагмента с массой, превышавшей массу зрелого ареницина-2 на 16 а.е.м., и являющегося, возможно, продуктом его окисления по

А

время удерживания, мин

В

ш*.

Рис 7 А - Очистка рекомбинантного аренидина методом ВЭЖХ 1 - пептид с молекулярной массой 2788,1 Да, 2 - ареницин-2, 3 - белок-носитель и 4 - нерасщепленный гибридный белок, Б и В - МАШ1 масс-спектры фракций 1 и 2

остатку триптофана Очистка ареницина-2 из смеси продуктов реакции расщепления осуществлялась методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке Waters С4 в линейном градиенте буфера В от 0 до 40% (рис 7-А) В качестве стандарта использовался очищенный ареницин-2, полученный методом химического синтеза. Время удерживания рекомбинантного и синтетического пептидов в этой системе составило 33-34 мин, что соответствовало 21,5-22,0% ацетонитрила. Данный метод позволил отделить ареницин-2 от большинства примесей, в том числе от его окисленной формы, и был использован для препаративной очистки пептида Выход продукта составил около 5 мг/л культуры Чистота пептида оценивалась методами MALDI масс-спектрометрии (рис 7-В) и SDS-электрофореза в трис-трициновой буферной системе. Идентичность рекомбинантного ареницина-2 природному пептиду была подтверждена секвенированием по Эдману и тестом на антимикробную активность

4. Антимикробная активность ареницина-2

Антимикробная активность природного и генно-инженерного ареницина-2 определялась методом радиальной диффузии пептидов в агарозном геле с тест-культурой микроорганизма и методом двукратных серийных разведений антибиотика в жидкой питательной среде Для определения антимикробной активности использовали культуры следующих микроорганизмов. Escherichia coli ML-35p, Agrobacterium tumefaciens A281 (грам-отрицательные бактерии), Listeria monocytogenes EGD, Staphylococcus aureus 209p, Bacillus megaterium VKM41, Micrococcus luteus B1314 (грам-положительные бактерии), Candida albicans 820, Fusarmm solam VKM F-142 (грибы класса аскомицетов) Результаты тестирования представлены в таблице Показано, что генно-инженерный ареницин проявляет антимикробную активность в отношении всех использованных тест-микроорганизмов Действие природного и генно-инженерного ареницина-2 в

отношении грам-положительных и грам-отрицательных бактерий, а также их противогрибковая активность практически одинаковы.

Антимикробное действие природного и генно-инженерного ареницина-2

Тест-микроорганизмы Ареницин

природный генно-инженерный

Чувствительность / МИК90 (мкг/мл)*

Грам-положительные бактерии

Listeria monocytogenes EGD +/0,6 +/0,6

Staphylococcus aureus н О +/Н.0

Bacillus megaterium VKM41 но +/2,6

Micrococcus luteus B1314 H.O. +/2,6

Грам-отрицательные бактерии -

Escherichia coli ML-35p +/4,0 +/4,0

Agrobacterium tumefaciens A281 но +/5,0

Грибы

Candida albicans 820 +/4,5 +/4,5

Fusarium solani VKM F-142 н о +/Н.0

* н о. - не определялась

ВЫВОДЫ

1) Определены полные последовательности кДНК, кодирующих белки-предшественники двух изоформ антимикробных пептидов ареницинов из морского кольчатого червя Aremcola marina, и соответствующие им полные аминокислотные последовательности препроареницина-1 и препроареницина-2. Показано, что последовательности продоменов предшественников ареницинов обладают гомологией со структурой предшественников хондромодулинов позвоночных в области домена BRICHOS.

2) Созданы генно-инженерные конструкции для экспрессии ареницинов в Е coli в составе различных гибридных белков Получены штаммы-продуценты, позволяющие экспрессировать эти белки с выходом 5 мг/л культуры в пересчете на чистый ареницин

3) Разработана методика выделения генно-инженерного ареницина Показано, что очищенный рекомбинангный пептид полностью идентичен природному по молекулярной массе, аминокислотной последовательности и антимикробной активности

4) Определена полная последовательность кДНК, кодирующая белок-предшественник антимикробного пептида аурелина из сцифоидной медузы Aurelia aunta, и соответствующая ей полная аминокислотная последовательность препроаурелина Показано, что предшественник аурелина обладает структурным сходством с предшественниками дефенсинов и блокаторов калий-селективных каналов из яда морских анемон

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Ovchinnikova T.V., Aleshma G M., Balandin S V, Krasnosdembskaya A D, Markelov M L., Frolova EI, Leonova Y.F., Tagaev A A., Krasnodembsky E G., Kokiyakov V.N. Purification and primary structure of two isoforms of aremcin, a novel antimicrobial peptide from marine polychaeta Aremcola marina // FEBS Letters, 2004, 577(1-2), 209-14

2. Ovchinnikova T.V, Balandin S V, Aleshina G M, Tagaev A A, Leonova Y.F., Krasnodembsky E D, Men'shemn A.V., Kokryakov V.N. Aurelm, a novel antimicrobial peptide from jellyfish Aurelia aurita with structural features of defensins and channel-blocking toxins // Biochem Biophys Res Commun, 2006,348(2), 514-23

3. T.V.Ovchmmkova, Z.O.Shenkarev, К D Nadezhdm, S.V Balandin, M N Zhmak, IA Kudelina, E.LFinkina, V N Kokryakov, and A S Arsemev Recombinant expression, synthesis, purification, and solution structure of aremcin // Biochem Biophys. Res Commun, 2007, v 360, No.l, 156-162

4. Овчинникова T В, Алешина Г M, Баландин С В, Маркелов M Л, Краснодембская А .Д., Кокряков В.Н. Пептиды ареницины, выделенные из морского кольчатого червя Aremcola marina, обладающие антимикробным действием // Патент РФ RU 2261866 Cl от 10.02 2004.

5 Баландин С В , Маркелов M JI, Фролова Е И, Кокряков В H, Овчинникова Т В Структура гена пептидного антибиотика из морского кольчатого червя Aremcola marina II Тезисы докладов и стендовых сообщений XV зимней международной молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". - M, 2003 , С 20

6 Баландин С В , Кокряков В.Н, Овчинникова Т.В. Структура мРНК, кодирующей новый антимикробный пептид из сцифоидной медузы Aurelia aurita И Тезисы докладов и стендовых сообщений XVI зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" -М,2004,С 31

7. Баландин C.B., Кокряков В H, Овчинникова Т В Новые антимикробные пептиды морских беспозвоночных // Тезисы докладов и стендовых сообщений VII чтений, посвященных памяти академикаЮ А Овчинникова -М,2004 - С 31

8. Баландин С В, Кокряков В H, Овчинникова Т В. Структурные исследования новых антимикробных пептидов животного происхождения // Тезисы докладов и стендовых сообщений XVII зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". - M, 2005., С. 31.

9 Баландин C.B., Овчинникова Т В Получение рекомбинантных антимикробных пептидов морских беспозвоночных // Тезисы докладов и стендовых сообщений XVHI зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" - M, 2006, С 29

10 Баландин C.B , Кокряков В Н, Овчинникова Т В Новый антимикробный пептид аурелин из сцифоидной медузы Aurelia aunta определение полной последовательности кДНК, кодирующей препроаурелин, и гетерологичная экспрессия в E.coli // Тезисы докладов и стендовых сообщений VIII чтений, посвященных памяти академика Ю А Овчинникова. - М., 2006 - С 59

11 Баландин С.В., Надеждин К.Д., Шенкарев 3 О, Кокряков В.Н., Арсеньев А С, Овчинникова Т В. Гетерологичная экспрессия и исследование пространственной структуры новых антимикробных пептидов ареницинов // Тезисы докладов и стендовых сообщений XIX зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". - М., 2007, С 23

12. Баландин С.В, Кокряков В Н, Овчинникова Т.В Аурелин Новый антимикробный пептид из медузы Aurelia aunta- определение первичной структуры к ДНК и гетерологичная экспрессия в Е coli // тезисы Четвертого Московского международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития", 2007, С.79-80

13 Надеждин К.Д, Баландин С.В , Шенкарев 3.0, Коряков В Н, Арсеньев А С , Овчинникова Т В. Новые антимикробные пептиды ареницины из морского кольчатого червя Arenicola marina: гетерологичная экспрессия, очистка и исследование пространственной структуры методом ЯМР // Тезисы докладов и стендовых сообщений VIII чтений, посвященных памяти академика Ю А Овчинникова. - М., 2006. - С 65.

Подписано в печать 26 02 2008 г Печать трафаретная

Заказ № 122 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat га

1. Введение.

2. Антимикробные пептиды беспозвоночных (обзор литературы).

2.1. Структура антимикробных пептидов беспозвоночных.

2.1.1. Цистеин-содержащие пептиды.

2.1.1.1. Л Пептиды с CSa|3 структурой.

2.1.1.2. Пептиды, образующие двойной р-складчатый лист.

2.1.1.3. Другие цистеин-содержащие пептиды.

2.1.2. Линейные пептиды с a-спиральной структурой.

2.1.3. Пептиды, обогащенные пролином.

2.1.4. Антимикробные белки, обогащенные глицином.

2.2. Биологическая активность.

2.2.1. Антимикробная активность.

2.2.1.1. Стадии взаимодействия пептидов с мембраной.

2.2.1.2. Механизмы повышения проницаемости мембраны.

2.2.1.3. Селективность мембранотропного действия.

2.2.1.4. Альтернативные механизмы антимикробного действия.

2.2.2. Другие виды активности.

3. Материалы и методы.

3.1. Оборудование.

3.2. Реактивы и расходные материалы.

3.3. Методы.

3.3.1. Выделение суммарной РНК.

3.3.2. Обратная транскрипция и амплификация концов кДНК (RACE).

3.3.3. Клонирование и секвенирование продуктов ПЦР.

3.3.4. Гетерологичная экспрессия антимикробных пептидов.

3.3.4.1. Создание генно-инженерных конструкций.

3.3.4.2. Получение штаммов-продуцентов.

3.3.4.3. Оптимизация условий экспрессии.

3.3.4.4. SDS-электрофорез.

3.3.5. Выделение и очистка рекомбинантных пептидов.

3.3.5.1. Препаративная экспрессия.

3.3.5.2. Получение нерастворимой фракции клеточного белка.

3.3.5.3. Металло-хелатная хроматография.

3.3.5.4. Расщепление гибридных белков.

3.3.5.5. Растворение пептидов.

3.3.5.6. Ультрафильтрация.

3.3.5.7. ВЭЖХ-очистка пептидов.

3.3.5.8. Анализ фракций.

3.3.6. Определение антимикробной активности.

3.3.6.1. Метод радиальной диффузии в твердой питательной среде.

3:3.6.2. Метод серийных разведений в жидкой питательной среде .J.

4. Результаты и обсуждение.

4.1. Определение полных последовательностей кДНК, кодирующих предшественники антимикробных пептидов ареницинов из морского кольчатого червя> Arenicola marina, и соответствующей им полной аминокислотной последовательности препроареницинов.

4:2. Определение полной последовательности к ДНК, кодирующей предшественник антимикробного пептида аурелина из сцифоидной медузы Aurelia aurita, и соответствующей полной аминокислотной последовательности препроаурелина.

4.3. Гетерологичная экспрессия и очистка антимикробных пептидов.

4.3.1. Экспрессия и очистка ареницина-2.

4.3.2. Экспрессия*и очистка буфорина-2.

4.4. Антимикробная активность ареницина-2 и буфорина-2.

Эндогенные антимикробные пептиды (АМП) - эволюционно древние факторы врожденного иммунитета, играющие ключевую роль в< защите многоклеточных организмов от инфекции. Сходные по строению и функции » пептиды были выделены из тканей беспозвоночных и позвоночных животных, а также растений [36; 313]. У беспозвоночных, лишенных лимфоцитарного иммунитета, биосинтез защитных молекул пептидной природы составляет один из главных механизмов противодействия инфекции. К настоящему времени определены структуры более тысячи природных АМП . По мере углубления наших знаний об этих веществах становится все более очевидным и другой аспект их функционирования, состоящий в регуляции иммунных. процессов и регенерации тканей [82; 139)239].

Вся длительная эволюция многоклеточных организмов протекала в непрерывном контакте с патогенной микрофлорой, поэтому наличие эффективных защитных, механизмов было необходимым условием их выживания. Зачастую остается в тени тот факт, что в процессе эволюции лимфоцитарный иммунитет возник с появлением челюстных рыб и, таким образом, существует лишь примерно у 1,5% видов многоклеточных организмов. Но даже те животные, которые обладают способностью вырабатывать антитела, в первые минуты и часы взаимодействия с патогеном вынуждены полагаться только на врожденные механизмы антимикробной защиты. Поэтому поиск и исследование новых АМП у эволюционно древних видов животных является перспективным- для понимания закономерностей

Наиболее полная в настоящее время, специализированная база данных ANTIMIC (http://research.i2r.a-star.edu.sg/Templar/DB/ANTIMIC/) насчитывает около 1700 природных АМП [30]. функционирования врожденного иммунитета у высших позвоночных и человека.

Фундаментальные структурно-функциональные исследования АМП тесно связаны с их важным прикладным значением: природные пептиды могут стать прототипами новых антибиотиков широкого спектра действия, способных решить проблему резистентности к существующим антимикробным средствам. Поразительная генетическая изменчивость и скорость размножения микроорганизмов являются факторами, создающими для человека серьезные проблемы в борьбе с возбудителями инфекционных заболеваний [1]. В связи с этим поиск природных АМП и создание новых пептидных антибиотиков на их основе- являются актуальными задачами современной биологической науки. Традиционно применяемые антибиотики микробного происхождения; решая основную задачу, связанную с инактивацией микроорганизмов, вызывают и ряд нежелательных побочных эффектов, а именно: состояние иммунодефицита, эндотоксемию, повсеместное развитие резистентности со стороны микроорганизмов. Пептидные антибиотики лишены этих недостатков. Более того, многие катионные АМП* обладают эндотоксин-нейтрализующей и иммуномодулирующей активностью. Развитие резистентности патогенов к АМП значительно затруднено, поскольку требует внесения серьезных изменений в структуру и электрофизиологические свойства клеточной мембраны. Являясь факторами, повышающими проницаемость мембраны, АМП усиливают действие традиционно используемых антибиотиков. Все это является предпосылкой для создания антимикробных препаратов на основе природных молекул. Первые представители нового поколения антибиотиков уже проходят клинические испытания [102; 154; 218]. Дальнейшие структурно-функциональные исследования АМП, вырабатываемых различными группами животных, могут внести существенный вклад в развитие этого перспективного направления медико-биологической науки.

Подавляющее большинство известных в настоящее время АМП животного происхождения были выделены из тканей млекопитающих, земноводных и насекомых. Арсенал АМП других классов животных до сих пор остается малоисследованным. Целью нашей работы было изучение структуры и свойств АМП морских беспозвоночных. В качестве объектов исследования были выбраны представители двух типов беспозвоночных: морской червь Arenicola marina [тип - кольчатые черви (Annelida), класс - многощетинковые (Polychaeta)] и медуза Amelia aurita [тип — кишечнополостные, класс — сцифоидные (Scyphzoa)]. В задачи работы входило определение последовательностей кДНК, кодирующих АМП, конструирование систем для их гетерологичной экспрессии, разработка методики выделения и очистки генно-инженерных АМП, а также исследование свойств этих веществ.

6. Выводы

1) Определены полные последовательности кДНК, кодирующих белки-предшественники двух изоформ антимикробных пептидов ареницинов из морского кольчатого червя Arenicola marina, и соответствующие им полные аминокислотные последовательности препроареницина-1 и препроареницина-2. Показано, что последовательности продоменов предшественников ареницинов обладают гомологией со структурой предшественников хондромодулинов позвоночных в области домена BRICHOS.

2) Созданы генно-инженерные конструкции для экспрессии ареницинов в Е. coli в составе различных гибридных белков. Получены штаммы-продуценты, позволяющие экспрессировать эти белки с выходом 5 мг/л культуры в пересчете на чистый ареницин.

3) Разработана методика выделения генно-инженерного ареницина. Показано, что очищенный рекомбинантный пептид полностью идентичен природному по молекулярной массе, аминокислотной последовательности и антимикробной активности.

4) Определена полная последовательность кДНК, кодирующая белок-предшественник антимикробного пептида аурелина из сцифоидной медузы Aurelia aurita, и соответствующая ей полная аминокислотная последовательность препроаурелина. Показано, что предшественник аурелина обладает структурным сходством с предшественниками

- — - дефенсинов* и блокаторов калий-селективных каналов" из' яда" морских анемон.

7. Благодарности

Осуществление данной работы оказалось возможным благодаря помощи многих людей, которым автор выражает свою глубокую признательность.

Автор благодарен своему научному руководителю, заведующей Учебно-научным центром,ИБХ РАН Татьяне Владимировне Овчинниковой, создавшей самые благоприятные условия для работы и поддерживающей в лаборатории атмосферу тепла и понимания.

Хотелось бы выразить благодарность профессору Владимиру Николаевичу Кокрякову, а также сотрудникам лаборатории общей патологии НИИ экспериментальной медицины РАМН (Санкт-Петербург), исследования которых заложили фундамент для данной работы;

Михаилу Леонидовичу Маркелову (ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ) за обучение базисным методам и. непосредственное участие на ранних стадиях исследования (определение структуры кДНК препроареницинов); всем сотрудникам Учебно-научного центра ИБХ РАН за обучение методам лабораторной работы и организационную помощь. Особая благодарность Екатерине Ивановне Финкиной, проводившей анализ антимикробной активности рекомбинантных пептидов; Наталии Ивановне Хорошиловой и Юлии Федоровне Леоновой за секвенирование рекомбинантных пептидов; Светлане Владимировне Кузницовой за синтез олигонуклеотидов, использованных в работе.

5. Заключение

На основании частичных N-концевых последовательностей новых антимикробных пептидов ареницинов из морского кольчатого червя Arenicola marina и аурелина из сцифоидной медузы Amelia aurita нами были определены полные последовательности кДНК, кодирующих белки-предшественники, и соответствующие им полные аминокислотные последовательности препроареницина-1, препроареницина-2 и препроаурелина. Полученные структуры, не проявляя существенной гомологии с известными антимикробными пептидами, обнаружили сходство с представителями двух других функциональных классов пептидов. Сходство препроареницинов- с предшественниками хондромодулинов позвоночных животных ограничивается их одинаковой организацией и гомологией продоменов, но не распространяется на зрелые пептиды, что подтверждает вывод о том, что открытые нами молекулы являются специализированными антимикробными пептидами нового семейства. Гомология препроаурелина с предшественниками токсинов морских анемон и дефенсинов позволяет высказать предположение об их дивергентной эволюции от общего предшественника. Созданные нами системы гетерологичной экспрессии ареницина и буфорина-2 позволяют нарабатывать достаточные количества этих пептидов для проведения широкомасштабных исследований их физико-химических и биологических свойств. Результаты, полученные в ходе работы по экспрессии и анализу биологической активности ареницина-2, говорят об устойчивости его молекулы к повышенным температурам и низким значениям рН, склонности к спонтанному восстановлению природной конформации из денатурированного состояния и способности проявлять антибактериальный эффект при физиологических концентрациях солей.

1. Кокряков В.Н. Биология антибиотиков животного происхождения. СПб.: Наука, 1999.-162 с.

2. Anderluh G., Podlesek Z., Macek P. A common motif in proparts of Cnidarian toxins and nematocyst collagens and its putative role // Biochim. Biophys. Acta. 2000. - Vol. 1476(2). - P.372-376.

3. Andersson M., Boman A., Boman H.G. Ascaris nematodes from pig and human make three antibacterial peptides: isolation of cecropin PI and two ASABF peptides // Cell Mol. Life Sci. 2003. - Vol.60(3). - P.599-606.

4. Ando K., Okada M., Natori S. Purification of sarcotoxin II, antibacterial proteins of Sarcophaga peregrina (flesh fly) larvae // Biochemistry. 1987. - Vol.26(4). -P.226-230.

5. Andra J., Berninghausen O., Leippe M. Cecropins, antibacterial peptides from insects and mammals, are potently fungicidal against Candida albicans // Med. Microbiol. Immunol. (Berl). 2001. - Vol.l89(3). - P.169-173.

6. Arbuzova A., Schwarz G. Pore-forming action of mastoparan peptides on liposomes: a quantitative analysis // Biochim. Biophys. Acta. 1999.

7. Vol. 1420(1-2). P.l39-152^ „

8. Axen A., Carlsson A., Engstrom A., Bennich H. Gloverin, an antibacterial protein from the immune hemolymph of Hyalophora pupae // Eur. J. Biochem. -1997. Vol.247(2). - P.614-619.

9. Azizan A., Holaday N., Neame P.J. Post-translational processing of bovine chondromodulin-I // J. Biol. Chem. 2001. - Vol.276(26). - P.23632-23638.

10. Bals R., Wilson J.M. Cathelicidins--a family of multifunctional antimicrobial peptides // Cell Mol. Life Sci. 2003. - Vol.60(4). - P.711-720.

11. Barrell P.J., Liew O.W., Conner A.J. Expressing an antibacterial protein in bacteria for raising antibodies // Protein Expr. Purif. 2004. - Vol.33(l). - P.153-159.

12. Baumann G., Mueller P. A molecular model of membrane excitability // J. Supramol. Struct. 1974. - Vol.2(5-6). - P.538-557.

13. Bechinger B. Structure and functions of channel-forming peptides: magainins, cecropins, melittin and alamethicin // J. Membr. Biol. 1997. - Vol. 156(3). -P. 197-211.

14. Bendtsen J.D., Nielsen H., von H.G., Brunak S. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0 // J. Mol. Biol. 2004. - Vol.340(4). - P.783-795.

15. Bessin Y., Saint N., Marri L., Marchini D., Molle G. Antibacterial activity and pore-forming properties of ceratotoxins: a mechanism of action based on the barrel stave model // Biochim. Biophys. Acta. 2004. - Vol. 1667(2). - P. 148156.

16. Birkemo G.A., Luders Т., Andersen O., Nes I.F., Nissen-Meyer J. Hipposin, a histone-derived antimicrobial peptide in Atlantic halibut (Hippoglossushippoglossus L~.)7/ BibchimrBiophys. Acta."- 2003Г- Vol:1646(4-2). P.207-" 215.

17. Bland J.M., De Lucca A.J., Jacks T.J., Vigo C.B. All-D-cecropin B: synthesis, conformation, lipopolysaccharide binding, and antibacterial activity // Mol. Cell Biochem. -2001. Vol.218(1-2). - P. 105-111.

18. Blandin S., Moita L.F., Kocher Т., Wilm M;, Kafatos F.C., Levashina E.A. Reverse genetics in the mosquito Anopheles gambiae: targeted disruption of the Defensin gene // EMBO Rep. 2002. - Vol.3(9). - P.852-856.

19. Blaxter M. Caenorhabditis elegans is a nematode // Science. 1998. -Vol.282(5396). - P.2041-2046.

20. Blondelle S.E., Houghten R.A. Probing the relationships between the structure and hemolytic activity of melittin with a complete set of leucine substitution analogs // Pept. Res. -1991. Vol.4(l). - P.12-18.

21. Blondelle S.E., Houghten R.A. Design of model amphipathic peptides having potent antimicrobial activities // Biochemistry. 1992. - Vol.31(50). - P.12688-12694.

22. Boman H.G., Agerberth В., Boman A. Mechanisms of action on Escherichia coli of cecropin PI and PR-39, two antibacterial peptides from pig intestine // Infect Immun. 1993. - Vol.61(7). - P.2978-2984.

23. Boman H.G., Wade D., Boman I.A., Wahlin В., Merrifield R.B. Antibacterial and antimalarial properties of peptides that are cecropin-melittin hybrids // FEBS Lett. 1989. - Vol.259(l): - P.103-106.

24. Bontems F., Roumestand C., Gilquin В., Menez A., Toma F. Refined structure of charybdotoxin: common motifs in scorpion toxins and insect defensins // Science. 1991. - Vol.254(5037). - P.1521-1523.

25. Brahmachary M., Krishnan S.P:, Koh J.L., Khan A.M., Seah S.H., Tan T.W., Brusic V., Bajic V.B. ANTIMIC: a database of antimicrobial sequences // Nucleic Acids Res. 2004. - Vol.32(Database issue). - P.D586-D589.

26. Brogden K.A. Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in- bacteria? // Nat. RevrMicrobiol. 2005; - Vol.3(3).-P.238-250.---

27. Bryksa B;C., MacDonald L.D., Patrzykat A., Douglas S.E., Mattatall N.R. A C-terminal glycine suppresses production of pleurocidin as a fusion peptide in Escherichia coli // Protein Expr. Purif. 2006. - Vol.45(l). - P.88-98.

28. Billet P., Dimarcq J.L., Hetru C., Lagueux M., Charlet M., Hegy G., van D.A., Hoffmann J. A. A novel inducible antibacterial peptide of Drosophila carries an O-glycosylated substitution // J. Biol. Chem. 1993. - Vol.268(20). - P. 1489314897.

29. Bulet P., Hegy G., Lambert J., van D.A., Hoffmann J.A., Hetru C. Insect immunity. The inducible antibacterial peptide diptericin carries two O-glycans necessary for biological activity // Biochemistry. 1995. - Vol.34(22). - P.7394-7400.

30. Bulet P., Stocklin R., Menin L. Anti-microbial peptides: from invertebrates to vertebrates //Immunol. Rev. 2004. - Vol.198 - P. 169-184.

31. Bulet P., Urge L., Ohresser S., Hetru C., Otvos L., Jr. Enlarged scale chemical synthesis and range of activity of drosocin, an O-glycosylated antibacterial peptide of Drosophila // Eur. J. Biochem. 1996. - Vol.238(l). - P.64-69.

32. Bulmer M.S., Crozier R.H. Duplication and diversifying selection among termite antifungal peptides // Mol. Biol. Evol. 2004. - Vol.21(12). - P.2256-2264.

33. Cabiaux V., Agerberth В., Johansson J., Homble F., Goormaghtigh E., Ruysschaert J.M. Secondary structure and membrane interaction of PR-39, a Pro+Arg-rich antibacterial peptide // Eur. J. Biochem. 1994. - Vol.224(3). -P.1019-1027.

34. Caldwell J.E., Abildgaard F., Dzakula Z., Ming D., Hellekant G., Markley J.L. Solution structure of the thermostable sweet-tasting protein brazzein // Nat. Struct. Biol. 1998. - Vol.5(6). - P.427-431.

35. Carlsson A., Nystrom Т., de C.H., Bennich H. Attacin~an insect immune protein—binds LPS and triggers the specific inhibition of bacterial outer-membrane protein synthesis // Microbiology. 1998. - Vol.144 (Pt 8) - P.2179-2188.

36. Casteels P., Ampe C., Jacobs F., Tempst P. Functional and chemical characterization of Hymenoptaecin, an antibacterial polypeptide that is infection-inducible in the honeybee (Apis mellifera) // J. Biol. Chem. 1993. -Vol.268(10). - P.7044-7054.

37. Casteels P., Ampe C., Jacobs F., Vaeck M., Tempst P. Apidaecins: antibacterial peptides from honeybees // EMBO J. 1989. - Vol.8(8). - P.2387-2391.

38. Casteels P., Tempst P. Apidaecin-type peptide antibiotics function through a non-poreforming mechanism involving stereospecificity // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. - Vol.l99(l). - P.339-345.

39. Casteels-Josson K., Capaci Т., Casteels P., Tempst P. Apidaecin multipeptide precursor structure: a putative mechanism for amplification of the insect antibacterial response // EMBO J. 1993. - Vol.l2(4). - P.1569-1578.

40. Castle M., Nazarian A., Yi S.S., Tempst P: Lethal effects of apidaecin on Escherichia coli involve sequential molecular interactions with diverse targets // J. Biol. Chem. 1999. - Vol.274(46). - P.32555-32564.

41. Charlet M., Chernysh S., Philippe H., Hetru C., Hoffmann J.A., Bulet P: Innate immunity. Isolation of several cysteine-rich antimicrobial peptides from theblood of a mollusc, Mytilus edulis // j: ВюГСНегш 1996Г- Vol.27T(36).~ P.21808-21813.

42. Chen H., Xu Z., Xu N., Cen P. Efficient production of a soluble fusion protein containing human beta-defensin-2 in E. coli cell-free system // J. Biotechnol. -2005. Vol.115(3). - P.307-315.

43. Cho J.H., Park C.B., Yoon Y.G., Kim S.C. Lumbricin I, a novel proline-rich antimicrobial peptide from the earthworm: purification, cDNA cloning and molecular characterization//Biochim. Biophys. Acta. 1998. - Vol.l408(l). -P.67-76.

44. Christensen B:, Fink J., Merrifield R.B., Mauzerall D. Channel-forming properties of cecropins and related model compounds incorporated into planar lipid membranes // Proc. Natl. Acad. Sci USA.- 1988. Vol.85(14). - P.5072-5076.

45. Cipakova I., Gasperik J., Hostinova E. Expression and purification of human antimicrobial peptide, dermcidin, in Escherichia coli // Protein Expr. Purif. -2006. Vol.45(2). - P.269-274.

46. Cipakova I., Hostinova E., Gasperik J., Velebny V. High-level expression and purification of a recombinant hBD-1 fused to LMM protein in Escherichia coli // Protein Expr. Purif. 2004. - Vol.37(l). - P.207-212.

47. Clark D.P., Durell S., Maloy W.L., Zasloff M. Ranalexin. A novel antimicrobial peptide from bullfrog (Rana catesbeiana) skin, structurally related to the bacterial antibiotic, polymyxin // J. Biol. Chem. 1994. - Vol.269(14). -P.10849-10855.

48. Cociancich S., Dupont A., Hegy G., Lanot R., Holder F., Hetru C., Hoffmann J.A., Bulet P. Novel inducible antibacterial peptides from a hemipteran insect, the sap-sucking bug Pyrrhocoris apterus // Biochem. J. 1994. - Vol.300 ( Pt 2) -P.567-575.

49. Cociancich S., Ghazi A., Hetru C., Hoffmann J.A., Letellier L. Insect defensin, an inducible antibacterial peptide, forms voltage-dependent channels in Micrococcus luteus // J. Biol. Chem. 1993. - Vol.268(26). - P. 19239-19245.

50. Cole A.M., Ganz Т., Liese A.M., Burdick M.D., Liu L., Strieter R.M. Cutting edge: IFN-inducible ELR- CXC chemokines display defensin-like antimicrobial activity // J. Immunol. 2001. - Vol.l67(2). - P.623-627.

51. Conde R., Zamudio F.Z., Rodriguez M.H., Possani L.D. Scorpine, an anti-malaria and anti-bacterial agent purified from scorpion venom // FEBS Lett. -2000. Vol.471(2-3). - P.165-168.

52. Cornet В., Bonmatin J.M., Hetru C., Hoffinann J.A., Ptak M., Vovelle F. Refined three-dimensional solution structure of insect defensin A // Structure. -1995. Vol.3(5). - P.435-448.

53. Cudic M., Bulet P., Hoffmann R., Craik D:J., Otvos L., Jr. Chemical synthesis, antibacterial activity and conformation of diptericin, an 82-mer peptide originally isolated from insects // Eur. J. Biochem. 1999. - Vol.266(2). - P.549-558.

54. Da S.P., Jouvensal L., Lamberty M., Bulet P:, Caille A., Vovelle F. Solution structure of termicin, an antimicrobial peptide from the termite' Pseudacanthotermes spiniger // Protein Sci. 2003. - Vol. 12(3). - P.438-446.

55. Dathe M., Nikolenko H.,.Meyer J:, Beyermann M., Bienert M. Optimization of the antimicrobial activity of magainin peptides by modification of charge // FEBS Lett. 2001. - Vol.501(2-3). - P.146-150.

56. Dathe M., Wieprecht T. Structural features of helical antimicrobial peptides: their potential to modulate activity on model membranes and biological cells // Biochim. Biophys. Acta. 1999. - Vol. 1462(1-2). - P.71-87.

57. Dempsey C.E. The actions of melittin on membranes // Biochim. Biophys. Acta. 1990. - Vol. 1031(2). - P.143-161.

58. Destoumieux D., Bulet P., Loew D., van D.A., Rodriguez J., Bachere E. Penaeidins, a new family of antimicrobial peptides isolated from the shrimp Penaeus vannamei (Decapoda) // J. Biol. Chem. 1997. - Vol.272(45). -P.28398-28406.

59. Destoumieux D., Bulet P., Strub J.M., van D.A., Bachere E. Recombinant expression and range of activity of penaeidins, antimicrobial peptides from penaeid shrimp // Eur. J. Biochem. 1999. - Vol.266(2). - P.335-346.

60. Dimarcq J.L., Bulet P., Hetru C., Hoffmann J. Cysteine-rich antimicrobial peptides in invertebrates //Biopolymers. 1998. - Vol.47(6). - P.465-477.

61. Dubovskii P.V., Volynsky P.E., Polyansky A.A., Chupin V.V., Efremov R.G., Arseniev A.S. Spatial structure and activity mechanism of a novel spider antimicrobial peptide // Biochemistry. 2006. - Vol.45(35). - P.10759-10767.

62. Durr M., Peschel A. Chemokines meet defensins: the merging concepts of chemoattractants and antimicrobial peptides in host defense // Infect Immun.2002. Vol.70(12). - P.6515-6517.

63. Durr M., Peschel"A."Chemokines meet defensins: the merging concepts of chemoattractants and antimicrobial peptides in host defense // Infect Immun. -2002. Vol.70(12). - P.6515-6517.

64. Dushay M.S., Roethele J.B., Chaverri J.M., Dulek D.E., Syed S.K., Kitami Т., Eldon E.D. Two attacin antibacterial genes of Drosophila melanogaster // Gene. 2000. - Vol.246(l-2). - P.49-57.

65. Ehret-Sabatier L., Loew D., Goyffon M., Fehlbaum P., Hoffmann J.A., van D.A., Bulet P. Characterization of novel cysteine-rich antimicrobial peptides from scorpion blood // J. Biol. Chem. 1996. - Vol.271(47). - P.29537-29544.

66. Eipper B.A., Milgram S.L., Husten E J., Yun H.Y., Mains R.E. Peptidylglycine alpha-amidating monooxygenase: a multifunctional protein with catalytic, processing, and routing domains // Protein Sci. 1993. - Vol.2(4). - P.489-497.

67. Engel J. EGF-like domains in extracellular matrix proteins: localized signals for growth and differentiation? // FEBS Lett. 1989. - Vol.251(1-2). - P. 1-7.

68. Fernandes J.M., Molle G., Kemp G.D., Smith V.J. Isolation and characterisation of oncorhyncin П, a histone HI-derived antimicrobial peptide from skin secretions of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss // Dev. Сотр. Immunol. -2004. Vol.28(2). - P.127-138.

69. Fogaca A.C., da S.P., Jr., Miranda M.T., Bianchi A.G., Miranda A., Ribolla P.E., Daffre S. Antimicrobial activity of a bovine hemoglobin fragment in the tick Boophilus microplus // J. Biol. Chem. 1999. - Vol.274(36). - P.25330-25334.

70. Friedrich C.L., Moyles D., Beveridge T.J., Hancock R.E. Antibacterial action ofstructurallyjdiverse cationic peptides on gram-positive bacteria // Anthnicrob.

71. Agents Chemother. 2000. - Vol.44(8). - P.2086-2092.

72. Frommel C. The apolar surface area of amino acids and its empirical correlation with hydrophobic free energy // J. Theor. Biol. 1984. - Vol. 111 (2). - P.247-260.

73. Froy O., Gurevitz M. Arthropod and mollusk defensins—evolution by exon-shuffling // Trends Genet. 2003. - Vol.l9(12). - P.684-687.

74. Fujitani N., Kawabata S., Osaki Т., Kumaki Y., Demura M., Nitta K., Kawano K. Structure of the antimicrobial peptide tachystatin A // J. Biol. Chem. 2002. -Vol.277(26). - P.23651-23657.

75. Fujiwara S., Imai J., Fujiwara M., Yaeshima Т., Kawashima Т., Kobayashi К. A potent antibacterial protein in royal jelly. Purification and determination of the primary structure of royalisin // J. Biol. Chem. 1990. - Vol.265(19). - P.11333-11337.

76. Furukawa S., Taniai K., Ishibashi J., Hara S., Shono Т., Yamakawa M. A novel member of lebocin gene family from the silkworm, Bombyx mori // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. - Vol.23 8(3). - P.769-774.

77. Gordon Y.J., Romanowski E.G., McDermott A.M. A review of antimicrobial peptides and their therapeutic potential as anti-infective drugs // Curr. Eye Res.- 2005. Vol.30(-7). - P.505-515.--------------------------- --------

78. Halverson Т., Basir Y.J., Knoop F.C., Conlon J.M. Purification and characterization of antimicrobial peptides from the skin of the North American green frog Rana clamitans // Peptides. 2000. - Vol.21(4). - P.469-476.

79. Hancock R.E., Chappie D.S. Peptide antibiotics // Antimicrob. Agents Chemother. 1999. - Vol.43(6). - P.1317-1323.

80. Hancock R.E., Scott M.G. The role of antimicrobial peptides in animal defenses // Proc. Natl. Acad. Sci USA.- 2000. Vol.97(16). - P:8856-8861.

81. Hanzawa H., Shimada I., Kuzuhara Т., Komano H., Kohda D., Inagaki F., Natori S., Arata Y. 1H nuclear magnetic resonance study of the solution conformation of an antibacterial protein, sapecin // FEBS Lett. 1990. -Vol.269(2). - P.413-420.

82. Hara S., Yamakawa M. Production in Escherichia of moricin, a novel type antibacterial peptide from the silkworm, Bombyx mori // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. - Vol.220(3). - PI664-669.

83. Hara S., Yamakawa M. Moricin, a novel type of antibacterial peptide isolated from the silkworm, Bombyx mori // J. Biol. Chem. 1995. - Vol.270(50).1. P.29923-29927.

84. Hara S., Yamakawa M. A novel antibacterial peptide family isolated from the silkworm, Bombyx mori // Biochem. J. 1995. - Vol.310 ( Pt 2) - P.651-656.

85. Haught C., Davis G.D., Subramanian R., Jackson K.W., Harrison R.G. Recombinant production and purification of novel antisense antimicrobial peptide in Escherichia coli // Biotechnol. Bioeng. 1998. - Vol.57(l). - P.55-61.

86. Hedengren-Olcott M., Olcott M.C., Mooney D.T., Ekengren S., Geller B.L., Taylor B.J. Differential activation of the NF-kappaB-like factors Relish and Difin Drosophila melanogaster-by fungi and Gram-pоsitive bacteriaV/JrBiol:

87. Chem. 2004. - Vol.279(20). - P.21121-21127.

88. Hemmi H., Ishibashi J., Hara S., Yamakawa M. Solution structure of moricin, an antibacterial peptide, isolated from the silkworm Bombyx mori // FEBS Lett. 2002. - Vol.518(1-3). - P.33-38.

89. Hetru C., Letellier L., Oren Z., Hoffmann J.A., Shai Y. Androctonin, a hydrophilic disulphide-bridged non-haemolytic anti-microbial peptide: a plausible mode of action // Biochem. J. 2000. - Vol.345 Pt 3 - P.653-664.

90. Hill C.P., Yee J., Selsted M.E., Eisenberg D. Crystal structure of defensin HNP-3, an amphiphilic dimer: mechanisms of membrane permeabilization // Science. 1991. - Vol.251(5000). - P.1481-1485.

91. Hiraki Y., Shukunami C. Chondromodulin-I as a novel cartilage-specific growth-modulating factor//Pediatr Nephrol. 2000. - Vol. 14(7). - P.602-605.

92. Hirono M., Suzuki N., Tanakadate A., Yoshioka T. Sapecin В alters kinetic properties of rapidly inactivating K(+) channels in rat pituitary GH(3) cells // Cell Physiol Biochem. 2000. - Vol. 10(4). - P. 177-186.

93. Hoffinann R., Bulet P., Urge L., Otvos L., Jr. Range of activity and metabolic stability of synthetic antibacterial glycopeptides from insects // Biochim. Biophys. Acta. 1999. - Vol. 1426(3). - P.459-467.

94. Hoover D.M., Chertov O., Lubkowski J. The structure of human beta-defensin-1: new insights into structural properties of beta-defensins // J. Biol. Chem. -2001. Vol.276(42). - P.39021-39026.

95. Huang H.W. Action of antimicrobial peptides: two-state model //

96. Biochemistry. 2000. - Vol.39(29). - P.8347-8352.- -- - - ---

97. Hubert F., Noel Т., Roch P. A member of the arthropod defensin family from edible Mediterranean mussels (Mytilus galloprovincialis) // Eur. J. Biochem. -1996. Vol.240(l). - P.302-306.

98. Hughes A.L. Evolutionary diversification of the mammalian defensins // Cell Mol. Life Sci. 1999. - Vol.56(l-2). - P.94-103.

99. Hultmark D., Engstrom A., Andersson K., Steiner H., Bennich H., Boman H.G. Insect immunity. Attacins, a family of antibacterial proteins from Hyalophora cecropia // EMBO J. 1983. - Vol.2(4). - P.571-576.

100. Hwang S.W., Lee J.H., Park H.B., Pyo S.H., So J.E., Lee H.S., Hong S.S., Kim J.H. A simple method for the purification of an antimicrobial peptide in recombinant Escherichia coli // Mol. Biotechnol. 2001. - Vol. 18(3). - P.193-198.

101. Iijima R., Kurata S., Natori S. Purification, characterization, and cDNA cloning of an antifungal protein from the hemolymph of Sarcophaga peregrina (flesh fly) larvae // J. Biol. Chem. 1993. - Vol.268(16). - P.12055-12061.

102. Isaacson Т., Soto A., Iwamuro S., Knoop F.C., Conlon J.M. Antimicrobial peptides with atypical structural features from the skin of the Japanese brown frog Rana japonica // Peptides. 2002. - Vol.23(3). - P:419-425.

103. Ishikawa M., Kubo Т., Natori S. Purification and characterization of a diptericin homologue from Sarcophaga peregrina (flesh fly) // Biochem. J. -1992. Vol.287 ( Pt 2) - P.573-578.

104. Iwai H., Nakajima Y., Natori S., Arata Y., Shimada I. Solution conformation of an antibacterial peptide, sarcotoxin IA, as determined by 1H-NMR // Eur. J. Biochem. 1993. - Vol.217(2). - P.639-644.

105. Jang W.S., Kim K.N., Lee Y.S., Nam M.H., Lee I.H. Halocidin: a new antimicrobial peptide from hemocytes of the solitary tunicate, Halocynthia aurantium //FEBS Lett. 2002. - Vol.521(l-3). - P.81-86.

106. Jerala R., Porro M. Endotoxin neutralizing peptides // Curr. Top Med. Chem. -2004. Vol.4(ll). - P. 1173-1184.

107. Johns R., Sonenshine D.E., Hynes W.L. Identification of a defensin from the hemolymph of the American dog tick, Dermacentor variabilis // Insect Biochem. Mol. Biol. 2001. - Vol.31(9). - P.857-865.

108. Kamysz W., Okroj M., Lukasiak J. Novel properties of antimicrobial peptides // Acta Biochim. Pol. 2003. - Vol.50(2). - P.461-469.

109. Kang D., Lundstrom A., Steiner H. Trichoplusia ni attacin A, a differentially displayed insect gene coding for an antibacterial protein // Gene. 1996. -Vol. 174(2). - P.245-249.

110. Kato Y., Aizawa Т., Hoshino H., Kawano K., Nitta K., Zhang H. abf-1 and abf-2, ASABF-type antimicrobial peptide genes in Caenorhabditis elegans // Biochem. J. 2002. - Vol.361(Pt 2). - P.221-230.

111. Kato Y., Komatsu S. ASABF, a novel cysteine-rich antibacterial peptide isolated from the nematode Ascaris suum. Purification, primary structure, and molecular cloning of cDNA // J. Biol. Chem. 1996. - Vol.271(48). - P.30493-30498.

112. Kim D.H., Lee D.G., Kim K.L., Lee Y. Internalization of tenecin 3 by a fungal cellular process is essential for its fungicidal effect on Candida albicans // Eur. J. Biochem. 2001. - Vol.268(16). - P.4449-4458.

113. Kim H.K., Chun D.S., Kim J.S., Yun C.H., Lee J.H., Hong S.K., Kang D.K. Expression of the cationic antimicrobial peptide lactoferricin fused with the anionic peptide in Escherichia coli // Appl Microbiol. Biotechnol. 2006. -Vol.72(2).P.330-338.

114. Kim J., Park J.M., Lee В.J. High-level expression and efficient purification of the antimicrobial peptide gaegurin 4 in E-coli // Protein Pept. Lett. 1997. -Vol.4(6). - P.391-396.

115. Kim S.H., Wang R., Gordon D.J., Bass J., Steiner D.F., Lynn D.G., Thinakaran G., Meredith S.C., Sisodia S.S. Furin mediates enhanced production of fibrillogenic ABri peptides in familial British dementia //Nat. Neurosci. 1999.- Vol.2(l 1). P.984-988.

116. Kobayashi S., Chikushi A., Tougu S., Imura Y., Nishida M., Yano Y., Matsuzaki K. Membrane translocation mechanism of the antimicrobial peptide buforin 2 //Biochemistry. 2004. - Vol.43(49). - P.15610-15616.

117. Kobayashi S., Chikushi A., Tougu S., Imura Y., Nishida M., Yano Y., Matsuzaki K. Membrane translocation mechanism of the antimicrobial peptide buforin 2 // Biochemistry. 2004. - Vol.43(49). - P.15610-15616.

118. Kobayashi S., Hirakura Y., Matsuzaki K. Bacteria-selective synergism between the antimicrobial peptides alpha-helical magainin 2 and cyclic beta-sheet tachyplesin I: toward cocktail therapy // Biochemistry. 2001. - Vol.40(48). -P.14330-14335.

119. Koczulla A.R., Bals R. Antimicrobial peptides: current status and therapeutic potential //Drugs. 2003. - Vol.63(4). - P.389-406.

120. Komano H., Homma K., Natori S. Involvement of sapecin in embryonic cell proliferation of Sarcophaga peregrina (flesh fly) // FEBS Lett. 1991. -Vol.289(2). - P.167-170.

121. Koo S.P., Bayer A.S., Yeaman M.R. Diversity in antistaphylococcal mechanisms among membrane-targeting antimicrobial peptides // Infect Immun. 2001. - Vol.69(8). - P.4916-4922.

122. Kragol G., Lovas S., Varadi G., Condie B.A., Hoffmann R., Otvos L., Jr. The antibacterial peptide pyrrhocoricin inhibits the ATPase actions of DnaK andprevents chaperone-assisted protein folding // Biochemistry. 2001. -Vol.40(10). - P.3016-3026.

123. Krebs H.C., Habermehl G.G. Isolation and structural determination of a hemolytic active peptide from the sea anemone Metridium senile // Naturwissenschaften. 1987. - Vol.74 - P.395-396.

124. Krishnakumari V., Nagaraj R. Antimicrobial and hemolytic activities of crabrolin, a 13-residue peptide from the venom of the European hornet, Vespa crabro, and its analogs // J. Pept. Res. 1997. - Vol.50(2). - P.88-93.

125. Kuhn-Nentwig L. Antimicrobial and cytolytic peptides of venomous arthropods //Cell Mol. Life Sci. 2003. - Vol.60(12). - P.2651-2668.

126. Kuhn-Nentwig L., Muller J., Schaller J., Walz A., Dathe M., Nentwig W. Cupiennin 1, a new family of highly basic antimicrobial peptides in the venom of the spider Cupiennius salei (Ctenidae) // J. Biol. Chem. 2002. - Vol.277(13). - P.11208-11216.

127. Kuliopulos A., Walsh C.T. Production, Purification, and Cleavage of Tandem Repeats of Recombinant Peptides // J. Am Chem. Soc. 1994. - Vol.l 16 -P.4599-4607.

128. Landon C., Sodano P., Hetru C., Hoffmann J., Ptak M. Solution structure of drosomycin, the first inducible antifungal protein from insects // Protein Sci. -1997. Vol.6(9). - P.1878-1884.

129. Leclerc V., Reichhart J.M. The immune response of Drosophila melanogaster //Immunol. Rev. 2004. - Vol.198 - P.59-71.

130. Lee I.H., Cho Y., Lehrer R.I. Effects of pH and salinity on the antimicrobial properties of clavanins // Infect Immun. 1997. - Vol.65(7). - P.2898-2903.

131. Lee I.H., Zhao C., Cho Y., Harwig S.S., Cooper E.L., Lehrer R.I. Clavanins, alpha-helical antimicrobial peptides from tunicate hemocytes // FEBS Lett. -1997. Vol.400(2). - P.158-162.

132. Lee I.H., Zhao C., Nguyen Т., Menzel L., Waring A.J., Sherman M.A., Lehrer R.I. Clavaspirin, an antibacterial and haemolytic peptide from Styela clava // J. Pept. Res. 2001. - Vol.58(6). - P.445-456.

133. Lee J.H., Hong S;S., Kim S.C. Expression of an Antimicrobial Peptide Magainin by a Promoter Inversion System // J. Microbiol. Biotechnol. 1998. -Vol.8(l). - P.34-41.

134. Lee J.H., Kim M.S., Cho J.H., Kim S.C. Enhanced expression of tandem multimers of the antimicrobial peptide buforin II in Escherichia coli by the DEAD-box protein and trxB mutant // Appl Microbiol. Biotechnol. 2002. -Vol.58(6). - P.790-796.

135. Lee J.H., Minn I., Park C.B., Kim S.C. Acidic peptide-mediated expression of the antimicrobial peptide buforin П as tandem repeats in Escherichia coli // Protein Expr. Purif. 1998. - Vol. 12(1). - P.53-60.

136. Lee J.Y., Boman A., Sun C.X., Andersson M., Jornvall H., Mutt V., Boman H.G. Antibacterial peptides from pig intestine: isolation of a mammalian cecropin. // Proc.LNal!.Acad.Sci U.S.A.- 1989. --Vol-.86(23).- P.9159-9162. -- .

137. Lee P.H., Ohtake Т., Zaiou M., Murakami M., Rudisill J.A., Lin K.H., Gallo R.L. Expression of an additional cathelicidin antimicrobial peptide protectsagainst bacterial skin infection // Proc. Natl. Acad. Sci USA.- 2005. -Vol.l02(10). P.3750-3755.

138. Lee S.Y., Moon H.J., Kurata S., Natori S., Lee B.L. Purification and cDNA cloning of an antifungal protein from the hemolymph of Holotrichia diomphalia larvae // Biol. Pharm Bull. 1995. - Vol.l8(8). - P.1049-1052

139. Lee Y.J., Chung T.J., Park C.W., Hahn Y., Chung J.H., Lee B.L., Han D.M., Jung Y.H., Kim S., Lee Y. Structure and expression of the tenecin 3 gene in Tenebrio molitor // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. - Vol.218(l). -P.6-11.

140. Lee Y.T., Kim D.H., Suh J.Y., Chung J.H., Lee B.L., Lee Y., Choi B.S. Structural characteristics of tenecin 3, an insect antifungal protein // Biochem. Mol. Biol. Int. 1999. - Vol.47(3). - P.369-376.

141. Lehrer R.I., Barton A., Daher K.A., Harwig S.S., Ganz Т., Selsted M.E. Interaction of human defensins with Escherichia coli. Mechanism of bactericidal activity // J. Clin Invest. 1989. - Vol.84(2). - P.553-561.

142. Lemaitre В., Nicolas E., Michaut L., Reichhart J.M., Hoffmann J.A. The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults // Cell. 1996. - Vol.86(6). - P.973-983.

143. Levashina E.A., Ohresser S., Bulet P., Reichhart J.M., Hetru C., Hoffmann J.A. Metchnikowin, a novel immune-inducible proline-rich peptide from Drosophila with antibacterial and antifungal properties // Eur. J. Biochem. -1995. Vol.233(2). - P.694-700.

144. Li C., Song L., Zhao J., Zhu L., Zou H., Zhang H., Wang H., Cai Z. Preliminary study on a potential antibacterial peptide derived from histone H2A in hemocytes of scallop Chlamys farreri // Fjsh Shellfish Immunol. 2006.

145. Li L., Kim Y.S., Hwang D.S., Seo J.H., Jung H.J., Du J., Cha HJ. High and compact formation of baculoviral polyhedrin-induced inclusion body by co-expression of baculoviral FP25 in Escherichia coli // Biotechnol. Bioeng. 2006.

146. Li Y., Li X., Wang G. Cloning, expression, isotope labeling, and purification of human antimicrobial peptide LL-37 in Escherichia coli for NMR studies // Protein Expr. Purif. 2006. - Vol.47(2). - P.498-505.

147. Liu G., Kang D., Steiner H. Trichoplusia ni lebocin, an inducible immune gene with a downstream insertion element // Biochem. Biophys. Res. Commun. -2000. Vol.269(3). - P.803-807.

148. Ludtke S.Ji, He K., Heller W.T., Harroun T.A., Yang L., Huang H.W. Membrane pores induced by magainin // Biochemistry. 1996. - Vol.35(43). -P.13723-13728.

149. Lundstrom A., Liu G., Kang D;, Berzins K., Steiner H. Trichoplusia ni gloverin, an inducible immune gene encoding an antibacterial insect protein // Insect Biochem. Mol. Biol. 2002. - Vol.32(7). - P.795-801.

150. Mackintosh J.A., Gooley A.A., Karuso P.H., Beattie A.J., Jardine D.R., Veal D.A. A gloverin-like antibacterial protein is synthesized in Helicoverpa armigera following bacterial challenge // Dev. Сотр. Immunol. 1998. - Vol.22(4).1. P.3 87-399.

151. Mackintosh J.A., Veal D.A., Beattie A.J., Gooley A. A. Isolation from an ant Myrmecia gulosa of two inducible O-glycosylated proline-rich antibacterial peptides // J. Biol. Chem. 1998. - Vol.273(l 1). - P.6139-6143.

152. Majerle A., Kidric J., Jerala R. Production of stable isotope.enriched. —antimicrobial peptides in Escherichia coli: an application to the production of a 15N-enriched fragment of lactoferrin // J. Biomol NMR. 2000. - Vol. 18(2). -P.145-151.

153. Мак P., Wojcik K., Silberring J., Dubin A. Antimicrobial peptides derived from heme-containing proteins: hemocidins // Antonie Van Leeuwenhoek. -2000. Vol.77(3). - P. 197-207.

154. Makrides S.C. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli // Microbiol. Rev. 1996. - Vol.60(3). - P.512-538.

155. Malev V.V., Schagina L.V., Gurnev P.A., Takemoto J.Y., Nestorovich E.M., Bezrukov S.M. Syringomycin E channel: a lipidic pore stabilized by lipopeptide? // Biophys. J. 2002. - Vol.82(4). - P.l985-1994.

156. Mandard N., Bulet P., Caille A., Daffre S., Vovelle F. The solution structure of gomesin, an antimicrobial cysteine-rich peptide from the spider // Eur. J. Biochem. 2002. - Vol.269(4). - P.l 190-1198.

157. Martemyanov K.A., Shirokov V.A., Kurnasov O.V., Gudkov A.T., Spirin A'.S. Cell-free production of biologically active polypeptides: application to the synthesis of antibacterial peptide cecropin // Protein Expr. Purif. 2001. -Vol.21(3). - P.456-461.

158. Martemyanov K.A., Spirin A.S., Gudkov A.T. Synthesis, cloning and expression of genes for antibacterial peptides: Cecropin, magainin and bombinin // Biotechnology Letters. 1996. - Vol.l8(12). - P.1357-1362.

159. Martemyanov K.A., Spirin A.S., Gudkov A.T. Direct expression of PCR products in a cell-free transcription/translation system: synthesis of antibacterial- peptide cecropinV/FEBS Lett:-1997r-Voi:4r4(2);-P.268-270:

160. Matsuzaki K. Why and how are peptide-lipid interactions utilized for self-defense? Magainins and tachyplesins as archetypes // Biochim. Biophys. Acta. -1999. Vol.1462(1-2). - P.l-10.

161. Matsuzaki K., Murase O., Fujii N., Miyajima K. An antimicrobial peptide, magainin 2, induced rapid flip-flop of phospholipids coupled with poreformation and peptide translocation // Biochemistry. 1996. - Vol.35(35). -P.11361-11368.

162. Matsuzaki K., Nakamura A., Murase O., Sugishita K., Fujii N., Miyajima K. Modulation of magainin 2-lipid bilayer interactions by peptide charge // Biochemistry. 1997. - Vol.36(8). - P.2104-2111.

163. Matsuzaki K., SugishitaK., Ishibe N., Ueha M., Nakata S., Miyajima K., Epand R.M. Relationship of membrane curvature to the formation of pores by magainin 2 //Biochemistry. 1998. - Vol.37(34). - P. 11856-11863.

164. Matsuzaki K., Yoneyama S., Fujii N., Miyajima K., Yamada K., Kirino Y., Anzai K. Membrane permeabilization mechanisms of a cyclic antimicrobial peptide, tachyplesin I, and its linear analog // Biochemistry. 1997. - Vol.36(32). - P.9799-9806.

165. Matz M., Shagin D., Bogdanova E., Britanova O., Lukyanov S., Diatchenko L., Chenchik A. Amplification of cDNA ends based on template-switching effect and step-out PCR // Nucleic Acids Res. 1999. - Vol.27(6). -P:i558-1560.

166. McManus A.M., Dawson N.F., Wade J.D., Carrington L.E., Winzor;D.J., Craik -D.J. Three-dimensional structure of RK-1: a novel alpha-defensin peptide // Biochemistry. 2000. - Vol.39(51). - P. 15757-15764.

167. McPhee J.B., Hancock R.E. Function and therapeutic potential of host defence peptides// J. Pept. Sci. 2005. - Vol.ll(l 1). - P.677-687.

168. Michaelson D., Rayner J., Couto M., Ganz T. Cationic defensins arise from charge-neutralized propeptides: a mechanism for avoiding leukocyte autocytotoxicity? // J. Leukoc Biol. 1992. - Vol.51(6). - P.634-639.

169. Minagawa S., Ishida M.-fNagashimaYr, Shiomi K: Primary structure of "a potassium channel toxin from the sea anemone Actinia equina // FEBS Lett. -1998. Vol.427(l). - P.149-151.

170. Mitta G., Hubert F., Noel Т., Roch P. Myticin, a novel cysteine-rich antimicrobial peptide isolated from haemocytes and plasma of the mussel Mytilus galloprovincialis // Eur. J. Biochem. 1999. - Vol.265(l). - P.71-78.

171. Moon W.J., Hwang D.K., Park E.J., Kim Y.M., Chae Y.K. Recombinant expression, isotope labeling, refolding, and purification of an antimicrobial peptide, piscidin // Protein Expr. Purif. 2007. - Vol.51(2). - P.141-146.

172. Morassutti C., De A.F., Bandiera A., Marchetti S. Expression of SMAP-29 cathelicidin-like peptide in bacterial cells by intein-mediated system // Protein Expr. Purif. 2005. - Vol.39(2). - P.160-168.

173. Morikawa N., Hagiwara K., Nakajima T. Brevinin-1 and -2, unique antimicrobial peptides from the skin of the frog, Rana brevipoda porsa // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. - Vol.l89(l). - P.184-190.

174. Morin K.M., Arcidiacono S., Beckwitt R., Mello C.M. Recombinant expression of indolicidin concatamers in Escherichia coli // Appl Microbiol. Biotechnol. 2005. - P. 1-7.

175. Mouhat S., Jouirou В., Mosbah A., De W.M., Sabatier J.M. Diversity of folds in animal toxins acting on ion channels // Biochem. J. 2004. - Vol.378(Pt 3). -P.717-726.

176. Nakajima Y., Ogihara K., Taylor D., Yamakawa M. Antibacterial hemoglobin fragments from the midgut of the soft tick, Ornithodoros moubata (Acari: Argasidae) // J. Med. Entomol. 2003. - Vol.40(l). - P.78-81.

177. Nakajima Y., van der Goes van Naters-Yasui, Taylor D., Yamakawa M. Antibacterial peptide defensin is involved in midgut immunity of the soft tick, Ornithodoros moubata // Insect Mol. Biol. 2002. - Vol.11(6). - P.611-618.

178. Nakayama K. Furin: a mammalian subtilisin/Kex2p-like endoprotease involved in processing of a wide variety of precursor proteins // Biochem. J. 1997. -Vol.327 (Pt3)-P.625-635.

179. Nielsen H., Engelbrecht J., Brunak S., von Heijne G. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites // Protein Eng. 1997.- Vol.lO(l). - P.l-6.

180. Oishi O., Yamashita S., Nishimoto E., Lee S., Sugihara G., Ohno M./-Conformations and orientations of aromatic amino acid residues of tachyplesin I in phospholipid membranes // Biochemistry. 1997. - Vol.36(14). - P.4352-4359:1. V •* '

181. Omecinsky D.O., Holub K.E., Adams M.E., Reily M.D. Three-dimensional structure analysis of mu-agatoxins: further evidence for common motifs among neurotoxins with diverse ion channel specificities // Biochemistry. 1996. -Vol.35(9). - P.2836-2844.

182. Oppenheim J.J;, Biragyn A., Kwak L.W., Yang D. Roles of antimicrobial peptides such as defensins in innate and adaptive immunity // Annals of the Rheumatic Diseases. 2003. - Vol.62(90002). - P.17H-21.

183. Orsi N. The antimicrobial activity of lactoferrin: current status and perspectives // Biometals. 2004. - Vol.l7(3). - P.189-196.

184. Otvos L., Jr. The short proline-rich antibacterial peptide family // Cell Mol. Life Sci. 2002. - Vol.59(7). - P. 1138-1150.

185. Otvos L., Jr., О I, Rogers M.E., Consolvo P.J., Condie B.A., Lovas S., Bulet P., Blaszczyk-Thurin M. Interaction between heat shock proteins and antimicrobial peptides // Biochemistry. 2000. - Vol.39(46). - P.14150-14159.

186. Pal S., Schmidt A.P., Peterson E.M., Wilson C.L., de la Maza L.M. Role of matrix metalloproteinase-7 in the modulation of a Chlamydia trachomatis infection // Immunology. 2006. - Vol.117(2). - P.213-219.

187. Pan Т., Groger H., Schmid V., Spring J. A toxin homology domain in an astacin-like metalloproteinase of the jellyfish Podocoryne carnea with a dual role in digestion and development // Dev. Genes Evol. 1998. - Vol.208(5). - P.259-266.

188. Park C.B., Kim M.S., Kim S.C. A novel antimicrobial peptide from Bufo bufo gargarizans // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. - Vol.218(l). - P.408-413.

189. Park C.B., Kim M.S., Kim S.C. A novel antimicrobial peptide from Bufo bufo gargarizans //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. - Vol.218(l). - P.408-413.

190. Park I.Y., Park C.B., Kim M.S., Kim S.C. Parasin I, an antimicrobial peptide derived from histone H2A in the catfish, Parasilurus asotus // FEBS Lett. 1998.- Vol.437(3). P.258-262.

191. Park S., Park S.H., Ahn H.C., Kim S., Kim S.S., Lee В J., Lee В J. Structural study of novel antimicrobial peptides, nigrocins, isolated from Rana nigromaculata // FEBS Lett. 2001. - Vol.507(l). - P.95-100.

192. Patat S.A., Carnegie R.B., Kingsbury C., Gross P.S., Chapman R., Schey K.L. Antimicrobial activity of histones from hemocytes of the Pacific white shrimp // Eur. J. Biochem. 2004. - Vol.271(23-24). - P.4825-4833.

193. Pennington M.W., Mahnir V.M., Khaytin I., Zaydenberg I., Byrnes M.E., Kem W.R. An essential binding surface for ShK toxin interaction with rat brain potassium channels // Biochemistry. 1996. - Vol.35(51). - P. 16407-16411.

194. Pierce J.C., Maloy W.L., Salvador L., Dungan C.F. Recombinant expression of the antimicrobial peptide polyphemusin and its activity against the protozoan oyster pathogen Perkinsus marinus // Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1997. -Vol.6(3). - P.248-259.

195. Piers K.L., Brown M.H., Hancock R.E. Recombinant DNA procedures for producing small antimicrobial cationic peptides in bacteria // Gene. 1993. -Vol.l34(l). - P.7-13.

196. Pillai A., Ueno S., Zhang H., Kato Y. Induction of ASABF (Ascaris suum -antibacterial factor)-type antimicrobial peptides by bacterial injection: novel members of ASABF in the nematode Ascaris suum// Biochem. J. 2003. -Vol.371 (Pt 3). - P.663-668.

197. Pillai A., Ueno S., Zhang H., Lee J.M., Kato Y. Cecropin PI and novel nematode cecropins: bacteria-inducible antimicrobial peptide family in the nematode Ascaris suum // Biochem. J. 2005.

198. Ponti D., Mignogna G., Mangoni M.L., De B.D., Simmaco M., Barra D. Expression and activity of cyclic and linear analogues of esculentin-1, an antimicrobial peptide from amphibian skin // Eur. J. Biochem. 1999. - Vol.263(3). -P.921-927.

199. Presnail J.K., Weng Z., Wong J.F., inventors. E.I. du Pont DeNemours and Company (Wilmington, DE), assignee. Arthropod defensins of Scolopendra canidens, Vaejovis carolinianus, and Argiope spp. // US Pat. № 6777592, C07K 14/435, 17.08.2004

200. Pyo S.H., Lee J.H., Park H.B., Cho J.S., Kim H.R., Han B.H., Park Y.S. Expression and purification of a recombinant buforin derivative from Escherichia coli // Process Biochemistry. 2004. - Vol.39(l 1). - P.1731-1736.

201. Rabel D., Charlet M., Ehret-Sabatier L., Cavicchioli L., Cudic M., Otvos L., Jr., Bulet P. Primary structure and in vitro antibacterial properties of the

202. Drosophila melanogaster attacin С Pro-domain // J. Biol. Chem. 2004. -Vol.279(15). - P.14853-14859.

203. Rao X.C., Li S., Hu J.C., Jin X.L., Ни X.M., Huang J.J., Chen ZJl, Zhu J.M., Hu F.Q. A novel carrier molecule for high-level expression of peptide antibiotics in Escherichia coli // Protein Expr. Purif. 2004. - Vol.36(l). - P. 11-18.

204. Rauer H., Pennington M., Cahalan M., Chandy K.G. Structural conservation of the pores of calcium-activated and voltage-gated potassium channels determined by a sea anemone toxin//J. Biol. Chem. 1999. - Vol.274(31). - P.21885-21892.

205. Rees J. A., Moniatte M., Bulet P. Novel antibacterial peptides isolated from a European bumblebee, Bombus pascuorum (Hymenoptera, Apoidea) // Insect Biochem. Mol. Biol. 1997. - Vol.27(5). - P.413-422.

206. Reily M.D., Thanabal V., Adams M.E. The solution structure of omega-Aga-IVB, a P-type calcium channel antagonist from venom of the funnel web spider, Agelenopsis aperta // J. Biomol NMR. 1995. - Vol.5(2). - P.122-132.

207. Relf J.M., Chisholm J.R., Kemp G.D., Smith V.J. Purification and, characterization of a cysteine-rich 11.5-kDa antibacterial protein from the granular haemocytes of the shore crab, Carcinus maenas // Eur. J. Biochem. -1999. Vol.264(2). - P.350-357.

208. Rojtinnakorn J., Hirono I., Itami Т., Takahashi Y., Aoki T. Gene expression in haemocytes of kuruma prawn, Penaeus japonicus, in response to infection with WSSV by EST approach // Fish Shellfish Immunol. 2002. - Vol.l3(l). - P.69-83.

209. Romeo D., Skerlavaj В., Bolognesi M., Gennaro R. Structure and bactericidal activity of an antibiotic dodecapeptide purified from bovine neutrophils // J. Biol. Chem. 1988. - Vol.263(20). - P.9573-9575.

210. Rudresh, Jain R., Dani V., Mitra A., Srivastava S., Sarma S.P., Varadarajan R., Ramakumar S. Structural consequences of replacement of an alpha-helical Proresidue in Escherichia coli thioredoxin // Protein Eng. 2002. - Vol. 15(8). -P.627-633.

211. Sadler K., Eom K.D., Yang J.L., Dimitrova Y., Tarn J.P. Translocating proline-rich peptides from the antimicrobial peptide bactenecin 7 // Biochemistry. -2002. Vol.41(48). - P. 14150-14157.

212. Sai K.P., Jagannadham M.V., Vairamani M., Raju N.P., Devi A.S., Nagaraj R., Sitaram N. Tigerinins: novel antimicrobial peptides from the Indian,frog Rana tigerina // J. Biol. Chem. 2001. - Vol.276(4). - P.2701-2707.

213. Salzman N.H., Ghosh D:, Huttner K.M., Paterson Y., Bevins G.L. Protection-against enteric salmonellosis in transgenic mice expressing a human intestinal defensin // Nature. 2003. - Vol.422(6931). - P.522-526.

214. Samakovlis C., Kylsten P., Kimbrell D;A., Engstrom A., Hultmark D. The andropin gene and its product, a male-specific antibacterial peptide in Drosophila melanogaster//EMBO J. 1991. - Vol.lO(l). - P.163-169.

215. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. Molecular Cloning: a laboratory manuals.- 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

216. Sanchez-Pulido L., Devos D.,Valencia A. BRICHOS: a conserved domain in proteins associated with dementia, respiratory distress and cancer // Trends Biochem. Sci. 2002. - Vol.27(7). - P.329-332.

217. Sarmasik A.,. Warr G., Chen T.T. Production of transgenic medaka withincreased resistance to bacterial pathogens // Mar. Biotechnol. (NY). 2002. -Vol.4(3).-P.310-322.

218. Sawai M.V., Jia H.P:, Liu L., Aseyev V., Wiencek J.M., McCray P.B., Jr., Ganz Т., Kearney W.R., Tack B.F. The NMR structure of human beta-defensin-2 reveals a novel alpha-helical segment // Biochemistry. 2001. - Vol.40(13). -P.3810-3816.

219. Schagger H., von J.G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa // Anal Biochem. 1987. - Vol.l66(2). - P.368-379.

220. Schweitz H., Bruhn Т., Guillemare E., Moinier D., Lancelin J.M., Beress L., Lazdunski M. Kalicludines and kaliseptine. Two different classes of sea anemone toxins for voltage sensitive K+ channels // J. Biol. Chem. 1995. -Vol.270(42). - P:25121-25126:

221. Scocchi M., Zelezetsky I., Benincasa M., Gennaro R., Mazzoli A., Tossi A. Structural aspects and biological properties of the cathelicidin PMAP-36 // FEBS J. 2005. - Vol.272(17). - P.4398-4406.

222. Selsted M.E. Theta-defensins: cyclic antimicrobial peptides produced by binary ligation of truncated alpha-defensins // Curr. Protein Pept. Sci. 2004. -Vol.5(5). -P.365-371.V

223. Shai Y. Mechanism of the binding, insertion and destabilization of phospholipid bilayer membranes by alpha-helical antimicrobial and cell nonselective membrane-lytic peptides // Biochim. Biophys. Acta. 1999. -Vol. 1462(1-2). - P.55-70.

224. Shai Y., Oren Z. From "carpet" mechanism to de-novo designed diastereomeric cell-selective antimicrobial peptides // Peptides. 2001. - Vol.22(10). - P. 16291641.

225. Shalev D.E., Мог A., Kustanovich I. Structural consequences of carboxyamidation of dermaseptin S3 // Biochemistry. 2002. - Vol.41(23). -P.7312-7317.

226. Shin S.W., Kokoza V.A., Raikhel A.S. Transgenesis and reverse genetics of mosquito innate immunity // J. Exp Biol. 2003. - Vol.206(Pt 21). - P.3835-3843.

227. Simmaco M., Mignogna G., Barra D., Bossa F. Novel antimicrobial peptides from skin secretion of the European frog Rana esculenta // FEBS Lett. 1993. -Vol.324(2). - P. 159-161.

228. Sipos D., Andersson M., Ehrenberg A. The structure of the mammalian antibacterial peptide cecropin PI in solution, determined by proton-NMR // Eur. J. Biochem. 1992. - Vol.209(l). - P.163-169.

229. Skosyrev V.S., Kulesskiy E.A., Yakhnin A.V., Temirov Y.V., Vinokurov L.M. Expression of the recombinant antibacterial peptide sarcotoxin IA in Escherichia coli cells // Protein Expr. Purif. 2003. - Vol.28(2). - P.350-356.

230. Sorensen O., Cowland J.B., Askaa J., Borregaard N. An ELISA for hCAP-18, the cathelicidin present in human neutrophils and plasma // J. Immunol. Methods. 1997. - Vol.206(l-2). - P.53-59.

231. Steiner H., Andreu D., Merrifield R.B. Binding and action of cecropin and cecropin analogues: antibacterial peptides from insects // Biochim. Biophys. Acta. 1988. - Vol.939(2). - P.260-266.

232. Steiner H., Hultmark D., Engstrom A., Bennich H., Boman H.G. Sequence and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity // Nature. -1981. Vol.292(5820). - P.246-248.

233. Supungul P., Klinbunga S., Pichyangkura R., Jitrapakdee S., Hirono I., Aoki Т., Tassanakajon A. Identification of immune-related genes in hemocytes of black tiger shrimp (Penaeus monodon) // Mar. Biotechnol. (NY). 2002. -Vol.4(5).-P:487-494.

234. Suzuki S., Ohe Y., Okubo Т., Kakegawa Т., Tatemoto K. Isolation and. characterization of novel antimicrobial peptides, rugosins A, B and C, from the skin of the frog, Rana rugosa // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. -Vol.212(l). - P.249-254.

235. Sweet R.M., Eisenberg D. Correlation of sequence hydrophobicities measures similarity in three-dimensional protein structure // J. Mol. Biol. 1983. -Vol.l71(4). - P.479-488.

236. Taguchi S., Nakagawa К., Maeno M., Momose H. In vivo monitoring system for structure-function relationship analysis of the antibacterial peptide apidaecin // Appl Environ Microbiol. 1994. - Vol.60(10). - P.3566-3572.

237. Tanji Т., Ip Y.T. Regulators of the Toll and Imd pathways in the Drosophila innate immune response // Trends Immunol. 2005; - Vol.26(4). - P: 193-198.

238. Taylor S.W., Craig A.G., Fischer W.H., Park M., Lehrer R.I. Styelin D, an extensively modified antimicrobial peptide from ascidian hemocytes // J. Biol. Chem. 2000 -Vol.275(49)! - Р.38417-3842бГ

239. Thomma B.P., Cammue B.P., Thevissen K. Plant defensins // Planta. 2002. -Vol.216(2). - P.193-202.

240. Tokunaga Y., Niidome Т., Hatakeyama Т., Aoyagi H. Antibacterial activity of bactenecin 5 fragments and their interaction with phospholipid membranes // J. Pept. Sci. 2001. - Vol.7(6). - P.297-304.

241. Torres-Larios A., Gurrola G.B., Zamudio F.Z., Possani L.D. Hadrurin, a new antimicrobial peptide from the venom of the scorpion Hadrurus aztecus // Eur. J. Biochem. 2000. - Vol.267(16). - P.5023-5031.

242. Tudor J.E., Pallaghy P.K., Pennington M.W., Norton R.S. Solution structure of ShK toxin, a novel potassium channel inhibitor from a sea anemone // Nat. Struct. Biol. 1996. - Vol.3(4). - P.317-320.

243. Tudor J.E., Pennington M.W., Norton R.S. Ionisation behaviour and solution properties of the potassium-channel blocker ShK toxin // Eur. J. Biochem. -1998. Vol.251(1-2). - P.T33-141.

244. Tzou P., Reichhart J.M., Lemaitre B. Constitutive expression of a single antimicrobial peptide can restore wild-type resistance to infection in immunodeficient Drosophila mutants // Proc. Natl. Acad. Sci USA.- 2002. -Vol.99(4). P.2152-2157.

245. Unger Т., Oren Z., Shai Y. The effect of cyclization of magainin 2 and melittin analogues on structure, function, and model membrane interactions: implication to their mode of action // Biochemistry. 2001. - Vol.40(21). - P.6388-6397.

246. Vargas-Albores F., Yepiz-Plascencia G., Jimenez-Vega F., vila-Villa A.

247. Structuraland functional „differences of Litopenaeus vannamei crustins // Сотр. Biochem. Physiol В Biochem. Mol. Biol. 2004. - Vol. 13 8(4). - P:415-422.

248. Vunnam S., Juwadi P., Merrifield R.B. Synthesis and antibacterial action of cecropin and proline-arginine-rich peptides from pig intestine // J. Pept. Res. -1997. Vol.49(l). - P.59-66.

249. Wade D., Boman A., Wahlin В., Drain C.M., Andreu D., Boman H.G., Merrifield R.B. All-D amino acid-containing channel-forming antibiotic peptides //Proc. Natl. Acad. Sci USA.- 1990. Vol.87(12). - P.4761-4765.

250. Wang F., Fang X., Xu Z., Peng L., Cen P. Fusion expression of human beta-defensin-2 from multiple joined genes in Escherichia coli // Prep Biochem. Biotechnol. 2004. - Vol.34(3). - P.215-225.

251. Wang W., Smith D.K., Moulding K., Chen H.M. The dependence of membrane permeability by the antibacterial peptide cecropin В and its analogs, CB-1 and CB-3, on liposomes of different composition // J. Biol. Chem. 1998. - Vol.273(42). - P.27438-27448.

252. Wang X., Wang X., Zhang Y., Qu X., Yang S. An antimicrobial peptide of the earthworm Pheretima tschiliensis: cDNA cloning, expression and immunolocalization // Biotechnol. Lett. 2003. - Vol.25(16). - P.1317-1323.

253. Wei Q., Kim Y.S., Seo J.H., Jang W.S., Lee I.H., Cha H.J. Facilitation of expression and purification of an antimicrobial peptide by fusion with baculoviral polyhedrin in Escherichia coli // Appl Environ Microbiol. 2005. -Vol.71(9). - P.5038-5043.

254. Welling M.M., Paulusma-Annema A., Baiter H.S., Pauwels E.K., Nibbering P.H. Technetium-99m labelled antimicrobial peptides discriminate between bacterial infections and sterile inflammations // Eur. J. Nucl Med. 2000. -Vol.27(3). - P.292-301.

255. Wicker C., Reichhart J.M., Hoffmann D., Hultmark D., Samakovlis C., Hoffmann J.A. Insect immunity. Characterization of a Drosophila cDNA encoding a novel member of the diptericin family of immune peptides // J. Biol.

256. Chem.-.-1990. Vol.265(36). - P.22493-22498. -- -

257. Wimley W.C., Selsted M.E., White S.H. Interactions between human defensins and lipid bilayers: evidence for formation of multimeric pores // Protein Sci. -1994. Vol.3(9). - P.1362-1373.

258. Winans K.A., King D.S., Rao V.R., Bertozzi C.R. A chemically synthesized version of the insect antibacterial glycopeptide, diptericin, disrupts bacterial membrane integrity // Biochemistry. 1999. - Vol.38(36). - P.l 1700-11710.

259. Wu M., Maier E., Benz R., Hancock R.E. Mechanism of interaction of different classes of cationic antimicrobial peptides with planar bilayers and with the cytoplasmic membrane of Escherichia coli // Biochemistry. 1999. -Vol.38(22). - P.7235-7242.

260. Xu Z., Peng L., Zhong Z., Fang X., Cen P. High-level expression of a soluble functional antimicrobial peptide, human beta-defensin 2, in Escherichia coli // Biotechnol. Prog. 2006. - Vol.22(2). - P.382-386.

261. Xu Z., Wang F., Peng L., Fang X., Cen P. Expression of human beta-defensin-2 with multiple joined genes in Escherichia coli // Appl Biochem. Biotechnol. -2005. Vol.l20(l). - P.l-13.

262. Xu Z., Zhong Z., Huang L., Peng L., Wang F., Cen P: High-level production of bioactive human beta-defensin-4 in Escherichia coli by soluble fusion expression // Appl MicrobioLBiotechnol. 2006. - Vol.72(3). - P.471-479.

263. Yamada K., Natori S. Characterization of the antimicrobial peptide derived from sapecin B, an antibacterial protein of Sarcophaga peregrina (flesh fly) // Biochem. J. 1994. - Vol.298 Pt 3 - P:623-628.

264. Yan H., Hancock R.E. Synergistic interactions between mammalian antimicrobial defense peptides // Antimicrob. Agents Chemother. 2001. -Vol.45(5). -P.1558-1560.

265. Yan L., Adams M.E. Lycotoxins, antimicrobial peptides from venom of the wolf spider Lycosa carolinensis // J. Biol. Chem. 1998. - Vol.273(4). - P:2059-2066.

266. Yang D., Chen Q., Hoover D.M., Staley P., Tucker K.D., Lubkowski J., Oppenheim J.J. Many chemokines including CCL20/MIP-3alpha displayantimicrobial .activity^ IIJ. Leukoc Biol. 2003, - Vol.74(3).-P:448-455.

267. Yang J., Yamamoto M., Ishibashi J., Taniai K., Yamakawa M. Isolation, cDNA cloning and gene expression of an antibacterial protein from larvae of the coconut rhinoceros beetle, Oryctes rhinoceros // Eur. J. Biochem. 1998. -Vol.255(3). - P.734-738.

268. Yang L., Harroun T.A., Weiss T.M., Ding L., Huang H.W. Barrel-stave model or toroidal model? A case study on melittin pores // Biophys. J. 2001. -Vol.81(3). - P.1475-1485.

269. Yang Y., Poncet J., Gamier J., Zatylny C., Bachere E., Aumelas A. Solution structure of the recombinant penaeidin-3, a shrimp antimicrobial peptide // J. Biol. Chem. 2003. - Vol.278(38). - P.36859-36867.

270. Yang Y.H., Zheng G.G., Li G., Zhang X J., Cao Z.Y., Rao Q., Wu K.F. Expression of bioactive recombinant GSLL-39, a variant of human antimicrobial peptide LL-37, in Escherichia coli // Protein Expr. Purif. 2004. - Vol.37(l). -P.229-235.

271. Yang Y.S., Mitta G., Chavanieu A., Calas В., Sanchez J.F., Roch P., Aumelas A. Solution structure and activity of the synthetic four-disulfide bond Mediterranean mussel defensin (MGD-1) // Biochemistry. 2000. - Vol.39(47). -P. 14436-14447.

272. Yang Y.X., Feng Y., Wang B.Y., Wu Q. PCR-based site-specific mutagenesis of peptide antibiotics FALL-39 and its biologic activities // Acta Pharmacol Sin.- 2004. Vol.25(2). - P.239-245.

273. Yeaman M.R., Bayer A.S., Koo S.P., Foss W., Sullam P.M. Platelet microbicidal proteins and neutrophil defensin disrupt the Staphylococcus aureus cytoplasmic membrane by distinct mechanisms of action // J. Clin Invest. 1998.- Vol.lOl(l). P.178-187.

274. Yeaman M.R., Yount N.Y. Mechanisms of antimicrobial peptide action and resistance // Pharmacol Rev. 2003. - Vol.55(l). - P.27-55.

275. Yi G.S., Park C.B., Kim S.C., Cheong C. Solution structure of an antimicrobial peptide buforin II // FEBS Lett. 1996. - Vol.398(l). - P.87-90.

276. Zanetti M. Cathelicidins, multifunctional peptides of the innate immunity // J. Leukoc Biol. 2004. - Vol.75(l). - P:39-48.

277. Zasloff M. Amphibian Antimicrobial Peptides // Peptide antibiotics. Discovery, Modes of Action, and Applications. Dutton C.J., Haxell M.A., McArthur H., and Wax R.G. (Eds.). New York - Basel: Marcel Dekker, Inc., 2002. - P. 243-287.

278. Zhang H., Kato Y. Common structural properties specifically found in the CSalphabeta-type antimicrobial peptides in nematodes and mollusks: evidence for the same evolutionary origin? // Dev. Сотр. Immunol. 2003. - Vol.27(6-7).- P.499-503.

279. Zhang L., Dhillon P., Yan H., Farmer S., Hancock R.E. Interactions of bacterial cationic peptide antibiotics with outer and cytoplasmic membranes of Pseudomonas aeruginosa // Antimicrob. Agents Chemother. 2000. -Vol.44(12).-P.3317-3321.

280. Zhao C., Liaw L., Lee I.H., Lehrer R.I. cDNA cloning of Clavanins: antimicrobial peptides of tunicate hemocytes // FEBS Lett. 1997. -'Vol.410(2-3). - P.490-492.

281. Zhao C., Liaw L., Lee I.H., Lehrer R.I. cDNA cloning of three cecropin-like antimicrobial peptides (Styelins) from the tunicate, Styela clava // FEBS Lett. -1997. Vol.412(l). - P.144-148:

282. Zhong Z., Xu Z., Peng L., Huang L., Fang X., Cen P. Tandem repeat mhBD2 gene enhance the soluble fusion expression of hBD2 in Escherichia coli // Appl Microbiol. Biotechnol. 2006. - Vol.71 (5). - P.661-667.

283. Zhou Y.X., Cao W., Luo Q.P., Ma Y.S., Wang J.Z., Wei D.Z. Production and purification of a novel antibiotic peptide, adenoregulin, from a recombinant Escherichia coli // Biotechnol. Lett. 2005. - Vol.27(10). - P.725-730.