Структурно-функциональное исследование карбоксипептидазы Т THERMOACTNOMYCESVULGARIS тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Московский ордена Ленина ордена Октябрьской Революции и ордена Трудового Красного Знамени государственный университет имени М. В. Ломоносова

Химический факультет

На правах рукописи УДК 577.15.04

СМУЛЕВИЧ СЕРГЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КДРБОНОИПЕПТИДАЗЫ Т THERMOACTItfOllYCES VULGARIS

Специальность — 02.00.10 Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва -= J993

Н 6

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных ми кр оорга ни з мо в.

Научный руководитель — доктор химических наук, профессор В. М. Степанов.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор В. В. Мосолов; кандидат химических наук В. П. Вейко.

Ведущая организация — Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина РАН.

? Я /Т4

Защита, состоится ^ _ 1993 г.

в /5^-^час. на заседании специализированного совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Мое-ковском государственном университете им. М. В. Ломоносова, по адресу: 119899 ГСП, Москва В-234, Ленинские горы, МГУ, лабораторный корпус «А», аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ.

>

Автореферат разослан у . 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

И. Г. СМИРНОВА

Ойщаа гарастерг!сга:га paíkmx

Лпуаль-чосп. проблемы. Шучеине t¡tanu«ni:i;u cipyrrypu и "механизма действия ферментов всегда представляло большой научный интерес Фермеши семейства 2пчадержащи* кир&жшпептвда"! исследуются с ьюиеита идентификации в 1954 году бычьей паикреатачесиой карбохсинеатадазы А - фермента, ашшощегоса классический объектом энзамологеи, одкшл ю наиболее полно шученаи* к настоящему времени.

i кхмот[ы на эти, нексгерые кшшде особенности сгруктурно-фуикциянглышх соилишиешш a Zn-содерхащих. 'сарбоштеишдгзах остаются далеко ие »сними. В настоящее время существуют дез гипотезы относительно механизма каталки. Миогочксяещиле данные рагггеиосгруктурны« и кинетич&гшх иссведоь.ишй ссадемсльсгвуют а пользу Ывдеосновиого катализа. 1$ то ке время, механизм катализа через образование ацилферыента, и;1едсгаш11!011;чйся существенно менее убедительный, нг ыожет считаться окончательно опровергнуты.

До последнего времени шдедшш два типа пераичнай специфичности карйоксинсигмпа»: карбоксипелпвддои А-тииа отцендзют преимущественна ароматические и объемные алш{даичеаше С-концевые аминокисл огы, фермент. !Иииа - остатки с положительно заряженными боктЦии ценами. Однако бактериальные Zn-карбоксипептидазы, иЗиаруженные недавно, проявляют необычную "двойную" ■ первичную специфичность, отщеплен гидрофобные и основные остатки со сравнимой эффективностью. Роли отдельных остатков аминокислот в катализе и структурные ошоьы того или иного (А, В или А+В) типа первичней специфичност щучены до сих пор достаточно слабо.

Таким образом, структурно-функциональное; исследование бактериальной Хл-содержащей карСокашептидазы Т Thmnoacliwmyces vulgañs, обнаруженной и охарая-гершовашшй А.Оетерманом с еаагт, сочатакицей оба типа перяичноа специфичное™, stuiEerca цесьма актуальной задачей.

Целик» работ-м являлось климвроаание структурного гена карОэхсилептиддоы Г ncrinoactinomyces vul&aHs, определение его полной последовательности- и структурно-функциональное нсследонание этого фермента.

Научная ноаазиа в практическая ценаость рабаты. U данной рабагй для определенна иервмчиой структуры карбокшпеш ндазы микроориишэма aiiepitfje применен генно-инженерный подход, »хлючаодцкй получение . ютальной клоногеки генома микроорганизма и клонирование гена

хпр&жапюитидазы. |}<аг ген гглгсю исходным материалом в проводящаяся в настоящее время работяя по напра&лепнему мутатняу фермента я оптимизации его экспрессии, а также может быть ксполыовак. в баотекналогичесэсой скеме для процсссини» геяно-инвсснершно прончеупина."® Дня сравютелмгого сфуктурно-функщииюлыкио анйлта . впероме щепшнаовпны гсс 16 швеегшых к настоящему времени посяедагатепьисхпей 7п содержат)« карбохсипептндаз.

ПуйдвЕЕдяя и гпро&агдая работы. Содержание диссертации onyfinwciKUim в J-x статьях.

OPi.cw в структура работы. Днссср-гацчч состоит т введения, ойюря j»rre¡»aiypsj, тхж« .ценного механизму действия Z-n-cwiepatflmsi* кя[Смтсннектидаз, обсуждения результатов, экспериментальной част, выводе? и анисха щпиропанной литературы. ,

Дксеергациз содержнт2.(з рисунвов и таблиц. Полный о&гем работы иг страниц.

C<v\tp=cniic работы.

1. Клеяироогаис п сстепироваяие структурного ген* с г j>5t) к сип с чтил я оы Т Themwactbwmyces vulgaris

Получение ютальваз алояотегн генома Thermoactinomyres vulginit Для получения клонотеки была использована тотальная ДНК Vfcrmtxiclinomyces vulgaris. В качестве векторной системы был исшик'юглл фюмиднмй вехтор lambda-pSI 5 (Рис. 1). и газонная культура B.roü ОТ И (.suplí. su¡>F, 7'опВ). Фазмидный кехгор содержит в составе идиой мопехудм "«шоразмернун» пдазмиду plJC19 и фратмеот фата hiraMa, досгетячныи дня поддержания днш'-еского р;шнгкя фага. Таким (Уралом, пех-тор lainMü pSI сочетает в себе преимущества фаговых и плаччидных пекгороа. Р.ичер cm молекулы (33 т.н.и.) таков, что кехтор dsn вегапочной 1«кледс>вз|р;н-» к-т мажет поддерживаться в клетке тлпько в нлатмидной rj.-opMc. Клагола)» /тому уже на стадии пол)чения клошпеки при упаковке in viLir. пр/шсходт npauiní гпбор рстмбии.чнтнмх кленов На Рис. 1 прявевена схема экснеримпп;).

Скрининг клодотехн. Дня еяринижа кломотсхи Сыл мпюп>.»<т.ы рздиоактшшо-мечениьт ш-чхькденпый плнгонуклеогидний -;<*;< п синтезированный исходи из установленной ранее ме1«щ>м Jjmiiii гчкпедов.тгелмичти N-конна í|«c;n»ti> белка

--11« Ляп Туг Лчп <;iu Mcl Víi) .

S САП/С) ЛЛПУС) -1ЛГГ/С) АЛ(1/(1) OA(A/fí) AJG Of

J

buaiuiciiiiue u [iciy-iLiu'it; г.ерзд'Шйю асруш.-ша рдешбздшшше фатиди били пгреьедени a плазиидаух) ферму, шлорвив асришшг вил осущестилйя париллйлию и даух cipiuinsx - ДШ£ гибрад<ййц'«шнои, с шзкшземаиисы юнда, и нмцунсфериеишои, с икиишошювм аффздко «мшцеюш* мпкгея кролик» к -¿¡¡¿лоп вдрбшюштмдоз Т. Дча «¡ыилейимк» акал1Ш Сил atrópvi клеи ¡Ю1Ш, дам киша исшошпелишй cm нам нра ijSühx ьармантах ношориого схришииз.

Acia.wnïiyja «мл во Есгапье. Поспе уадквика ииеч фаи» ремрикцаей но сайгам Ваш Ш tn.ua напучена ecrausa -ьтпьй 10 тлл, клпшрозакягл s pUClft У ¡>a>)!i'jare раариктазнога «прчирав&шш шод*и с иосл?ду;ону:м C:iyjéj¡ii-6j!arni¡i¡mi 6¡.jл m-i^uieu мшпи<шшш& ^{япйп рашорлм 1,9 util, ii;6^¡ijyuyií¡!¡y¡;íta с чоихом - lípn l-Eto ÎU фригыеш (Рис. 2а), Ou бил и£';ихя(!!.'1:т«г.:1:г в вс,.ч«рз ю!3шр)8 и ш13ыр19 (шнлрузидо mKRIOS M ш-СПШ, «гогеттее/шо). Определение поыедогателыдкяи ЛИК ме-щцдал Окиср.ч с зондом в качеси-д чаграгк'! огшалось Еслмолиим то.'И-fo ni Kiwcipya.ui.in m К il ¡ >-!, что указывало на ор^гэт-лци.'э гена от taíiia iCj.a Î ¿ lie» Rl. С ыомогцио нилимгразнод цеш-ой реакции (PCX) било о.чргдадгыз расогьыне m- câuacrit, комплементарной юнду (N-конец зрелой.» Оаяка) до З'кшща встшмш (Pi;& 2b). Его величина, - 1,3 тлл. - я сопоставлении с pauso шределехним Aîf ;!üí(;¡<i беяка - 35 klîa - у&иыпала «a n:ui¡kue но фгаиненте lípn 1 - l'.co Rl пшшорашгриого гена карбокашешндзя ; T.

Млеитафакацля белкового продукта глсиирозгивого геаа. После («¡¡«¡делении локализации и ориентации гена Крп í - Iico Rl фрашеит 61.1л нереклонмршан в вектор pUCtlíí под лактошый цюмтг.р (сонструхиия (lOZIiy), Beerepii йлот анапга индуцировании* UTG клеток fi.co'.i, несукух илазмиду |ÁJZI19, с использование!.! кроличьеЛ атисынор./ин к чистой карбок.ипептадаи Т (Рис. :¡¡, показал допшшцтелшуш иммунопопохительиую ншику, мтожение шторой создшловует Mf~4S kDa. Окцифаческах карбокашетидачшш ак-ш'виисп. по cyfcrpary DNl'-GiyOIy-Arg в кул!.т>ралиюй жидодпи клегок Eccili, несущих плашиду pOXi 19, ся-сугстюаяа, однако обра&пка су&шлизшши в прксуклвии субстрата и]я«еодш13 к актшацки бглю-преддисшигшшка и p^cuttiuieiiu») субшуата.

.lüijAtiati uysACu-ruAuaíi нас л «л а a д í ü л ь í < ü .г íl. lipa 1 lica Et фрагмента определилась ыеищам CijJinpa ни диум исиям ДИК с испйаичиьаииеи эз-гр^вик, «.аип^риьашцихы «t» нронггеиноиу its-.i-y (l'v,ï,. 4). Дня лыю.пншелишго подтм'рзои'ния определлемш шямеяииатышннчи t:ískc аи.чъчьатали иру.гтуры ииимдчв Cp'J, полученных шл'де i паралича

Glu-Asp-слецмфичнон прогеиназой, установленные Л.Ш!еш>шй. Структура ссквеиировапного фрагмента приведена на Рис. 5.

Последовательность передана в Базу Данных EMBL, где ей присвоен номер доступа Х56901.

Кодирующая область гена карОохсипетидазы Т (срГ) представлена рамкой считывания (GliFl) длиной 1269 пи, начинающейся кодоком ATG с типичной последовательностью Sliine-Dalgarno (SD1) в 13 пл. перед ним. В сдави с недостатком сведений о сигнала* регуляции транскрипции в термоактиномицетах промоторная область гена не могла быть определена однозначно, однако примерло в 150 пл. перед стартом трансляции нами были обнаружены дел перекрывающихся сегмента, следующие за АТ-обогащенным участком, сходные с некоторыми бациллярными промоторами. В области, фланкирующей OKF) с 3*-конца, не было обнаружено выраженных структур типп "мамка-лстя* характерных дня прокариотичсских терминаторов трапскршщни.

]1срвячнаа структура cpcnposapijoicsnnrraAaaij Т. OR.F1 кодирует предшественник харбоксипентндазм Т с рассчитанной Мг 47,5 k Da, что находится в хорошем соответствии с положением дополнительной полосы на Всстсрн-блоте. Е;х> молекулярная организация вполне типична для предшественников секреторных протеолитических ферментов. Предполагаемый нре-про- сегмент состоит ю S3 аминокислотных остатков, начинаясь с характерного мотива- сигнальных пептидов: три заряженных остатка и следую(Ц1Ш за ними протяженный гидрофобный участок. Несмотря на это, сраанснвд с различными микробными сигнальными пептидами, оказалось недостаточно для точного предсказания сайта отщепления сигнального пептида. По-видимому это связано с необычной субстратной специфичностью сигнальной чептидюы Thtrmoactinomyces.

Сравнение первичной структуры активанионного пстидэ карбоксипеитидазы Т и активационных пептидов к арГкжси г интидаз ю различных источников не выявило сходства между ними. Активационный пептид 1гпцспляет:я в результате протеолиза пептидной связи Gin-Asp, что следует ю N-хоицевой последовательности зрелою белка. Такой сайт нрпцессиша длл зимогрнов из бацилл некззсстен. Однако аминокислотная последовательность зрелой внеклеточной металлокарбоксипентид.-пы Streptomyces griseus - единственного микробного аналога Kaj)GoKcwicinwia.tu Т. известного к настоящему времени - также начинается с Asp. Бссможно, для Thercnoactinomyces и Strepiomyces характерен оаинахотлй необычный пуп-активации.

2. crj»yx4-j{<a3-'î<y!>ïiff0v. IA!.!I!.Í-!

e. s v. г. ; с:/:! гг?лкэ ; i V.

К шпгозвцгму rpwcim <)!;р.-./;ь;ч'ии • wt(si«itK»it¿ i r.'iïï:-. ;u:..!.-.v ¡.:i|/snciiiji!tr,œi (Tluji.!), да:; П..:. '! ¡i П

ti'.'iü:.u и^огг^'и^-л.^пч; ii inpy.;r)¡ u. i "а (.я;.-:

уекашшюшой а Даниил rnfanc титл? акчпхсаытюп ияагедагьr.vai:o.-í:«

ErjÄ-wuinem:u¡i¡u T A.Tm»s»o«b»» (Икмптуг 1:;«:<пзйкм;пîV.ÏÏ) Coí.í.» x::."pjuêiw ce ¡хс/х;;:;":;:^;. По n^ci:'.!><,:.;

y ipSnsciuieitn мо-.&ио подрэ «.warn. аз лда ¡.C-xi.í ■шмваегше иск» "wtœf гзршсяыи wf :» '{тук&Щгал". Грук:-;; иыцсагрмаппих Ka¡;fyj.u-.ii¡ ;яши:н тодоюег йэюпгачидекие «J jpu<ií¿u и фсрменчи ю тучных ¡слеп).;. ^П'ХаьГюкскисиг.здгли ? í и I!, и^яикмаишпв учтете в праитсеии. с <ф»т!№*с>11чм%я '¡'.a';r..:u.!v. пс;тп!д:>:., к

ipyrmy рс1ул:пврг.ь>!.

Cyuiicrï.znnr.î 1>а'шг/.'£;>а_'!;а срасшодсмм* • ферм&пов нриьзеиеиме лшти:: о искаи:и.ме еагалша uap5e«.C'.meinu'&ai! х Л (Y/Jjjiscomb), дало сдомс&иосп» киавип» кьздюхгдостиыг cw^sri: мегашюкарЗоксипеитидх), пргдиоко«иташш • kíi-üus дкг фарм^маакса пространственной структуры и ергсшзацшг 'ostimxuta ц.1я».а paccMaipiiuatMux ферммгов. Прааасчгаме s c¡:auunиидюму aimsny CjiV -фермеша to гаксономическн удаленного ергсшеша - сгахжЗстаует сидг-чел:;:.» остатков, полностью иншриантшх ео паи ссг.ай^кз мсталпокарбокенлепгидап.

¿Енояссгиениис нирзиакпзнвз •. соилвдвиатлА-ьзостсЛ!

иеталлокарбокснкеяткл'-М- Результаты прозедешини ср-литтеаиюго анализа первичных структур метан дока рбокскиептидаз представлены а виде множественного вправникания (Рис. 6) и дерем рассканий (¡Ma.7).

>,îi;o*iu-M,<:m;:;e шрашип.'шке била построено с ¡кшо/ныо еонаиащме-! н|«)|ришли "ОйпгЬге". Прожект сходства шпечтыжша с ломицмо модифицировйннс-î матрицы Oayhoff. Конеерватшилз вка-« - yacmi iivcuMiieitti'im сходства - шлел&лкп» в Еыр&шиодпм ьа спг.чую.иему крикрат: nfwiiein* orojwica не менее 70, тшагна:. finara ив misse 5,5 SU K'ím:;i-;;.j;,i,a;uM'i биокц üjwsmshu иа Гас. t>. Ршшьмсрпю tu раепрелехшиз a tior.:!cj' cv.rrftm «octyx н ¡ncimuoxeusie enano» кекпю^итглмш iu шнершосгл fahwî ra>.5yau ii upmipa: te i шоп иодсли í'paj, iío'díwisctt сделать iijw/jia'Cij^ui»« o cy:uccim-wwr,i cxtiavsti nfiCci¡iaiia№!HíiM« cijiyfrryp i:uír mí* iti/i ( ,'j j fk s к гк ! ; e f n f t,/( í: ï.

Только ¡fi остагкоя иоачоаыо ииваригнтны во тсея сравниваемых каглвдоля'сямгссгах. Примечательно, чю 15 in vnx находятся пчугрн tcoiiccjiaaiiinjiijx Спокоа (!'ис. G).

На дсрсь: раалояияй отчстяиго кыделяетгхя трушш ¡1ис;евзр!ггель;1ых ii регуляюрных (¡х-рмешов. Традиционная класси'фнхзция па ксракчиой ■ сшод-аричносш иг коррелирует прямо со сходстом исрвичных структур фсрммпоп. Так, мсталлс~арбоксипешидази тучных saierox с Д-тииом слепя:] нчпосгн (CpAr.ii,, СрЛШр CpAmm) но структуре ближе к miupeamiccxîiM ф^пиентам В- (Cpl'j,, Cplïr Cp!Jt) а не А- (CpAj,, СрЛ1г CpA2r) типа.

G'ÎÎHCC ¿равпсике ир»гтрЕх:гтве:«!ь« CTjjyrryp

СрТ к С;.-Л. i .'pKiI:ttt-cш(зд укладка цени СрТ (Рис. 3) сходна с укладкой цепи карбохсипсптидач млекопитающих. Наибольшее сходство прхлраиспчмнгыз с-руетур наблюдается в области актнкного центра: остатки, ^ ¡.t ;; ; г. ; i : р у 1 у i; ; ! ; с. каталитический центр C'pT могут быть наложены на соо1гс:хгтную:Д1!е остатки СрА со средним отклонением положений анног, ixciv 0,02? им (¡'не. 9). !кс зилчнгелыю различающиеся элементы структур СрТ н СрА расположены в нерегулярных областях молекулы на отноотгелыю Большом раатолпш: от акгпзиого центра. Единственным исключением КЫ1ЯС1С: рхишчис ь расположении одной ю спиралей, которая тесно связана с я,г.;юм молекулы яг счет многочисленных гидрофобных взаимодействий.

i !икг1;:>гпт;:ие осгатхи: яаталктнчсскнй центр. Сравнение пространственных структур СрТ и СрЛ^ укалывает на общность naja«! ;s!4CCKon> мгхашома этих ферментов. Активный цсьтр расположен на С копце центральной (параллельной) части бегта-слоя. Остатки, существенные дл:- каталки и связывания субстрата были определены та основании многочислен! и>и исследований СрА^, включая криспшлсграфнчсские лсслсдок'.т.д комплексов с аналогами субстратов. Расположение 8 а;.!;п:;;кисл11шых остатков, прелподожятсл ьно участоующих л Армировании каталитического центра СрТ и их вероятные каталитичегкн важные контакты схематически покашш на Рис. 10: остаток Giu?.77 (270 в СрА) участвует s поляризации молекулы воды, необходимой для иуклеофнлмюй атаки на карбгатл субстрата и последующий перенос протона к уходящей группе. Ilis6?(6S), Glu7î(72) и 2Iis20î{lS6) яилякпся лигандами цикла. Л/-g 147(145), Туг255(24Я) и, ешмо^но, Asn346(144), фихсирунл С-коннспэй кэрбоксилат молекулы субстрата. Ион Умf + у част сует в иодяршации молекулы поды и имеете с Argl29(1?.7) сгабилитруст несходное пкгиииис субстрата. Семь го восьми псречисленннх «тагкоп яаляхп'.я инвяри.-шпилми

ui i,cc.\ гютчтмгехыастлк tMuttseiAS-nmuto «ырод^ьшк. П oicfta^t« cjiTcrvrni суш itaT'-;t!!ha:(, cwp«.a.!w».tcs в грталлигацкшмниi кийая r CpT r.»;ia;::.;üiic сгкугка С-ичшееьЗ am.i«wr.cnaru cyiic»;--:iia (i'uc, 5). ьисн.рзда сульфата оСсшуни Batwpiaauic сош г Пи-Л-иы.» Unsui!;: AsgW{l<S>, Туг255{/!!3) н Asal4S(K*). П;«д(к1;:а(а<ят«, чта оглаткн jwiar 1алорсоди.: te-.vf с кйглТоксия.и-р.-.*. cjwsrpara. Сешмьк:» ъал'^ир Туг25~{2 53) .•.u'i'i-'i'.ob.iiio и #iKi:»i:ct.i° аалолгтм, 'fp-riu.1 ¡state,-од с/шяна n.-T!.v-j с fih;2TJ.{Tlti) ц с

t/вксхулзып кади. Четиорчijh пюрззясн a ««prusy

S cr/vji-.-iiSfii-Tj cy.'icTf^ra 1: ¿т „-. : v г; -,-... .-.cm ..; и .

!!nziipuaur.:uo огтгтк-и. Пояпеспы кив^июитиый. i'io'iOS и (и

зт€?! рмдеяе uyMcpa!v:a по СрЛ) расположены ка саксы дкс. аарг пер-.-ичноЛ сиецнфкчиосги в CpAj, и С;<Т. Дпг шх фупздкииалыш: ¡«ш. p-aäi не -предлагала«,. Иипар-.шписяъ экгг ocsütuos в гарСошн.стпдх«!: с различным типом специфичности «си-шиат ьрздпйлажггь, что c:n: i:;; о-сазивагвт ашгмчя на первичную «¡еам-.и-ахнс-». (¡fp: гакьз. Rr (ггц/и;:» к .и» I'miSS-l yr2fl i находи roi n c/i f. о г i i {-<; рм а ц t s; s, в результате чло n-iisi-

иснгот »anpauiieii:;«, oiuSaa 8|*-г:арман, np:i этом исгаток гЛ'шЗЛЗ учасгвуег в фору.ирокнша дна кзрмзш csaui:>au,is. JOj Üi'ü.'uiji Aip25» о'рл; :r. ьодсродную сигм с гмндцини ц:ушшми i-дапшЛ цепи осгл-г.ч:ч ilVjhf: и Yyr2C3, «один» таким «¡¡•{•sKK.t дг.е петлк н 215-255), форакру:сщ:15

Sj'-кармаи. гЛи предполагаем, что tnii кинмшкйсткиз ytacxnyrj? j поддержании иространсчеешшГ» струхчури iJj' карм;,',-! !.

ПгцыаНелч:«.: сстатк«: crpyrtypcu« спас::;,; ¿ncSseä са «цинична rm tapSaccuacirraAsau Т. Рамкчиз в субсфЖмшД специфичяисш СрТ и CpAi, шредел<шпса прсииущссмеиш» иешишшдо мпнккйслшшми заменами и Sj-карманз. Шриа&льниг остатки в ti(yi<i;-.teiU!su 2 S3, 250, 253, 255 и 2йЗ (в гиом ргодеяс - uv-.-pau;ta р.о СрА), (яь'шиз цепа ит«рш отр-аг внухрь Sj' кармана ц or коюрих азвист-иеринчиад шецифкчшюп. кг^кнтапеткдиз, ошечзцы на ».ыожимаекким имраснгвашш. (i'i-c. (,}. Рааисшзуеияе aitsi осшткоз- в . Sj'-napH-iue схеыатичгс&и иилигл-рирум 1'ис. 11. П ТаКэдцв 2 с^ч,|нкриз£.ни |>амач«я в ие]ц."шспс1!имк ncmovetiui» ддз карбиксинеитела'« с |;аэ«ич1н»й

i4it((iiij'i;!4h(:ctmi).

Иридио-псшш к i'yik'iparan с шхпо^шедыю з&р^дешшми С-коицешми аминокислспаыи, щмсанаеиое 1;ьр(7оксшим ■»¡•чашш 11 тана, очъвада«, 1!прсделя1гна ülfiektfkk.tain'iei-iijimw иилыи.даичлиами с огрнцатсяиш г-|(»»е1Шым oci^tkom в Sj' кармане. II СОД, шким ocistiKuu

Asp?.55, KHü-ipnainuMfi в пнисвартслыгых карбоксипешидазая U-те.ча (ТаСл 2). Сражение вариабельных остатков аминокислот г Sj' кармане приводит нас к заключению, что способность мсталлокарбокпшептилаз отщеплять С-концевыс положительно зараженные аминокислоты гсегда зависит сп ирнсугсишя остатка сепаративной кислоты, но ее положение в Sj'-карманс не вллясгсг однепначно определенным. Так, остатку в положении 207 ранее не приписывалось роли в сбразоаанки Kotfranos с Соковой целью субслриа, нескольку в Cp/4j, сто -ганимасг Giy. IJ случае замещения глицина.каким-либо другим остатком бохомя цепь будет направлена внутрй карамана н при сг-тзыланни Молекулы субст ра та расположится блюхо cri его Оохогой цепи Г ¡'. У чясгя ферментов ¡'сгулиг-ориой группы, проявляющих Гкгип специфичности, это положение занижает остаток Asp.

Субстратная специфичности Л-ткпа, выражающаяся с отщеплении ароматических и сОьсмных алифатических аминокислот, коррелирует с появлением остатков iîc и Leu » положениях 243 и 255. У ферментов, проявляющих только А-тин специфичности, нет соответствующею остатка aaispansHOMM темпы, а потому они практически неспособны енщемять положи! алию зарплатные С-концесые аминокислоты.

Бактериальные карбоксипептидазы Ср'Г и CpSG характеризуются уникальным (Л +11) шюм специфичности. Способность этих ферментов отщеплять С-кояцевмс арпинш кли лшнн определяется отрицательно заряженным остатком в положении 253 или 255.

^арбохшпецтндаш (А + В)- и В-тина отличаются от ферментов А-типа огсугстьием 'развепшешшх алифатических радикалов в Sj'-кармане (см. Табл 2). Анализируя вариабельные остатки в положениях 243, 250, 253 и 255 можно отметить меньший размер кармана у карбоксипептидазы Т по сравнению с » карбоксипептндазами. Венду меньшего объема S ¡'кармана нредпсшагастся более прочная и правильная фиксация гидрофобной Соковой цепи в {¡ерметая с двойной специфичностью. Очевидное уменьшение обьема кармана у Ср'Г может также обьяснигь ее предпочтение к разветвленным алифатическим (Leu) по (равнению с ароматическими (Fhe) С-кониевими аминокислотами. Обратное соотношение активностей характерно для СрА^

lJuiiuAM

1. Сконструирована геномная библиотека T.vulgaris, впервые клочир^гсш ген м ei aj i л охарбок сил enгида!ы Т термоакгиломицета.

2. С Помощью Несгерн-бшрт анализа и тестирования по СПС-пифическому субстрату показано, тга в клетках U.coti, карбоксинешида», -Т лкснрсулфН кг

и виде иеаьишюю иредши-твешииа - пргщикароикдшии'и^!^ 1' с Mj. 47,5 kiîa.

3. Установлена нукдеогиднаа носпелователышиь 1924 пар нукдеотмдоь EjiouupoBiiiuoro фрагмента icaoMu Tvulgaiis, содер^ащеи; панш^шмерний ген преддессгкеатка карбохсзпет'иаэты Т длиной 1269 нар нуклешицда. Сспостаелеиием с П-Еошггчсй ноедлдозаюы.от-и '_углшч) '¡«¡¡меша уста': -.¡шеи сайт протеплшкчсской активации бслм-лредшгс-тсшш:::!. В от/;!. ..¡а ст зрлмм карбзисапеитмдааи Т, зм'ивацаати«й neimm Дйшиш 'J3 гиш:деиск<л:лдх oawwa но ммгег «pyarypaoiW сходства с акгмваииошьиш пгитд.ама дорСокашеитиддз >Д1ьатых.

4. Сргни1яе.1ы.'ый аи&пиз Ш!|>ы:чиыи структур кербоясш^итидали Т а 15

m р^чпчии исючшжиь т/лазал, чп» ггфЗгчсскпептэдаза т' хзлнепса отдаленным шшогом (арбошшеипдаз Kîtcomaax, и tiffironitn лрадлолпзигь cyiusmeijuoe ctouciui пространственной таюдкн погатептието"; цепи, подп-грждеапои июсдедсгЕин еристаллырьфическим исследованием ка^Локскпептицаш Т.

5. Ннаарнантткть млшэкислогнмх остатков Еарбииынелтьдети Т, известных как ьошшнеш-ы каталитического цетрл карбсзсшсптлдзил А, да err возможность сделать кизод об опишосга мсхашима катализа эган ферыешьв.

(;. Сравнение амннокимогных octîiikou, фт'рммрующ:«: sap-vish нергдчной специфичное!!!, иш::олило обоснозагь структурные основы дсслнон субстратной специфичности карбзксинсптидазы. Т - наличие ocraixa Asp260 mnunnsei сшвыашь пояожтиш чарякашые С концевые ociutks, а умеиыиеиш.ш nu qiuaueiu'.K) с ^«цйоксннегсгидзм'й И р;нмер Kspuiaiift сносо&.тауегг '¿ффекчиыюиу связыванию i п дроф оби их боковых цепей.

Роульт'аты pa6uii-i отражены в следующих п) Ёшхацмях:

1. S.V&aulevhdi, A.UXterman, OV.Gaipeimu, M.V.Wuu, OXtZagnilta,

U.M.Kadyrov, l.A.Tsaplina, N.V.GrMiin, G.G Chesioukhma, V.MStepanov "Molecular donini' ami (.liuiap/ sttui-tiire ,['!icrr:ji«;iiiio;nycf.s villain. CaslJOtypepliUafe "Г nmloweil with Dual Smiwrale S.Ttiifmty" , IS'M, MiilS let!;:, 14 (, 75-7«.

2. Л иЫепиап, M.VGrishiii, S.VMriultviun, f.l\'.i..kL>, O.PZus.iiUci, !. i' lit. vis: ¡.. V.Mi-itrpiiu^ (!<.> >2) "l'iit,..'iy Ilnicu.ic oi Ои1кх}р?гМкг t\-dtliti.-siiMi of lui» ii«n&!iy i.-!i:vani »^ait.io in /n-carU-^ypspiWase Utility* - h:( fh'tWn ( b:;iï!:!iv, u.' П. (,Г-(,\-т

3. A.Tepiyakov, К.Polyak ov, O.Obmoiova, RSfrokopytoy, IJKuranova, A.ttararman, RGrbhin, S Srnulcvitcli, OZagniiko, O.CJalpcrina, M.Matz, V5tepanorv (1992) "Crystal structure of Onbojypepiidase T from T.vulgarís" - BurJJJiocIiem. vol.208, p." 281-288.

fill

1. Вектор в плззшщкок форме, "рестрикция EcqRI.

3 . Лигитюват1е.

4.Упаковка б капсня m vitro.' Правок отбор оекокбииантЕШх. Ёазкид (43-55k.b).

|

>10-20kb

"" : ! ^Тотальная ДИК, Thcrtnoa ctinomyces vu ¡gals Неполная' рестрикция EcqRI.

ifjc^jLiatinicucnuLiD s XV funmut.

■I >->. ^ -

t V „

5.Инфекция газонной культуры.

Ч

ч

6.Гкбридкзацион• иын скрининг в фаговой форме

7 .Тоанспукцкя в Exali:) Г о отборно Ар при30 С.

8. Позтопнн:! скшшинг i нгал-'нояогкческий и гибриркзациашшй): | отбор клонов, несущих [ ген СрТ.

J

9.Еыделеине анализ ДИК

Рнсуцсж 2. Слегли клонирования гена кавбохсипептидазы Т i ncmiouctwomyces mfcaris

f BamHI) EcoRl Sali PstI Kpni EcoRl Sali EcoR! iBamHi)

À . ■ -i.........! • " "■ : r J

d U С19

i

EcoRl

EcoRl

Kpni <

ш13тр!9

0.5 kb

продукт PCR отсутствует i

PCR продукт размером 13 тля.

Ристиок 2. Л. Рестрихтззная карта вставки, содержащей ген карооксипептидазы Т. В. Локализация с помощью техники PCR гена карбоксипеитидазы Т в рамках фрагмента Eco Rl-Kpn 1

i—» лэ

тз

WPîîTEriN-Г,ЛОГ -iOSit

m*

¿ л

«»M»

Efe?

л ^

О»'

«3 tsi

Г g

Рчсунож 3.SDS-^opea и Вестерн-блот анализ Пелковм« продуктов инлунированных IPTU кпсток E.coli, несущих шнпмилу рО/. 11'Л /..s клетки E.cnli, несущие плазмипу PfÍ/-l !9

.'ft клетки Е.соН, несущие плазмчду ри'Л19 (отрицательный контроль)

I ¡.»«»«ИИ!.4**««««^

<----1.1----|

»------«---|

тел

= |1ггз

Гвсунск 4. Стратегия 01фгде.лет:я последопательност»! сстазки методом КЕРгцааванкя цепи. Стрелкам« изображены фрагменты, чзпгщакеса со стандартных праймероз (50) в праимероз, стггез.'ГОСЖЕНгихся по оетеделениой логлсдозаткльносга (и,Ь).

( АТС* .

[_____ (СО)

ТСл АТС

0.ЧР2

5Э2 ;;

I ,ЕсоШ

пре-про-сегмею

л..*..»

зрелая карооксипептидаза Т

. асс ссс'|аат тса сто.. т Р N 5 ^

ог| г -^-альфа-пептид!

Г:-~уггг. 5. Структура секвенкрованного фрагмента.

JEj

m 20 30 <o so 6D jo OÛ SD

» r, 3 ! H T F N Г Л IT H IL Ç11T H dl 11« H p Q L y s í l f(i GRSÏ tfjRPI YVlKf S f 0.....GSSaPAIVIDLCJ HSR Eui (IJAIGJurAKrf TtNYnqNP

, "t SlDSmïAliHILDEiïfFHOLlVAEMPQL VSKIl)Í GHTÎ t GRPÍIÍVLKFS 16----GTNRPÂIWIDIGHI5R EwvÍQASSVMFf«î tKCTBDBP

r ■ш-птАтиптюттиРсткЫ GSSrtrjRPí'NVLKFSts.....e-DmtvLmMfRtwminvimUMim?

i|( ( 01 perhsyrkïunuf KtVïVIEKHMOKTPtHVSBll'.l g si vediipiyvi. kl geî----ncbrichlf mdceiiiar e«v5p*Ftqwr»y(lAtKTrGRIlK

i, EIACRIISTAlimUNKIVSWIEKMVEKHPEMVSRlrl GSTVEDNPLYVL Kl Gric—-DGEPKAIFHDCGIIIAR EVVSPAFCOVFVYOAAKSYGKHN »^«FlACRHSÏAKYKDWDKtVSUTrKULEKHPEHÏSFIK] GSTVEDNPl YV1 KI Gkk —-CfiEBKAIFHOCGillAR Evi SPHFCOVr «t oaiksygkhk

- ITGIISrt|iï»WnfAUI{5ySFNPDt;555/I G IIFLGNTI YUKyGKC----GS^PAyfWJCEFllAfiEviSPifCflvFVlîMlSrYMFI

■ ASG!lsm;t«?vníÉíiiíÓl)VÁlDHPOHTQSvI G IirEGRtitlïVlkiGKr----RPHmiFIDCGHIARËvÎSPÀFCqJFVREAYRTYKQU

--HDWTSrHtHCFIKAVLDSLAIDTPEI.AÎVEoVGLSYEGRTHKLLKtG»:a----GADKPIH IDGG1HAREwlAPSTVTTIYWfrvSKSATYD

0FP5YDSGYF1HYKEMVHKIHÏVASHYPHiVKKF s! GKSYEGREI-WAVKI S DHVBT-DENEPf Vt YIALhHAtî ElllЛVtHAlYÎLCt FîQNTIitBS -DFPPADSflYHKYAEHNAAIDARIAAHPSlNSKRVl GKTYtJGROVIAVKVSСИУАА-ВЕАЕГЕVIFTAHqIIAREIlLTVEUPiritREl.Gq5YeSDS Я1 OQEDGlSFETIlSYPELKEAl.ïSVifiqCTAISRirTVGRSFEGRELLVIELS OHPEVHEPGÉFEFF Y16NtlHGNEAVGr:ELtIFl»QrLCKEYQKGK Я PQEDGI$FEYHRYPflREALVSV«lQCAAVSRIYTVGRSFEGRELLVLELSD»PSVHEPGFPE|:»YfEfeKHGNEAVBRttl tFt«QYICMEYQM* PI QqEOGISFErHRYPELREAl VSVVI(JCIAISR IY lVG RSF EGRELLVI El.S 0HP6VHEP6EPEFÍ YÎESHHGMEAVERELt!FI AOYtCHIÏOUGH ---------VTFPHHRYDDLVRTL YKVQNECf ùlTRYÍsi GRSVEGRIIL YVLEFSDHPSIHEPLFPtVt Y»GKnilGHE»l6REL)tLQlSEn CEEFRM

......ldffyuftoegheaft.ktvac4yssvthih5ï GKSVKGRNLWVLVVGRrrKEHRIGIPEF» yva4hmgdEiriiRELUKI idylvts-ügto

* *

ico по lío 130 no 150 îeo по

srxaildsi(-^fleivtit?'lgfah^---iiittw»i!trs<tsssl-cvgvdflhrh hbagfgic-agasssfc........setyiir,mnsprevks

rrfFLEIVTff PDCFArTHKr---NJiNyRKiRsniqasL-cvGVDPNRM WÍAGFGH-asassiipc.....--SE7Y»skfp»SEVkWS

• irsLLNTL-dIFLLPVTN PDGYvFsqn—«rmwhktRskrsgsg-cvGVDPNRN Hdahfgg-psasssfc.........sdsyhgpkpnsevEVKS

b mmiCRH- if YILPVFN VDGYiwswTic---«RHyR>;«RsrNÇNSic-ciGTDLHRMFii»s>iNS-iP»Ti(BFC........aokyrosapesekEТКЛ

- iHTutoRK-if YVLPVFN VDGYiwsvrc---cR™e»Rsr»PssbcrGTDLHRN Fo»siras-SPfT(!*PC........(.svrcGPAPtïtKETKA

^TMiicutRii-tfYVLPVFH VDGYivsvT()---cRiiup»:*RsR)i()NST-c!GTDLfiRH Fovsmdsspnihkpc........umGPAFESEtETKA

внт-Lpici-JYyiJ'VV!! lDGlmvTl---iiRRWRKTRsiRAsss-ciGTDlNRH Fdagvcs-isasukpc........ïîiycgsaaesekESKA

4«QlLCEt-0FYVlPVVÍnní7»rFWTi;---0R*WRl;lRsTHAG5S-ClGVRPNKHFllA6»CE-Y6AS5SPC......— SEI fcgpapEsekË ГКД

oítsfiv— «FYVHPTIN PDGY«itfto---driw¡iaRsEr(;sttGcrf¡AdPHRH Wsfkvde-ysasdspc........sbifígfepfsevemrfi

R!IKIV»««-EIYIVFNI N PDGGEroissGs-rKswnK«RQPNS5SS-YvGTOLNRN ïeykvsccggssgsps........SETYRGRJÁFSAPETAA

PIIQAVHGS-EI WIVPDMN PDGGtrDUSGS-riuuaKHRqpNAGss-AvGTnt.NRM Maykvgccggssssps........SEλRGAA*EÎAPETKV

tTivmiHSTRlHWSlH PDGFmAsqPGEUovFVGRsuAO.....-G10UIRN FmoRmvm*EGGpNsHil.wmvi)!;MímpE 1КЛ

EWVeitH*1>IMIMPSLN PDGPeUASQLHlKDVWfíSIIAI).....-G! DLtíRM FpDtDRIïrîBtKEGBPXjiHIlKNiKICIYrJOlî^IAPETKA

itíwnlihstrIH1HPSLN PDGFEttAASOPGELKOurvüBs'KAq.......G10LHRN FpoLDiiiyrvtiE«GGPiiliHUrNur.tvc4!(SKi.ApETKA

t¡»ivpi.iqdtrI HILPSMN POGYeíaaaqgphipgylvgRnkaii......GVÜLHRM Fpdimtyiyt*er.rngpkim—lplp0nv»:s0»rrElRA

«uhiinmlhimpshk pugfeaym—hciysigRehy».....-QYDLHRH Fpo -afey**.....................--issqfETVA

* » **'

■to 190 . гоо гю гго ' гзо г»о

I VdFVMWe.....HfKAftSLK SYSQULYP YGYTTQSimi{UgY*«AYAAtJ5tYST5KY5-.........................5I1T

I VIJFVfsiÍG.....MlKAFlSI II SYSQULYP YGYÎSEPAFWÊL0QlÀÎSA»tÛtSLtl5Tr.FtYG-r--'..........-.........-SUD

IVDFIKSHG.....kvkafiTL H SYSQLLMF P YGYKctkpcofheloeyaqkaaqaHOIlhgtsy^vs..........................Pics

vinf f rSHI n----eikvyltfh SYSQdLIFPrGYrsiClPFIIHtMAKYAKICTDVlSTRYETRYlYG..........................pies

V INF ISSHI»----SIKAYtTFH SYStJMLLFP YGYÎ IKlPPtlHQOllKYARIATOVlSSRyETRYJ TG...........-..............PlAS

,VÍHFIrshIH----SICAYllFH SYSQMI LI P YGYTm_pf!<h[10UKUÇtAmi.STR»er»YIY<i........-..................PIAS ,;

VADf]^««LS----SII(AYlTIJj SYSqHMLjrP YSYDYKLPKHïYFLmAffiAYWASUIGTYYSYG..........................PGAt

LADtlmts— nmiTÎ II SYSl)MM(.YP V S If O tri p E* rfïî *n»*s aa*ÍI"»tl hs гкугм.................-........Ш1

VPIIQILEYA*----HIKVYLTF II SYStJlUMYP VGFÍSOIPODVQOIOÚMMYDUTAYIISTRYEIS----...............--------SSTN

MROFIhsrvkggkooiktuTFH TYSFLIIYP ygytytdvpsdntqodfiiyfktnmhaíjíiisripí).....-..........-.........oaso

VfOFVRSRVVGGAQQITAAlDF II TYSFLVLWP FGYTYKlUSPGKIAMIRIIAFAAVGQieKAASNGlirAE.............-............OSSO

VIIIUIkoIF - - -FH.SAflLH 'GGDLVAMYP YPET.....rsgsahfyssspdwfcsi.ARAíSíFNMMSDf.'irppcímdídssfycgrmga

viiiwihüip......FVLSillLII CGDLVANYP YOET------RsaSAIlFYS$CPC0tIIFqstARArSSFNPPHSDPDRPP«ici13rmssfyegmgaa

V!HWI KClp......FVLSaMLH GGOIVAMYP YOET.....BSGTAKEYSSCPDDAtFqslARATSSRilPYHSOPNRPPCRkitDDOSSFVOnnNGGA

VÍ^WMHSFH......FUSAT«.!! GGAVVANYP VDtíSrtHRyRGYRRrASrPiPOnftFQKIAKViSrAHGlíMFeGtfH-CSOY.....FrOGtrfGAS

VMKWUlU.......FYISaNL H GGALVA5YP FCNr,v---I)AtGAL»SRSLTrD00VFllir|.AHt«ASR«PIIMaGDE--CKtlK4N---rP«r,V1)IG*S

250 2Su Ш

CK iiYQASGGSI О WS*«ль- uVit FF И —......-..........................................................к

c¡>a)r 111 (¡ASGStÍ t! ÜTYsqú-uYSFÍFEl.................................................................к

1-va2, viYQASGPiSIO WAY ou- uYSFAFEl-........................................-.......................e

СрА.з, (lYPISGSSL U МАК titü-uJITFAr E L......-.......-.................................................Б

СрЛи.'" riYKTSGSSLU IWÍCiO-iáiTtíI EL......-.....-....................................................к

Ср1ш nYKISGSSI D IWcifi-nülfFAF Ei......-..........................................................я

СрЬ,. " т lï PASGGSDÎ1VJÄV d;:-ií¥SFTF EL.........-..........-.............-............................

(•¡X t [ i' P A'-uGSÍilj iîSïb^G- Sb'.'SÍ- if Et....................................................—........--Î.

rps' т F V AAAGGSOD UAXscccraYmiEL—.................-............................................я

Ct.7* -lY ITDGDfíIU HMcgM-ílFAf ÎF EHïf.....-...............-......................................-T

C+t"* -lY I IDCSlßU tiU'wc-wFCY'» CtUf........-..........................................-.........s

(.'(>!!(, -ÏY SVPCGKQO EHYLSi-kfEÎT!(ELsc£«M££TUt№CSiimit»ie(itt«6»i!Sf»RSW6Wi«UTisvteisM»îS»-s l'jiiijj -uí SVPCGHOU F¡¡ycss-KÍ4ITVELscu:FfPEETUHVw:3-KBSLlSTii;qiii,íCV»'3fiifi:LPGíi?iA.'¡AUSV£üici¡c'/is.í-.K -kY SVl'CGfl'iö tîiiLSâ iic?ElIYEl.s£tM(>>!:EUiisr.'iCii.iisiiiïiEqihKSifKi»»siC6î.PimTis«csicKïis«--k cVh^ -«Y St.SKGftin FilYiHT-H-f EITLEl scmmuiCTOm^uqFU0»HqwwmrasuMm¥S6t«H0»rss--£ -vYPI QCGK'.jo Y!Uitt-5cFEHLElsfCK»i'6ii(U.psfwiii^iiEttM«a«mq<fDiiK»Pi.taii»E«(iMttUM*«(s»

ilk .л л лд л

asa г»б " asi

Cj.Ab ГШ1 а............—..............--------------------------«шгшшшв'аш.»—...........

Cp-\!f FL Li1 А.....---.........-.....................................sq I IPTAEÊtk'L ALt rffib !)T V^li F ï----------

CpA21 FLLP A......-................................................K0UPIAtETiiL6lKIl«Ei!>i«CI,P»............

(,VAn;b FIX P.......-.............................-.........---......сшкпсгсюмшд&пшт—.......---

CliAiP.j FLL P-----------------......................................ESKlKPICKETiaSVKFiAKÏIltt»JS.............

CpAt!u FLL I1............................-...........................ESRIKPICICETfilSVKFiÂKIfILKfiïS............

Cpu "FllP.........................-......................-.......[551ШНШШШШМК|-""...........

íJi)li( FLIP ..............................................—.......-tsqtaQTCEEmmTimvmiu............

C|)lic Fit P....................................................-•-•—CNQllf>T6£ETFCe«JC*V*HFVK0TVS.............

СрТ FVÍ'F .....-.....^............................................£EVI6«EISIlWíE*VlrVA£KA0CPr5VI6l!S—CSTX

cps£¡ FVPP -.......................................................СЕШшгамод'арпЕшсйтткЕк.т--

срц, lli p gtiiiu.rasïl'iiïunskvîv----------ру5раа...........gvofelesfserlieeekeelhewvsnmsetuf-------------

Cj]K(. LLVP ешШМЛРашИАКШИ...........PISPAV------------RVOFELESfSERKEEEKEELMEWKHNSEUHF —......*—-

C|iHr' It VP CHKI.1A!»?MI -----------PBPAV...........GVSFElESFSERKEEEKEil HEirtKKHSEIlNF..........-•

£-PN¡, " 1 F Gnr.iilAPSïiJFEIlirvUS..........PírPTlVliFHI.kSSlPQíSFVRRAFSRRIiaVRAUQPqiRCtEKCHWll-QiiSPA........

í-f-M," Ut t1 GS»imif!WPS^nfli!TiCtllIP£l;S5:(fSílW:álllPfqa;i031PÍS«PSCPHIPLVíKlPI)H5*»TirPSlfLFl»SllHIfn;......-

t

Miiuaiccrtiüiiuoe ¡.и^-аи^нт.-лс 1.ослсА<мьат^лы1истсй мс гллАокариоьсап^гг; 1! (^^■¡^щййпя питании ij;;-p,.tfniuß i:j-.ím¿ACiiU u Таилице 1. Нумерация ¡n> С

b'l.ii. '.Mi l¡in:,¡..i¿ Ь U1AII (vK.íCIKíi ПГ-CüMUeiEllOl O C\0/>.CIlíd - lípouciíl I ОМиЛиГПИ (>

"O V; ¡t,v.i(íií,ví"i. íi'.íiiiuu С^лес 5.5 Si') выделены ЫлЫПИМП Ii^-IÍOMI'. Puf;.

t^Lfn ijl 1..1.И? -4.; i¡ í 1 .'i ¡í !.¡íi[!c) И (iCl.i-CAOil (ll JA4( ¿I*. V'*.\.> í

в ir . i,¡:.¡ : i,¡.Cp/»j ii [!uAit\viLK¡ ;

■г.......-ми ¡ .-i ;li:íuü íp-í iíjj.ií.Jiiíím. ГК i a i к ti u¡it.Mííi.-.o:».H и:льии íj.i-í in

-и; :¡t. i^iM 'l сл^лунплими ^st.t'i» .t^íl.

{ ) >.. i .s/.ii i [i>¡!.. 1-1Й ÍJ a. i ;> ( м,.л tj'i^it [II,I H'iai.í C'-nr-niítao/i '"'«-ÍI-V.LÍ

í i - i-: j

i ) t.H

r'¡ Ц

г-к

и и иU и и и иииби

J

Щ UJ to. rj

и и

гт

п. il i

и и

е

к.

о

- fr

и ï.

и

fr £

г-

!\(."7>нж У. (Слерсглир.0 Наложение активны» центров >;( ¡Ло; > •>« »••.ч,л Г (темные линии) и к!1р(к|к<ипегпила'ы А ((.нстчые линии) S'^!l. - (учьфат-анион, I ма';',*5," > ноли.

(Н^

Asn 144 Arg i -í 5

\

(".Iii 270 HO-

Z ñ

Hi:,

t.lu. 72 Iiis 69

Г

NM

О.

, с; и о

v

Ч."

Туг 240

/ ?

/■У

-N H--о---

Лги 127

V

Asjj М2

II

О

Pixy.io» 10. Осш pûCRiUio^itHiiii амии.и'иштшы» o¿i&n;i>q,

iipt/.íiaiii.í.^■ tiibho учьеи.унищ-х ü ([¡í)p;.:!íj>o¡:jíii;;i í.:r¡.¡J!t;;i'4Dv..;.H, q:in[j C.'pl и i;* »'¡««¡.¡и.*, пиia:¡iiru'iccKi! ts,.en.is колкил-ы

Аьр 1253

А1а

Рисунок 11.

Предположительное расположение вариабельных аминокислот в Б^'- хармааь.

Позиции пронумерованы и рамках по СрА^; аминокислоты отмечены для Ср'Т. Аминокислоты, предположительно' занимающие указанные позиции в других харйоксииептилазах перечислены и таблице 2.

i a Vt lili.i l. KtipÚót'niiicíírilÜU'Uil, Îlpi|»JliC4CUiJt.tiJ к l j.ÜÜÍ Ш1 UibJl- >f 14 «íUU.'hb

ílii'Aiiii'v^

i:ä,A(( «и''', tíjúiíj í .j" A l.'julbíj t-VAia^

'H

•'Vi' <V.,ii

t:,4.b 4

kit.t^rt. iisii

J'ii

' * V ti £ i .,

!.. ix

í: í j. » K.-h i J.-J

4.,^. »

ryAilíjüi t'ifi't t ti ручные

ÍL£J¿ XCJyAU'lliüJ. JïUkt,.la £lu^jac.W)X>Jíitbíi ...i ai

Jlbi^i S C'l 4Í4WA1Í 1..LI t, i l.-.Ji* ti

ili-'n - iír> ..'i-.l 1 *.

11Ш

niü'tsiä'iua;: лл«»/

í'.líHIllli-S.ii'iíJííi.'íii

A MI

А iii

À Süj

A ït!:

A iC,,1

A 'Ш

U Ï<-j

i; iii i

flíü Jis

л ai i¿S

В 4 i 3

Ii 4 H Ч

|í 4 i,-,

» Ы

i >\.

! аОлица Z. ВариаЬельныс 1мшюшслоты S,'-субсайта Za-cao5oacuncarxíAa3.

гяп > 'íepmeutu i поощ5ш зт.!2?лш1л по cpî, ;

специфичности i ai м s ^ sj а " sa

1 : cpAÍ. : CpA2* CpAm;| ■ СрДш . Сэла 1 г » S3 ! G»r 1 G¡y ; üiy ■ Oly 1 Üiy : Кг j Из i i«'* i üe ! ll£ j Ala i Ais j Al. ; «г ; Tïr 0¡7 5jr aiy Ser Ser lis He He Х.СЭ Lea Tbí таг Aïa Ala Ala

a i ера,, cpat 1 Ser i G!? i Ala aiy ¿ka Tir

i Cf°- ! Ü¡T i Згг 1 Ala G3y d!2 ТЬг

! cpüv cpiî,,, cpB, I éZ2 ¡ Gl7 1 Vil Qij C¡2 Thr

! c?H,t, c?uh : Asa ! Gl? 1 Lea Gly Gla Tir

: А ,Я ; ОТ !/ Gif I Al» i Тir i аз£ Гаг j Thr

. CfSö ' ; Gl-t \ Ser i Tir ; Srr : ¿S3 î Tir