Структурно-функциональное исследование роли домена IV элонгационного фактора G и спирали 34 16S рРНК в процессе транслокации на рибосомах Escherichia coli тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

КУБАРЕНКО АНДРЕЙ ВАЛЕРИЕВИЧ

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ ДОМЕНА IV ЭЛОНГАЦИОННОГО ФАКТОРА G И СПИРАЛИ 34 16S рРНК В ПРОЦЕССЕ ТРАНСЛОКАЦИИ НА РИБОСОМАХ Escherichia со//

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Специальность 02.00.10 - биоорганическая химия

Москва - 2003 г.

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова и в Институте молекулярной биологии университета города Виттен (Германия).

Научные руководители: д.х.н., проф. Донцова Ольга Анатольевна

к.х.н., доц. Сергиев Петр Владимирович

Официальные оппоненты: д.х.н., проф. Тишков Владимир Иванович

д.х.н., проф. Готтих Борис Павлович

Ведущая организация: Институт биоорганической химии

им. М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Защита состоится 25 ноября 2003 г. в 17 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, лабораторный комплекс "А", аудитории 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 20 октября 2003 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Смирнова И.Г.

2oo i?-/)-

Í 62é?

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рибосома является сложным рибонуклеопротеидным комплексом живой клетки, который синтезирует белок, используя в своей работе аминоацил-тРНК и считывая информацию с мРНК. Биосинтез белка является сложным химико-биологическим процессом, на разных стадиях которого с рибосомой взаимодействуют различные факторы трансляции, причем взаимодействие происходит строго определенным образом и с определенными участками рибосомы. Одним из важных процессов в цикле трансляции является транслокация, т.е. перемещение комплекса мРНК-тРНК в рибосоме на один кодон. Этот процесс катализируется элонгационным фактором G (EF-G). В ходе транслокации EF-G взаимодействует с обеими субчастицами рибосомы (30S и 50S). Накоплено много данных о взаимодействии EF-G с 50S субчастицей, однако, молекулярный механизм активации ГТФ-азы EF-G до сих пор неизвестен. Данных о взаимодействии EF-G с 30S субчастицей накоплено немного. Известно, что одним из элементов 30S субчастицы, играющим важную роль в транслокации, является спираль 34 16S рРНК. В данной работе была изучена роль домена IV EF-G и спирали 34 16S рРНК в механизме транслокации мРНК и тРНК на 30S субчастице, а также проведен поиск протонированных нуклеотидов 23S рРНК, которые могут принимать участие в работе функционально важных центров 50S субчастицы. Цель работы:

1. Поиск контакта домена IV EF-G с 30S субчастицей рибосомы с помощью нового варианта метода фотоаффинного химического сшивания компонентов аппарата трансляции;

2. Исследование влияния важных для транслокации нуклеотидов спирали 34 16S рРНК на функционирование рибосомы in vitro на разных этапах трансляции с помощью сайт-направленного мутагенеза этих нуклеотидов;

3. Изучение влияния мутаций в спирали 34 16S рРНК на точность трансляции in vivo\

4. Исследование влияния мутаций в спирали 34 16S рРНК на структуру декодирующего центра и всей 30S субчастицы с помощью химического пробинга;

5. Поиск в рРНК протонированных оснований, имеющих функциональное значение, с помощью нового метода определения протонированных оснований в РНК.

Научная новизна и практическая значимость. Контакты домена IV EF-G с 30S субчастицей Escherichia coli исследовали с помощью нового варианта метода фотоаффинного химического сшивания, разработанного в настоящей работе. Этот метод позволяет сайт-специфически вводить фотометку на поверхность домена IV EF-G. О контактах домена IV с компонентами 30S субчастицы можно судить по образованию сшивок. Было показано, что домен IV EF-G контактирует с элементами

30S субчастицы. Разработанный вариант

сшивания может быть применен для исследования пространственного окружения белков в различных рибонуклеопротеидных комплексах.

Для исследования участия спирали 34 16S рРНК в процессах трансляции, в частности, в транслокации, в настоящей работе методами сайт-направленного мутагенеза заменяли ряд нукпеотидов. Выбор мест мутаций производили на основании данных о консервативности этих нуклеотидов, защитах их от химической модификации и расположению в третичной структуре 30S субчастицы. Таким образом, нарушали природные контакты внутренних элементов спирали 34, а также контакты спирали 34 с другими элементами 30S субчастицы.

Для анализа фенотипа полученных мутантов измеряли скорость роста клеток, точность трансляции in vivo и изучали протекание отдельных этапов трансляции in vitro. В работе использовали спектр кинетических методов, позволяющих исследовать как стационарную, так и престационарную кинетику. Подходы престационарной кинетики (например, метод остановленного потока) позволяют получить информацию об элементарных стадиях механизма функционирования рибосомы на разных этапах трансляции.

В работе был получен ряд мутаций в спирали 34 16S рРНК, оказавшихся нелетальными для клетки. Такие мутантные рибосомы были выделены в чистом виде, без примеси рибосом дикого типа, и исследованы биохимическими и кинетическими методами in vitro.

С помощью химического пробинга было установлено, что мутации в спирали 34 влияют как на локальную структуру декодирующего центра, так и на структуру участков 30S субчастицы, важных для ее взаимодействия с 50S субчастицей.

Таким образом, в работе был применен комплексный подход, основанный на методах определения точности трансляции in vivo и in vitro, а также различных вариантах химического пробинга структуры РНК, позволяющих исследовать роль нуклеотидов рРНК в функционировании рибосомы. Этот подход может быть успешно использован для исследования широкого круга рибонуклеопротеидных комплексов и его разработка является важным этапом в развитии методов изучения процессов трансляции.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на следующих конференциях: VII Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам Ломоносов-2000, Москва, Россия, 2ООО г.; Международная конференция "Trends In Nucleic Acid Chemistry", Москва, Россия, 2000 г.; Международная конференция, посвященная юбилею А.С.Спирина, "Синтез белка", Пущино, Россия, 2001 г.; Международная конференция "The Dinamics of Ribosome Structure arid Function", Квинстаун, Новая Зеландия, 2002 г.; 6-я Международная конференции памяти В.А. Энгельгардта по молекулярной биологии, Москва, Россия, 2003.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 143 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, материалы и методы, выводы. Материал иллюстрирован 74 рисунками и 14 таблицами. Библиографический указатель включает 211 цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Биосинтез белка является сложным химико-биологическим процессом, на разных стадиях которого с рибосомой взаимодействуют различные факторы трансляции, причем взаимодействие происходит строго определенным образом и с определенными участками рибосомы. Некоторые из этих факторов принадлежат к классу G-белков. Их функционирование сопровождается гидролизом GTP, при этом происходит образование GDP и неорганического фосфата P¡. При взаимодействии факторов с рибосомой эта реакция значительно ускоряется.

ГТФ-азы, которые участвуют в трансляции, взаимодействуют с рибосомой на всех этапах биосинтеза белка. Инициаторный фактор 2 (IF2) катализирует связывание инициаторной fMet-TPHK™8' с Р участком рибосомы и дальнейшее связывание 50S субчастицы с 30S инициаторным комплексом. Элонгационный фактор Tu (EF-Tu) отвечает за доставку очередной аминоацил-тРНК в А участок рибосомы, а элонгационный фактор G (EF-G) катализирует перемещение комплекса мРНК-тРНК в рибосоме на один кодон. В свою очередь, фактор терминации 3 (RF3) катализирует освобождение из рибосомы фактора терминации 1 или 2 (RF1 или RF2) после гидролиза пептидил-тРНК в процессе терминации.

До сих пор неизвестен механизм активации ГТФ-азы G-белков, участвующих в процессе трансляции. Однако тот факт, что активация происходит при связывании факторов с рибосомой, позволяет предположить, что рибосома играет важную роль в катализе ГТФ-азной активности факторов трансляции. Исследования показали, что все ГТФ-азы взаимодействуют с рибосомой в одном общем или, по крайней мере, перекрывающихся участках, что, безусловно, справедливо для EF-Tu и EF-G. Следовательно, для рибосомы важной задачей является регуляция и координация связывания и освобождения различных факторов трансляции, при этом рибосома так же катализирует гидролиз GTP на некоторых их них. Эта сложная задача, по всей видимости, достигается при помощи передачи сигнала между различными функциональными центрами рибосомы, что часто бывает связано со значительными структурными перестройками в ней. Данная работа направлена на изучение роли домена IV EF-G и участия спирали 34 16S рРНК в механизме транслокации мРНК-тРНК на 30S субчастице, а также определение роли протежированных оснований рРНК в функционировании рибосомы.

1. Поиск контактов домена IV EF-G с 30S субчастицей

Согласно биохимическим данным и данным криоэлектронной микроскопии, основные участки взаимодействия EF-G с рибосомой находятся на 50S субчастице. Два участка 23S рРНК контактируют с EF-G: район связывания тиострептона (область нуклеотида 1070) и а-сарциновая петля (область нуклеотида 2660). Домен IV фактора EF-G направлен в сторону декодирующего центра 30S субчастицы и, как свидетельствуют данные криоэлектронной микроскопии и результаты химического футпринтинга, может с ним взаимодействовать. Для выявления контактов между EF-G с малой субчастицей рибосомы представляется целесообразным вводить фотоаффинный реагент в домен IV фактора. Для модификации фактора фотоаффинным реагентом использовали ряд мутантных белков, в которых три природных остатка цистеина были заменены на аланин. Кроме того, в каждом из них один из аминокислотных остатков 506, 541, 585 или 591, расположенных на поверхности домена IV, был заменен на цистеин.

В работе использовали два фотоаффинных реагента: п-азидофенацилбромид (АРАВ) и 3-(3-(йодоацетиламино)фенил)-3-(трифторметил) диазирин (TDI). После реакции модификации EF-G очищали от избытка реагента. Выход модификации определяли с помощью реакции свободных SH-групп с 5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойной кислотой) (DTNB). Функциональную активность EF-G после модификации фотореагентами проверяли с помощью пуромицинового теста. Оказалось, что при введении фотореакционной группы функциональная активность факторов элонгации не изменялась. Помимо белков дикого типа в работе использовали белки, содержащие на N-конце участок фосфорилирования протеинкиназой А, необходимый для дальнейшего анализа сшивок.

К модифицированному АРАВ или TDI EF-G добавляли GTP и антибиотик тиострептон или фусидовую кислоту. Для получения функционального рибосомного комплекса с EF-G использовали претранслокационный комплекс рибосомы с мРНК, пептидил-тРНК и деацилированной тРНК. К этому комплексу добавляли модифицированный АРАВ или TDI EF-G. Детектируемый выход сшивки наблюдали для комплексов, образованных в присутствии тиострептона.

Пришивки EF-G к рибосомным белкам анализировали с помощью ультрацентрифугирования и электрофореза. Для анализа продуктов сшивания после облучения в EF-G вводили радиоактивную метку с помощью у-[32Р]-АТР и протеинкиназы А. Кроме того, проводили детекцию с помощью антител к EF-G. Было обнаружено присутствие EF-G во фракциях 30S субчастиц после активации фотометки, что свидетельствует о сшивке EF-G с компонентами малой субчастицы рибосомы. При этом EF-G совыделялся как с 16S рРНК, так и с белками малой субчастицы. Выход сшивки был больше при использовании EF-G с модифицированными аминокислотными остатками 506 и 591 и меньше - в случае остатков 541 и 585.

Следует отметить, что во всех случаях выход реакции фотоаффинного химического сшивания был недостаточным для полной идентификации продуктов сшивки. Это может быть связано с лабильностью комплекса, который EF-G образует с малой субчастицей рибосомы. Можно предположить, что их взаимодействие происходит как серия транзитных контактов, причем на разных этапах в нем могут принимать участие как различные рибосомные белки, так и различные участки 16S рРНК. Это приводит к тому, что, хотя в целом выход реакции сшивания с 30S субчастицей достаточно высок, идентифицировать конкретных участников сшивки на малой субчастице не удается, поскольку на разных этапах сшивка образуется с разными ее компонентами. Наши данные свидетельствуют о наличии контакта домена IV фактора EF-G с малой субчастицей рибосомы в процессе транслокации. Видимо, EF-G вызывает конформационные изменения в малой субчастице рибосом, что облегчает процесс транслокации.

2. Введение мутаций в спираль 34 16S рРНК и изучение влияния этих мутаций на различные стадии процесса трансляции in vitro

Итак, нами было показано, что EF-G взаимодействует с компонентами малой субчастицы, причем, как с белками, так и с 16S рРНК. Известно, что спираль 34 играет важную роль в процессе транслокации. Со спиралью 34 связывается антибиотик спектиномицин, который ингибирует транслокацию. Защита от химической модификации оснований 1054 и 1201 в спирали 34 происходит только в рибосомных комплексах с EF-G, т.е. совпадает с протеканием процесса транслокации. Мутации нуклеотидов 1054, 1057, 1058, 1199 и 1200 16S рРНК существенно влияют на рост клеток за счет ошибочной терминации, уменьшения точности синтеза белка и увеличения частоты сдвига рамки считывания.

Для введения мутаций было выбрано два нуклеотида в спирали 34 - А1191 и А1201 ; один нуклеотид в петле между спиралями 34, 35 и 38 - С1109; и один нуклеотид в спирали 31 - U961 (рисунок 1).

С1109 является высоко консервативным только в пределах одного царства. В литературе было предсказано, что он образует третичный контакт с парой G933-C1384, которая находится в районе шеи 30S субчастицы, но в третичной структуре 30S субчастицы подобного контакта не обнаружили. Однако, такой третичный контакт может образовываться в переходных состояниях во время процесса трансляции и играть важную роль для стабилизации переходных состояний. Для проверки данного предположения было решено заменить нуклеотид С1109 на A, G или U и исследовать, как такая замена будет влиять на прохождение различных стадий трансляции.

1Г \t\-\

И16

«с-®.

О

22Э

Ш И44

Г&Г

к}

| = |11М 1Ю9 и ■ 0С^Ь35 оСаа0 1138

и АСОАОО С О и и А"

» 111111 ( I ■ • и . о иссисо АС О О О У

'и с си и и а 1111111 А О О А А А С

и

1191°

1,34 3 =

О- си" А

Аи-А1201А

А иоАйААи А > N • I I • /ов . ОАсииииоДА а0'/°и0

\ мм» ' ч-<=и е - <

А° 961 " = '

Рисунок 1. А. Вторичная структура 16Э рРНК Е.соН. Отмечены спирали 16 (Мб), 18 (Ь18), 27 (Н27), 34 (Ь34) и 44 (Ь44). Б. Район спирали 34 с выделенными нуклеотидами, по которым вводились мутации.

А1201 не является консервативным. По данным Винтермаера и сотр. при связывании ЕР-в происходит изменение доступности А1201 для химической модификации. В кристаллической структуре он образует две водородные связи с нуклеотидом 11961, который во вторичной структуре, как было предсказано, образует обычную Уотсон-Криковскую пару с А974. Нуклеотид 11961 является очень консервативным и, согласно рентгеноструктурному анализу, образует с А974 одну водородную связь. Образование такого третичного контакта в триплете А1201 -11961-А974 может быть важным для функционирования декодирующего центра 303 субчастицы в процессе транслокации. Для проверки функциональной значимости данных контактов было решено создать три мутанта. В двух из них замены А1201 на и и 11961 на А должны привести к нарушению контактов в этом триплете и, как следствие, изменению функциональной активности таких рибосом. В третьем двойная мутация А1201 и/11961 А должна привести к восстановлению контактов этих нуклеотидов и , как следствие, к нормальному функционированию рибосом.

Третьим местом введения мутации является нуклеотид А1191. Он высоко консервативен и находится в структуре 16в рРНК в районе, в котором сходятся спирали 34, 35 и 38, а также связывается антибиотик спектиномицин. Он образует несколько водородных связей и, скорее всего, важен для стабилизации структуры как декодирующего центра, так и всей ЗОЭ субчастицы. Было решено заменить нуклеотид А1191 на С, О или и.

Мутации в 168 рРНК вводили с помощью сайт-направленного мутагенеза по методу Кункеля. Для этого была использована одноцепочечная урацилсодержащая ДНК фага

-с с сое о 1 I III

СА

С А и

/

АО с — С

М13, несущая ген 16S рРНК. После мутагенеза ген 16S рРНК с мутацией переклонировали в плазмиду pSTL102, содержащую рибосомный оперон ггпВ и получили серию плазмид pSTLxxxx, где хххх - обозначение соответствующей мутации. Были получены восемь плазмид серии pSTLxxxx - pSTLC1109A/U961A, pSTLC1109G, pSTLAI 191С, pSTLAI 191G, pSTLA1191U, pSTLA1201U, pSTLU961A и pSTLA1201 U/U961A.

Для получения популяции рибосом, содержащих только мутантную 16S рРНК без примеси 16S рРНК дикого тйва, использовали А7 штамм (МС250), в котором делетированы все семь рибосомных оперонов. Плазмидами, несущими мутации, в этом штамме замещали исходную ггп плазмиду, являющуюся единственным источником

рРНК в А7 штамме. В качестве контролей использовали штамм МС250, трансформированный плазмидой

pSTL102 или pLK35, несущей немутированный рибосомный оперон. Для всех полученных штаммов были определены времена удвоения клеток, а также рассчитаны относительные скорости роста (величина обратная времени -удвоения, нормированная на скорость роста штамма MC250-pSTL102, рисунок 2). Видно, что в случае мутации A1191G клетки растут медленнее всего.

При выделении рибосом, несущих мутацию A1191G, оказалось, что в условиях стандартного выделения рибосом (5.25 мМ Mg2+), 70S рибосомы полностью диссоциируют на 30S и 50S субчастицы. Для предотвращения диссоциации 70S рибосом все дальнейшие выделения проводили при концентрации Мд2+ равной 21 мМ как в буфере для лизиса клеток, так и в градиенте концентрации сахарозы. После выделения 70S рибосом или 30S субчастиц, гомогенность препарата рибосом/субчастиц определяли с помощью реакции обратной транскрипции (RT-анализа), который показал, что все выделенные образцы рибосом содержат только мутантные 30S субчастицы и не содержат 30S субчастиц дикого типа.

Для оценки влияния концентрации Мд2+ на степень ассоциации субчастиц образцы рибосом, содержащих мутантную 16S рРНК, анализировали с помощью ультрацентрифугирования в градиенте концентрации сахарозы при различной концентрации Мд2+. Результаты эксперимента представлены на рисунке 3. Видно, что больше всего нарушает ассоциацию субчастиц мутация A1191G. Так же в значительной степени на ассоциацию субчастиц влияют мутации C1109A/U961A, A1191U и U961A.

о <

Рисунок 2. Относительные скорости роста клеток штамма MC250-pSTLxxxx.

100% 90% 80% 70% 60% 50%

I I

г- 4-

ESS E , I E

wt (K35)

1- t ■

C1109A U961A

2 S

в в

S E S E E E *"" Si

A1191U

S S E E

A1201U U9B1A

Рисунок 3. Зависимость степени диссоциации 70S рибосом от концентрации Mg +. Столбец серого цвета - доля 70S рибосом, столбец черного цвета - доля 30S субчастиц, wt - рибосомы дикого типа, выделенные из клеток E.coli MRE600.

Такое поведение мутантных рибосом может быть связано с тем, что мутации в спирали 34, с одной стороны, приводят к изменению структуры 30S субчастицы (например, меняется взаимное расположение головы и тела 30S субчастицы) и, как следствие, нарушению взаимодействия рибосомных субчастиц. С другой стороны, мутации могут влиять на локальную структуру одного или нескольких участков 30S субчастицы (16S рРНК), ответственных за контакт субчастиц, или декодирующего центра.

Следующим этапом работы была проверка способности мутантных рибосом образовывать инициаторный комплекс in vitro. Эффективность инициации проверяли при стандартной концентрации Мд2+ - 7 мМ (рисунок 4).

Поскольку 70S рибосомы, несущие мутации С1109A/U961A, A1191U и U961A, диссоциировали при 7 мМ Mg2+, а при увеличении концентрации ионов магния ассоциация субчастиц

улучшалась, было решено проверить влияние концентрации

Мд2

на

Рисунок 4. Эффективность инициации трансляции для различных мутантных рибосом при концентрации Мд2+ 7 мМ и времени инкубации 1 час.

инициации.

эффективности

инициаторного

эффективность Максимум образования комплекса для

рибосом с мутациями А119Ю, А1191 и и и961А сдвинут в сторону более высокой концентрации Мд2+ (порядка 10 мМ). Полученные данные позволяют сделать вывод, что мутации не влияют на процесс

инициации как таковой. Уменьшение эффективности инициации на рибосомах с мутациями A1191G, A1191U и U961A при 7 мМ Мд2+ по сравнению с другими обусловлено диссоциацией 70S рибосом.

Мутации в спирали 34, с одной стороны, могут изменять локальную структуру декодирующего центра 30S субчастицы и тем самым влиять на связывание антикодоновой шпильки аа-тРНК. С другой стороны, мутации в спирали 34 могут приводить к нарушению передачи сигнала от декодирующего центра 30S субчастицы к функционально важным участкам 50S субчастицы, с которыми происходит связывание EF-Tu и аминоацилированного конца аа-тРНК, и, как следствие, нарушать связывание всего тройного комплекса с рибосомой, стимуляцию ГТФ-азной активности EF-Tu или связывание освободившейся из комплекса с EF-Tu аа-тРНК.

Эффективность связывания аа-тРНК с А участком рибосомы определяли по образованию дипептида. Если связывание и позиционирование аа-тРНК на рибосоме происходит правильным образом, то аминоацилированный конец тРНК располагается в пептидилтрансферазном центре таким образом, что становится возможным образование пептидной связи. Как оказалось, образование пептидной связи происходит приблизительно с одинаковой эффективностью для всех мутантных рибосом и лишь незначительно хуже, чем для рибосом дикого типа. Следовательно, в мутантных рибосомах связывание аминоацилированного конца аа-тРНК в пептидилтрансферазном центре, функционирование пептидилтрансферазного центра и образование пептидной связи не затронуто мутациями. Важные данные о влиянии мутаций в спирали 34 16S рРНК на точность связывания аа-тРНК и функционирование декодирующего центра 30S субнастицы можно получить, проверяя связывание с А участком аа-тРНК, с частично некомплементарным кодону мРНК антикодоном.

Проверку эффективности связывания с рибосомой аа-тРНК, третий нуклеотид антикодона которой некомплементарен соответствующему первому нуклеотиду кодона мРНК, проводили в модельной системе (рисунок 5). Некомплементарность третьего нуклеотида антикодона тРНК первому нуклеотиду кодона мРНК в этой системе моделировали, используя тРНКр,1е и две различные мРНК.

правильный частично некомплементарный кодон кодон

TPHKPhe TPHKphe

I

антикодон тРНК г AAG с- V AAG с'

III и 5

кодон мРНК —AUGUUU— (MFTI) -AUGCUC— (90А)

5' 3' 5' л 3'

отсутствие спаривания кодируемая а/к fMet Phe ffVIet Leu

Рисунок 5 Образование дипептида в случае комплементарного и частично некомплементарного кодонов при связывании с А участком рибосомы, содержащей разные мРНК, [иС]РИе-тРНК е.

Начальный отбор

связывание тройного комплекса

узнавание кодона

активация ГТФ-азы

гидре пиз

к,

D pM's'

100 s1

500 s'

fa;

25 s '

Ki

0.2 s'

Кг

диссоц> p,

T ©

перенос пептида

kpcp

+

£

диссоциация аа-тРНК

j Коррекция

Рисунок Кинетическая схема связывания аа-тРНК с А участком рибосомы (Rodnina et al. (2000) Biol. Chem. 381: 377-387).

Для рибосом с мутациями C1109A/U961A и A1191G уровень связывания аа-тРНК в случае частично некомлементарного кодона CUC в 1.5-2 раза выше, чем для других мутантных рибосом и рибосом дикого типа. Это говорит о том, что данные мутации влияют на точность трансляции на стадии связывания тройного комплекса EF-Tu с аа-тРНК с А участком рибосомы и узнавания правильной аа-тРНК (рисунок 6). Ранее, с помощью подходов стационарной кинетики было показано, что мутации не оказывают влияния на функционирование пептидилтрансферазного центра 50S субчастицы. Поскольку эти эксперименты проводили в условиях, когда нивелируются различия в начальном отборе различных аа-тРНК, полученные данные говорят о том, что в двух мутантах C1109A/U961A и A1191G затронута именно стадия аккомодации аа-тРНК в рибосоме. Однако, какой именно эффект вызывают эти мутации - локальное изменение структуры декодирующего центра 30S субчастицы или глобальное изменение структуры 30S субчастицы и нарушение передачи сигнала от 30S субчастицы к 50S субчастице -на основании этих данных сказать сложно. Для того, чтобы ответить на этот вопрос необходимо более детально исследовать различные стадии кинетической схемы связывания аа-тРНК с А участком рибосомы.

Для детального изучения влияния мутаций в спирали 34 16S рРНК на стадию начального отбора и коррекции при связывании аа-тРНК с А участком рибосомы применяли подход престационарной кинетики - метод остановленного потока. Для регистрации протекания процесса в один из компонентов исследуемой системы, а именно в тРНК, вводили флуоресцентную метку (профлавин), по изменению сигнала которой можно следить за протеканием реакции.

Был проведен анализ престационарной кинетики связывания тройного комплекса с А участком рибосом дикого типа и содержащих мутацию A1191G для кодона комплементарного (MFTI мРНК, AUG UUU) и частично некомплементарного (90А мРНК, AUG CUC) антикодону тРНК. Значения наблюдаемых констант приведены в таблице 1.

Таблица 1. Значения кинетических констант для связывания тройного комплекса с А участком для мутантных рибосом А1191G и рибосом дикого типа.

_ Á1191G. '. ^ _ WJ ^ _J

МГП'мРНК'Т"эоа "мрнк ~ ~ MFTI мРНК ЭОАмРНК AUGUUU AUG CUC ' AUG UUU AUG CUC*

k-äpPis:i 50 ± 1 48 ± 1 32 ± 1 47 ± 2

3.2 ± 0.2 0.39 ± 0.07 6.5 ± 0.2 n/d

Наблюдаемые константы первых двух стадий карр2,з (узнавания кодона и стимуляция ГТФ-азной активности, рисунок 6) в случае кодона комплементарного и частично некомплементарного антикодону аа-тРНК различаются незначительно для рибосом дикого типа и рибосом, содержащих мутацию A1191G. Кинетические же константы стадии аккомодации карр 7 для этих двух случаев различаются почти на порядок. В тоже время, для связывания аа-тРНК с А участком на частично некомплементарном кодоне для рибосом дикого типа константу карр 7 невозможно определить, так как на кинетической кривой в этом случае нет изменения сигнала, связанного с аккомодацией аа-тРНК в А участке. Комплекс аа-тРНК с рибосомой диссоциирует сразу после стадии начального связывания. При связывании же аа-тРНК с А участком рибосом, содержащих мутацию A1191G, в случае частично некомплементарного кодона, происходит медленная аккомодация аа-тРНК. Следовательно, в мутантных рибосомах A1191G затронута стадия аккомодации аа-тРНК в А участке. Этот факт хорошо согласуется с полученными ранее результатами по образованию дипептида на мРНК с комплементарным и частично некомплементарным кодонами для рибосом с мутацией A1191G, когда увеличение эффективности связывания "неправильной" аа-тРНК с А участком рибосомы, скорее всего, связано именно с нарушением стадии аккомодации аа-тРНК в рибосоме.

На следующем этапе работы проверяли влияние мутаций на транслокацию. При связывании с претранслокационным комплексом и в процессе транслокации EF-G контактирует как 30S, так и с 50S субчастицей рибосомы, поэтому логично предположить, что изменение локальной структуры декодирующего центра или нарушение передачи сигнала между субчастицами, вызванное мутациями в спирали 34, может повлиять на связывание EF-G с рибосомой и катализ им перемещения мРНК-тРНК. Для исследования процесса транслокации применяли два подхода - метод стационарной и престационарной кинетики. В соответствии с кинетической схемой функционирования EF-G в процессе транслокации (рисунок 7) стадией, лимитирующей

скорость всего процесса транслокации, является переход рибосомы из состояния, в котором возможна транслокация (открытого состояния), в исходное состояние (рисунок 7, стадия 7). Эксперименты, проводимые с помощью подходов стационарной кинетики, позволяют определить, влияют ли мутации в спирали 34 16S рРНК на эту стадию кинетической схемы процесса транслокации. Однако исследования, проведенные с помощью подходов стационарной кинетики, не выявили влияния мутаций на эту скоростьлимитирующую стадию транслокации.

перемещение

гидролиз GTP образование открытого тРНК-мРНК состояния рибосомы к, к3 к4

диссоциация Р, к5

диссоциация Р,

перемещение тРНК-мРНК

возвращение рибосомы в исходное состояние

К К к,

5 s"

диссоциация EF-G к„

Рисунок 7. Кинетическая схема функционирования EF-G в процессе транслокации (Savelsbergh et al. (2003) Mol. Cell 11: 1517-1523).

Для более детального изучения влияния мутаций в спирали 34 16S рРНК на различные стадии процесса транслокации были проведены кинетические исследования элементарного акта транслокации с помощью метода остановленного потока.

7.1

4.9

ш

0.3 мкМ EF-G 6.7 6.5

5.4

14.4

*), ■) ÏÉsl

Г J ,

¡¿Я f-w î'4 Ы

1.5 мкМ EF-G 18.7

6.8

15.4

< <

и

<

Рисунок 8- Значения кажущихся констант кэрр, для двух концентраций ЕЯ-в - ненасыщающей (0.3 мкМ)(А) и насыщающей (1.5 мкМ)(Б).

Перемещение мРНК-тРНК, без которого невозможно связывание с рибосомой следующей аа-тРНК, является одной из важнейших стадий трансляции. Полученные кинетические данные говорят о том, что мутации C1109A/U961A, A1191G и A1191U не влияют на начальное взаимодействие EF-G с рибосомой, но замедляют структурную перестройку 30S субчастицы, которая предшествует перемещению мРНК-тРНК и соответствует переходу рибосомы в открытое состояние (рисунок 7). Проведенные ранее исследования первых стадий элонгации - связывания аа-тРНК с А участком рибосомы и образования дипептида - также показали, что мутации влияют на перестройку 30S субчастицы, а именно, декодирующего центра 30S субчастицы. Интересный эффект наблюдается при исследовании элементарного акта транслокации для мутантных рибосом A1201U, U961A и A1201U/U961A. При ненасыщающей концентрации EF-G (рисунок 8), в условиях, когда скорость транслокации мРНК-тРНК зависит от концентрации EF-G, транслокация на рибосомах с мутацией U961A происходит быстрее, чем на других мутантных рибосомах (A1201U и A1201U/U961A). При насыщающей же или близкой к ней концентрации EF-G (рисунок ПВ.29Б) скорость транслокации мРНК-тРНК уже не зависит от концентрации EF-G и, как полагают, определяется только структурными перестройками в самой рибосоме (в частности, в 30S субчастице). В этих условиях скорость транслокации для мутантных рибосом с заменой U961A становится меньше, чем для рибосом с мутациями A1201U и A1201U/U961A. Таким образом, образование и перестройка третичного контакта в триплете A1201U-U961A-A974 действительно важны для функционирования рибосомы.

3. Влияние мутаций в спирали 34 16S рРНК на точность трансляции in vivo

Для проверки точности трансляции, осуществляемой рибосомами, несущими мутации в спирали 34 16S рРНК, in vivo была применена система, основанная на экспрессии репортерного гена (3-галактозидазы. В нашем распоряжении находился набор штаммов, содержащих плазмиды, которое кодируют ген lacZ с различными мутациями (таблица 2).

Образование полноразмерного активного белка при трансляции мРНК, несущей мутацию, возможно только тогда, когда происходит прочтение стоп-кодонов (плазмиды pSG12-6, pSG853 и pSG%) или сдвиг рамки считывания (плазмиды pSG12DP и pSGIac7). В случае мутации E461Q, которая соответствует замене аминокислотного остатка в активном центре фермента, синтез активной /J-галактозидазы возможен при включении в белок неправильной аминокислоты. Клетки штамма МС127 трансформировали плазмидами серии pSTLxxxx, кодирующими мутированный рибосомный оперон, и определяли в них активность [3-галактозидазы.

Таблица 2. Плазмиды, кодирующие ген 1ас2 с различными мутациями. Жирным шрифтом выделены стоп-кодоны. Подчеркнутый СШ кодон является восьмым в гене /ас2 дикого типа. Рамка считывания определена разделением на трехбуквенные кодоны. Позиции сдвига рамки считывания отмечены звездочкой *.

Плаамида Мутация Последовательность

pSG25 wt lacZ AUG AUU ACG CUA AGC UUG GCA ÇUG

PSG12-6 UAG AUG AUU ACG CUA AGC UUU GUU UAG GCC GGC CCU AAU UCA CUG

pSG853 UAA стоп AUG AUU ACG CUA AGC UUU GUC UAA GUU AGC GGC CCU AAU UCA CUG

pSG% UGA AUG AUU ACG CUA AGC UUA GGG UAU CUU UGA CUA CGA CGG AUC CCC GGG AAU UCA

pSG12DP -1 FS AUG AUU ACG CUA AGC UUG GG AUA'AGG AUC CCC GGG AAU UCA CUG

pSGIac7 +1 FS AUG AUU ACG CUA AGC UUU GUGU'AGG GUU AGC GGC CCU AAU UCA CUG

CSH103 E461Q точечная мутация в активном центре фермента

Результаты in vivo экспериментов по определению частоты сдвига рамки считывания показали (таблица 3), что для мутантов C1109A/U961A и A1191G чаще происходит -1 сдвиг рамки считывания, в то время как для других мутантов преобладает +1 сдвиг рамки считывания и прочтение стоп-кодонов.

Таблица 3. Влияние мутаций в спирали 34 16S рРНК на прочтение стоп-кодонов и сдвиг рамки считывания. Активность |3-галактазидазы измеряли по методу Миллера. В каждом случае приведенная активность является средним значением, полученным в трех экспериментов. В каждом столбце активность р-галактозидазы нормирована по величине активности (3-галактозидазы для рибосом дикого типа К35.

Относительная активность £ i-галактозидазы

уЛ. PSG25. E461Q . CSH103 ■ -1 FS' ■ pSG12DP' ' •+1 FS ' :* 'pSG!âû7; UGA стоп *pSG% UAA СТОП pSG85 UAG СТОП pSG12-6

КЗ 5 1.0 ±0.1 1.0 ±0.2 1.0 ± 0.3 1.00 + 0.07 1.00 + 0.06 1.00 ± 0.06 1.0 + 0.1

L102 . 0.71+0.01 1.00 ± 0.28 1.0 + 0.2 0.90 ± 0.03 0.9 + 0.1 0.93 + 0.10 1.26 ±0.10

C1109A U961A 0.69 ±0.07 0.9 ± 0.3 3.19 ±0.19 1.03 + 0.07 1.36 + 0.03 0.88 ± 0.10 1.52 ± 0.12

C1109G 0.88 ± 0.06 0.83 + 0.20 1.34 ±0.02 2.4 ±0.1 5.0 + 0.3 2.54 ± 0.10 2.30 + 0.10

А119-1С 0.93 ± 0.08 1.14 + 0.28 1.38 ± 0.03 4.18 ±0.05 3.5 ±0.1 2.97 ±0.17 2.93 + 0.07

A1191G 0.75 ± 0.04 1.2+0.2 4.6+0.1 1.26 ±0.02 0.88 ± 0.09 1.4 ± 0.1 1.29 + 0.06

A1191U 0.68 ± 0.06 1.0 ± 0.3 1.21 ± 0.02 2.85 ± 0.03 4.92 ± 0.03 2.04+0.10 2.7 + 0.1

A1201U 0.82 + 0.01 1.2 ±0.5 1.35 ± 0.04 2.1 ± 0.1 3.3 ± 0.4 2.39 ±0.10 3.46 ± 0.07

U9B1A 1.17 ±0.01 0.48 ± 0.28 1.40 ± 0.05 2.7 ± 0.2 4.37 ± 0.03 2.84+0.10 2.43 ±0.10

A1201U" -U9B1A 1.06 ±0.05 0.75 ± 0.28 1.7 ± 0.2 1.8 ± 0.1 3.9 ± 0.4 2.9 + 0.1 2.21 ±0.10

Такое поведение мутантов C1109A/U961A и A1191G в экспериментах in vivo коррелирует с результатами предыдущих экспериментов по инициации, транспептидации и транслокации in vitro, в которых эти два мутанта вели себя отличным от всех других мутантов образом, проявляя высокий уровень включения неправильной аминокислоты в дипептид и замедленное перемещение комплекса мРНК-тРНК. Из недавно предложенной в литературе обобщенной схемы механизма сдвига рамки считывания в процессе трансляции следует, что и +1, и -1 сдвиг рамки считывания связан с процессами, происходящими с аа-тРНК, связанной с А участком рибосомы. Логично предположить, что мутации C1109A/U961A и A1191G, которые влияют, прежде всего, на структуру декодирующего центра 30S субчастицы и связывание аа-тРНК с А

участком, должны влиять и на сдвиг рамки считывания отличным от других мутаций образом.

4. Локальное изменение структуры декодирующего центра и других участков 16S рРНК

Полученные ранее результаты показали, что мутации влияют, прежде всего, на структурную перестройку 30S субчастицы. Однако остается непонятным, влияют ли мутации только на локальное изменение структуры декодирующего центра или они также вызывают конформационные изменения в других участках 30S субчастицы. Для поиска ответа на этот вопрос был использован метод химического пробинга структуры 16S рРНК.

Для того, чтобы проверить изменение конформации различных участков 30S субчастицы рибосомы, обусловленное введением мутации в спираль 34 16S рРНК, было проведено два типа экспериментов по химическому пробингу 16S рРНК. В одном случае химической модификации подвергали свободные 30S субчастицы, несущие различные мутации в спирали 34, при этом 30S субчастицы дикого типа использовали в качестве контроля. Затем с помощью реакции обратной транскрипции контролировали изменение доступности оснований 16S рРНК для модификации химическими реагентами по всей ее длине. Другой эксперимент был направлен на выяснение того, каким образом мутация A1191G может влиять на диссоциацию рибосом. Известно, что на 30S субчастице существует несколько участков, ответственных за контакт с 50S субчастицей. Согласно данным Ноллера, это пять участков 16S рРНК, в которых происходят изменения при ассоциации субчастиц - районы нуклеотидов 250 (спираль 11), 700 (спираль 23), 790 (спираль 24), 900 (спираль 27) и 1408-1495 (спираль 44). Возможно, что нарушения структуры этих участков контакта субчастиц могут быть вызваны мутацией A1191G. Для того, чтобы определить в каком из этих участков произошло изменение, до модификации химическими реагентами проводили образование инициаторного комплекса.

Эффект мутаций на изменение реакционной способности оснований 16S рРНК в свободных 30S субчастицах был обнаружен только в случае мутаций нуклеотидов А1201 и U961 - A1201U, Ü961A и A1201U/U961A. Происходило изменение реакционной способности основания А974. А1201 в кристаллической структуре выпетливается из спирали 34 и образует две водородные связи с нукпеотидом U961, который, согласно вторичной структуре, должен образовывать обычную Уотсон-Криковскую пару с А974. Сильнее всего основание А974 подвергается модификации в случае мутанта U961 А. Для этого же мутанта наблюдали наиболее сильное нарушение ассоциации рибосомных субчастиц. При обращении U-A пары в мутанте A1201U/U961А происходит восстановление ассоциации субчастиц до уровня рибосом дикого типа (рисунок 3), однако реакционная способность А974 сохраняется, хотя и в меньшей степени. Таким

образом, мутации в триплете A1201-U961-A974 оказывают влияние, прежде всего, на локальное изменение структуры в районе декодирующего центра 30S субчастицы, а не всей субчастицы.

Поскольку пробинг свободных 30S субчастиц не выявил структурных изменений ни в одном из пяти участков 16S рРНК, участвующих в образовании контактов с 50S субчастицей, было решено проверить как влияет мутация А1191G на структуру этих участков на первом этапе трансляции - при образовании инициаторного комплекса. Рибосомы, несущие мутацию A1191G, полностью диссоциированы при 7 мМ Mg2+ и всего лишь на 50% ассоциируют при 21 мМ Мд2+, однако при образовании инициаторного комплекса при 7 мМ Мд2+ ассоциация значительно улучшается. Химический пробинг показал изменение реакционной способности нукпеотидов при образовании инициаторного комплекса только в одном из пяти участков контакта 30S субчастицы с 50S субчастицей - в спирали 27.

Таким образом, с помощью химического пробинга было обнаружено, что в то время как мутации нуклеотидов А1201 и U961 вызывают только локальное изменение структуры декодирующего центра 30S субчастицы, мутация A1191G вызывает глобальное изменение структуры 30S субчастицы, в частности, структуры одного из участков контакта 30S и 50S субчастиц - спирали 27. Спирали 34 и 27 расположены на достаточном удалении друг от друга в третичной структуре 30S субчастицы и не имеют непосредственных контактов. Это позволяет предположить участие спирали 44, расположенной между ними, в передаче сигнала между спиралями 34 и 27.

5. Метод определения протонированных оснований в РНК и роль протонированных нуклеотидов 23S рРНК

Хотя контакты EF-G с 50S субчастицей изучены значительно лучше, чем с 30S субчастицей, остаются неясными детали взаимодействия EF-G с элементами 50S субчастицы. Так, например, неизвестен молекулярный механизм активации ГТФ-азы EF-G при взаимодействии фактора с рибосомой. Как известно, активация и катализ гидролиза GTP для многих G-белков протекает при участии вспомогательного белка (GAP), который содержит каталитический протонированный остаток аргинина (так называемый "механизм аргининового пальца"). В 50S субчастице в районе взаимодействия с G доменом элонгационных факторов присутствует остаток аргинина Arg74 белка L7/L12, но было показано, что он не принимает участия в катализе. В районе контакта EF-G с 50S субчастицей находится еще ряд рибосомных белков, таких как НО, L11, L6 и L14. В этих белках выявлены несколько консервативных остатков аргинина. Однако было показано, что аминокислотные остатки этих белков не принимают участия в катализе гидролиза GTP на элонгационных факторах EF-G и EF-Ти. Можно предположить, что если для катализа ГТФ-азной активности EF-G и EF-Tu нужна группа, предоставляемая in trans, то она должна приходить из рибосомной РНК.

Ранее в литературе было высказано предположение, что в районе пептидилтрансферазного центра находится остаток аденозина А2451, который может быть протонирован и в таком виде участвует в катализе пептидилтрансферазной реакции. Возможно, в одном из участков связывания элонгационных факторов на 50S субчастице также находится протонированное основание 23S рРНК, которое может принимать участие в катализе гидролиза GTP на EF-G по механизму, сходному с механизмом "аргининового пальца".

Для выявления протонированных оснований 23S рРНК был разработан новый вариант боргидридного метода химической модификации. Поскольку боргидрид натрия способен восстанавливать N1-метиладенозин, было решено использовать его для модификации протонированных оснований. В восстановленном состоянии основание (аденозин или гуанозин) не способно образовывать Уотсон-Криковскую пару и, следовательно, его можно идентифицировать с помощью реакции обратной транскрипции.

С помощью этого метода в районе связывания элонгационных факторов протонированных оснований не обнаружено. Также не было обнаружено протонированных оснований в 23S рРНК в пептидилтрансферазном центре (А2451). Однако, в 23S рРНК Escherichia coli было обнаружено два других протонированных основания - С2575 и А1528. На основании данных о консервативности и расположении пары CH+2575-U2511 в третичной структуре 50S субчастицы в непосредственной близости от пептидилтрансферазного центра можно предположить, что эта пара важна для стабилизации пространственной структуры этого функционального центра.

20

ВЫВОДЫ

1. С помощью нового варианта метода фотоаффинного химического сшивания компонентов аппарата трансляции, разработанного в данной работе, прямо показано, что домен IV EF-G расположен рядом с 30S субчастицей в функционирующей рибосоме;

2. Мутации A1191G и C1109A/U961A замедляют рост клеток и приводят к нарушению ассоциации рибосомных субчастиц;

3. Мутация двух взаимодействующих нуклеотидов 16S рРНК A1201U и U961A нарушают ассоциацию субчастиц, а двойная компенсаторная мутация A1201U/U961A восстанавливает ее до уровня ассоциации рибосомных субчастиц дикого типа;

4. Мутации C1109G, А1191С, A1191U, A1201U, U961A и A1201U/U961A 16S рРНК приводят к повышенной частоте прочтения рибосомой стоп-кодонов и +1 сдвига рамки считывания, мутации C1109A/U961A и A1191G - к возрастанию частоты -1 сдвига рамки считывания;

5. Мутация A1191G приводит к изменению структуры спирали 27 16S рРНК, одного из районов контакта 30S и 50S субчастиц;

6. С помощью разработанного в данной работе метода идентификации протонированных оснований РНК в 23S рРНК 50S субчастицы E.coli, вблизи ее пептидилтрансферазного центра, обнаружена заряженная пара CH+2575-U2511.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТИЦИИ

1. Кубаренко A.B., ЛаврикИ.Н., Сергиев П.В., Хойпль М., Роднина М., Винтермаер В., Богданов A.A., Донцова O.A. Метод фотоаффинного химического сшивания как способ выявления контактов фактора элонгации G с малой субчастицей рибосомы. // Доклады Академии Наук - 2003 - т.393 - вып.1.

2. Kubarenko A.V., Sergiev P.V., Bogdanov A.A., Brimacombe R., Dontsova O.A. A Protonated Base Pair Participating in rRNA Tertiary Structural Interactions. // Nucl. Acids Res. - 2001 - v.29(24) - p.5067.

3. Baranov P.V., Kubarenko A.V., Gurvich O.L., Shamolina T.A., Brimacombe R. The Database of the E. coli ribosomal cross-links:an update. // Nucl. Acids Res. - 1999 - v. 27(1) -p.184.

4. Кубаренко A.B., ЛаврикИ.Н., Винтермаер В., Донцова O.A., Богданов A.A. Исследование взаимодействия фактора элонгации G с рибосомой с помощью методов химического сшивания. II VII Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам Ломоносов-2000: молодежь и наука на рубеже XXI века. Москва. Апрель 2000 г., с. 183.

5. Kubarenko A.V., Lavrik I.N., Wintermeyer W., Dontsova O.A., Bogdanov A.A. Interactions of Elongation Factor G With The Ribosome: A Crosslinking Study. // Trends !n Nucleic Acid Chemistry. International Conference. Russia, Moscow, November, 21-24, 2000. p. 67.

6. Kubarenko A.V., Sergiev P.V., Bogdanov A.A., Brimacombe R., Dontsova O.A. Protonated base pair participating in rRNA tertiary structure interactions. // Protein Synthesis. International Conference in Honor of Alexander Spirin. August 27 - September 1, 2001. Institute of Protein Research. Pushchino, Moscow Region, Russia, p. 70.

7. Kubarenko A.V., Sergiev P.V., Bogdanov A.A., Brimacombe R., Dontsova O.A. Protonated base pair participating in rRNA tertiary structure interactions. // The Dinamics of Ribosome Structure and Function, Triennial International Conference on the Ribosome. 27th January -

Тираж 100. Зак. 117. ООП МГУ

Содержание.

Список сокращений.

Введение.

I. Обзор литературы.

IA. в-белки и ГТФ-азы трансляции.

1А.1. Общие свойства в-белков.

1А.1.1. Структура вТР связывающего центра (в домена).

1А.1.2. Механизм активации гидролиза вТР.

1А.1.3. Цикл работы ГТФ-азы.

1А.2. Факторы трансляции.

1А.2.1. ЕР-Ти.

1А.2.2. ЕР-в.

1А.2.3.1Р2.

1А.2.4. РРЗ.

1А.2.5. Роль гидролиза вТР и освобождения Р( в функционировании факторов трансляции.

1А.2.6. Активация ГТФ-азы факторов трансляции при взаимодействии с рибосомой

ив. Мутации в спирали 34 16S рРНК IIB.1. Выбор мест введения мутаций в 16S рРНК IIB.2. Введение мутаций в 16S рРНК (мутагенез) ИВ.З. А7 штамм для экспрессии мутантных рРНК (МС250) IIB.4. Измерение времени удвоения клеток IIB.5. Выделение рибосом и проблема диссоциации рибосом IIB.6. RT-анализ наличия мутаций в рРНК и определение чистоты популяции рибосом IIB.7. Зависимость степени диссоциации рибосом от концентрации Мд* IIB.8.1. Инициация при 7 мМ Мд* IIB.8.2. Зависимость выхода образования инициаторного комплекса от концентрации Мд* 55 55 57 58 59 60 61 62 64 65 IIB.8. Инициация и зависимость эффективности инициации от концентрации Мд*. 64 IIB.9. Эффективность связывания аа-тРНК с А участком рибосомы и образования претранслокационного комплекса 66 IIB.10. Связывание с А участком рибосомы аа-тРНК, с частично некомплементарным кодону мРНК антикодоном 67 IIB.11. Влияние мутаций на весь процесс функционирования EF-G в процессе транслокации (стационарная кинетика) 70 IIB.12. Метод престационарнои кинетики (остановленного потока) и оборудование для него 75 IIB.12.1. Устройство установки для проведения кинетических экспериментов методом остановленного потока IIB.12.2. Профлавин флуоресцентная метка втРИК"* IIB.13. Престационарная кинетика связывания аа-тРНК с А участком рибосомы IIB.14. Престационарная кинетика элементарного акта транслокации IIB.15 Определение точности трансляции in vivo IIB.16. Пробинг 16S рРНК IIB.16.1. Химический пробинг всей последовательности 16S рРНК IIB.16.2. Пробинг 16S рРНК в инициаторном комплексе II В. 17 Заключение ПС. Протонированные основания в рРНК IIC.1. Роль протонированных нуклеотидов 23S рРНК в пептидилтрансферазной реакции и катализе гидролиза GTP на EF-G IIC.2. Боргидридный метод определения заряженных оснований в РНК ИС.З. Пара CH*2575-U2511 IIC.4. НуклеотидА1528 11С.4. Заключение 75 76 77 80 84 89 90 92 97 99 99 100 101 103 104 II. Материалы и методы IIIA. Сайт-специфическое сшивание EF-G с рибосомой illA.1. Создание конструкции для экспресии гена EF-G 106 106 106 IIIA.2. Выделение и очистка EF-G IIIA.3. Модификация EF-G фотоаффинным реагентом IIIA.4. Формирование комплекса EF-G с рибосомой IIIA.4.1. Посттранслокационный комплекс с тиострептоном IIIA.4.2. Фосфорилирование EF-G в рибосомном комплексе IIIA.5.

IV. Выводы

1. С помощью нового варианта метода фотоаффинного химического сшивания компонентов аппарата трансляции, разработанного в данной работе, прямо показано, что домен IV EF-G расположен рядом с 30S субчастицей в функционирующей рибосоме;

2. Мутации A1191G и C1109A/U961A замедляют рост клеток и приводят к нарушению ассоциации рибосомных субчастиц;

3. Мутации двух взаимодействующих нуклеотидов 16S рРНК A1201U и U961A нарушают ассоциацию субчастиц, а двойная компенсаторная мутация A1201U/U961A восстанавливает ее до уровня ассоциации рибосомных субчастиц дикого типа;

4. Мутации C1109G, А1191С, A1191U, A1201U, U961A и A1201U/U961A 16S рРНК приводят к повышенной частоте прочтения рибосомой стоп-кодонов и +1 сдвига рамки считывания, мутации C1109A/U961A и A1191G - к возрастанию частоты -1 сдвига рамки считывания;

5. Мутация A1191G приводит к изменению структуры спирали 27 16S рРНК, одного из районов контакта 30S и 50S субчастиц;

6. С помощью разработанного в данной работе метода идентификации протонированных оснований РНК в 23S рРНК 50S субчастицы E.coli, вблизи ее пептидилтрансферазного центра, обнаружена заряженная пара CH+2575-U2511.

НС.4. Заключение

Показано, что в важных функциональных участках 50S субчастицы нет протонированных оснований В частности, не обнаружено протонированное основание, которое могло бы участвовать в катализе гидролиза GTP на элонгационных факторах по механизму аргининового пальца Это говорит о том, что как и для некоторых других

ГТФ-аз, белок-активатор которых не содержит аргининового пальца, взаимодействие с рибосомой важно для изменения и стабилизации той конформации элонгационных факторов, в которой становится возможным гидролиз йТР. Также не найдено протонированное основание в пептидилтрансферазном центре, участвующие в катализе образования пептидной связи. Показано присутствие в рибосоме вблизи пептидилтрансферазного центра необычной заряженной пары СН+2575-и2511. Разработанный боргидридный метод позволяет с высокой чувствительностью детектировать протонированные основания в РНК.

III. Материалы и методы

INA. Сайт-специфическое сшивание EF-G с рибосомой IIIA.1. Создание конструкции для экспресии гена EF-G

5 мл среды LB (1% бакто триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 1% NaCI) с антибиотиком канамицином (30 мкг/мл) засеивали одиночной колонией клеток штамма BL21(DE3), содержащих плазмиду рЕТ26Ь(+) с геном соответствующего мутантного элонгационного фактора G, и растили при 37°С 12 часов (ночь) при интенсивном перемешивании. Плазмиду выделяли после щелочного лизиса клеток на колонках QIAGEN. Элюцию ДНК с колонки осуществляли 50 мкл буфера (ЮмМ TrisHCI pH 8.5). Чистоту полученной ДНК проверяли электрофорезом в 0.8% агарозном геле. После выделения плазмиду обрабатывали эндонуклеазами рестрикции NdeJ и Xhol, продукты реакции рестрикции разделяли в геле из легкоплавкой агарозы, и ген EF-G выделяли из агарозы в чистом виде. Аналогично обработке эндонуклеазами рестрикции Ndel и Xhol подвергали плазмиду рЕТЗЗЬ(+) и выделяли больший фрагмент ДНК.

Больший фрагмент ДНК плазмиды рЕТЗЗЬ(+) и ген EF-G лигировали с помощью Т4 ДНК-лигазы. Реакцию проводили в течение 12 часов (ночь) при 16-18°С. Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки штамма BL21(DE3), селективный отбор которых проводили на среде LB с канамицином. Единичную колонию клеток пересеивали в 5 мл среды LB с канамицином и выделяли плазмиду рЕТЗЗЬХХХ - pET33bCysless, рЕТЗЗЬ506, рЕТЗЗЬ541, рЕТЗЗЬ585 и рЕТЗЗЬ591. Наличие правильной вставки гена EF-G и нахождение гена EF-G в корректной рамке считывания подтверждали с помощью секвенирования по Сенгеру.

IIIA.2. Выделение и очистка EF-G

По 5 мл ночных культур штамма BL21(DE3), содержащего плазмиды серии рЕТЗЗЬХХХ, засеивали в 1 л среды LB и растили до Аеоо 0.4, производили индукцию IPTG до конечной концентрации 1 мМ и растили в течение 3 часов при 37°С. Клетки осаждали центрифугированием. Собранные клетки промывали лизис-буфером (50 мМ Tris-HCI pH 8.0, 10 мМ MgCI2, 0.5 мМ DTT, 0.01 мМ PMSF). Клетки ресуспендировали в лизис-буфере, лизировали с помощью ультразвука и центрифугировали последовательно 1 час при 18000 об/мин и 4 часа при 30000 об/мин. Из полученного супернатанта выделяли мутантный элонгационный фактор.

Выделение и очистку элонгационного фактора проводили с помощью аффинной хроматографии на никель-нитрилоуксусной кислоте (Ni-NTA), имобилизированной на агарозе, за последовательность из шести гистидинов (6xHis-Tag), находящуюся как на N-, так и на С-конце белка.

К 500 мкл 50% суспензии Ni-NTA добавляли 3 мл супернатанта и имидазол до конечной концентрации 5 мМ. Перемешивали 1 час при 200 об/мин и температуре 4°С, промывали 5 раз 500 мкл буфера (20 мМ TrisHCI рН 8.0, 500 мМ NaCI, 50 мМ имидазол) и элюировали 3 раза 500 мкл буфера (20 мМ TrisHCI рН 8.0, 500 мМ NaCI, 200 мМ имидазол). Анализ фракций проводили с помощью 10% SDS-полиакриламидного геля [210]. Перевод EF-G в буфер С (50 мМ Tris-HCI, рН 7.5, 70 мМ NH4CI, 30 мМ KCI, 7 мМ MgCI2) осуществляли с помощью гель-фильтрации на Sephadex G50 Fine.

IIIA.3. Модификация EF-G фотоаффинным реагентом

Первым этапом реакции модификации являлась обработка белка DTT для восстановления SH-групп остатков цистеина. Для этого к 100 мкл раствора белка (40 мкМ) в буфере С добавляли 1 мкл 0.1 М DTT, и реакцию восстановления проводили в течение 12 часов (ночь) при 4°С. После реакции восстановления EF-G очищали от DTT на колонке со смолой Sephadex G50 Fine, на 100 мкл образца брали 1 мл суспензии смолы. После элюции с колонки объем образца доводили до 100 мкл буфером С, 10 мкл отбирали для контроля (образец 1).

Все остальные операции проводили в темной комнате при освещении красной лампой. К оставшимся 90 мкл образца добавляли 10 мкл раствора фотоаффиного реагента (п-азидофенацилбромида или 3-(3-(йодоацетиламино)фенил)-3-(трифторметил) диазирина) в 100% метаноле с концентрацией 8 мМ (15-20-ти кратный избыток) и инкубировали в течение 0.5-1.0 часа при 4°С. Очистку от избытка непрореагировавшего реагента проводили на колонках Sephadex G50 Fine, как описано выше. Объем пробы после колонки доводили до 100 мкл буфером С, 10 мкл отбирали для анализа (образец 2). К оставшимся 90 мкл добавляли 10 мкл 87% глицерина.

Выход модификации определяли с помощью 5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойдной кислоты). Для этого снимали спектры поглощения образцов 1 и 2 (200-500 нм). Добавляли 5 мкл 1 мМ водного раствора 5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойдной кислоты) и инкубировали в течение 2 часов при 4°С. После этого опять снимали спектры (200-500) нм. По разности значения оптической плотности при 412 нм (анион 5-тио-2-нитробензойдной кислоты имеет коэффициент молярной экстинкции ем 13600) рассчитывали концентрацию свободных SH-групп остатков цистеина.

1ИА.4. Формирование комплекса ЕР-О с рибосомой

ША.4.1. Посттранслокационный комплекс с тиострептоном

Претранслокационный комплекс 70Б рибосом (0.5 мкМ) с ^Н^МеН^СрЬе-тРНК™6' в Р участке и тРНК™® в А участке формировали согласно опубликованной методике [211]. К 150 мкл 0.5 мкМ претранслокационного комплекса добавляли 50 мкл буфера ТАКМ7 (50 мМ Тле-НС!, рН 7.5, 70 мМ МН4С1, 30 мМ КС1, 7 мМ МдС12), содержащего 10-ти кратный избыток модифицированного фотоаффинным реагентом ЕР-в, активированного инкубацией с СТР в течение 10 мин при 37°С [211]. В качестве контроля использовали претранслокационный комплекс без добавления ЕР-в и с добавлением ЕР-в СуэЧезэ, обработанного фотоаффинным реагентом. Смесь инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Полноту протекания реакции транслокации проверяли с помощью пуромициновой реакции, отбирая 10 мкл посттранслокационного комплекса [52]. 90 мкл посттранслокационного комплекса облучали ультрафиолетовым светом с длиной волны больше 320 нм в течение 10 мин. 90 мкл комплекса использовали в качестве необлученного контроля. ША.4.2. Фосфорилирование ЕР-С в рибосомном комплексе

К 90 мкл комплекса добавляли 21 мкл Н20, 30 мкл 5х рабочего буфера (100 мМ Тпэ-НС! рН 7.8, 750 мМ №С1, 100 мМ МдС12), 1.5 мкл у-[32Р]АТР (2 пмоль/мкл) и 7.5 мкл каталитической субъединицы протеин киназы А (1 ед/мкл в буфере 0.35 мМ ЭДТА, 0.96 мМ фосфат калия рН 7.0) и инкубировали в течение 1.5 часа при 30°С.

ША.5. Разделение модифицированных компонентов рибосомы

Разделение модифицированных компонентов рибосомы проводили с помощью системы трех последовательных ультрацентрифугирований в градиенте концентрации сахарозы. Первое центрифугирование в градиенте концентрации сахарозы 10-30% в буфере 10 мМ Тпэ-НС! рН 7.5, 100 мМ 1МН4С1, 10 мМ МдС12, 1 мМ ОТТ в течение 18 часов при 22000 об/мин и 4°С необходимо для очистки от избытка фактора в, второе -10-30% в буфере 10 мМ Тпэ-НС! рН 7.5, 100 мМ МН4С1, 0.5 мМ МдС12, 1 мМ ОТТ в течение 18 часов при 22000 об/мин и 4°С для разделения рибосомных субчастиц и третье - 10-30% в буфере 10 мМ Тиэ-НС! рН 7.5, 0.2 мМ ЕРТА, 0.1% вОБ, 10 мМ р-мкркаптоэтанол в течение 18 часов при 33000 об/мин и 4°С для разделения рибосомной РНК и белков.

В случае фосфорилирования ЕР-в разделение рибосомной РНК и белков проводили также с помощью ультрацентрифугирования в градиенте концентрации сахарозы 10-30% в денатурирующих условиях (буфер 20 мМ Тиэ-НС!, рН 8.0, 0.1 мМ

EDTA, 100 мМ LiCI, 0.1% SDS). При этом, к 150 мкл комплекса после фосфорилирования добавляли 150 мкл буфера для нанесения образца (20 мМ Tris-HCI, рН 8.0, 2 мМ EDTA, 10 мМ DTT, 2% SDS), наслаивали на 11 мл градиента концентрации сахарозы и центрифугировали в течение 16 часов при при 22000 об/мин и 4°С (ротор SW41Ti). Фракции, соответствующих рибосомным белкам, анализировали с помощью SDS-ПААГ.

IIIA.6. Анализ продуктов фотохимической модификации с помощью антител

В данных экспериментах также использовали четыре мутанта EF-G (506, 542, 585, 591), модифицированные 3-(3-(йодоацетиламино)фенил)-3-(трифторметил) диазирином. Комплексы EF-G (506, 542, 585, 591) с рибосомой в присутствии антибиотика тиострептона и контрольные комплексы формировали, как описано выше. После облучения разделение рибосомных комплексов на субчастицы проводили центрифугированием в градиенте концентрации сахарозы. При анализе сахарозных градиентов аликвоту, равную 10 мкл (1/60 от общего объема фракции), наносили на нитроцеллюлозную мембрану. Для анализа применяли поликлональные антитела против фактора элонгации. Для окрашивания нитроцеллюлозной мембраны применяли разведение 1:1000, разведение вторичных антител 1:50000, для проявления использовали хемилюминисцентный метод и набор препаратов от фирмы Перкин Элмер. Для анализа модификаций рибосомных белков использовали 6% SDS-ПААГ.

1MB. Мутации в спирали 34 16S рРНК

IIIB.1. Трансформация клеток Escherichia со// ШВ.1.1. Получение компетентных клеток

Компетентные клетки получали по протоколу, описанному на http://molbiol.ru/protocol/03 04.html. Для этого 50 мл SOB (2% Bacto-пептон, 0.55% Bacto дрожжевой экстракт, 10 мМ NaCI, 10 мМ KCI, 10 мМ MgCI2, 10 мМ MgS04, стерилизация фильтрованием через 0.22 мкм фильтр), содержащей необходимый для селекции антибиотик, засеивали 2-3 колониями клеток одного из используемых в работе штаммов Escherichia coii. Клетки растили до оптической плотности при 600 нм, равной 0.5-0.6 при 18°С (несколько суток) или при 37°С (5-6 часов, но компетентность полученных таким образом клеток получается на 2-3 порядка ниже). По достижении заданной оптической плотности 40 мл клеток помещали в центрифужные пробирки и выдерживали во льду 30 минут. Клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 3000 об/мин. Супернатант декантировали, клетки центрифугировали еще раз в течение 20 с при 3000 об/мин и как можно полнее удаляли остатки среды. Осадок клеток ресуспендировали в 10 мл холодного буфера ТВ (10 мМ PIPES или HEPES, 55 мМ МпС12, 15 мМ CaCI2, 10 мМ KCI, 250, рН 6.7) и выдерживали во льду 15 минут. Клетки осаждали центрифугированием 3000 об/мин 10 минут. Супернатант I декантировали, клетки центрифугировали еще раз 3000 об/мин 20 с и как можно полнее удаляли остатки буфера ТВ. Осадок клеток ресуспендировали в 10 мл холодного буфера ТВ и выдерживали во льду 15 минут. Клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 3000 об/мин. Супернатант декантировали, клетки центрифугировали еще раз в течение 20 с при 3000 об/мин и как можно полнее удаляли остатки буфера ТВ. Осадок клеток ресуспендировали в 2 мл холодного буфера ТВ. По каплям при перемешивании добавляли 70 мкл DMSO (DMSO во льду замерзает!) и выдерживали во льду 10 минут. Затем добавляли еще 70 мкл DMSO и выдерживали во льду еще 10 минут. Полученную суспензию клеток аликвотили по 50200 мкл в стерильные пластиковые пробирки на 1.5 мл, которые предварительно охлаждали во льду, и замораживали в жидком азоте. Компетентные клетки хранили при-80°С.

Ill В.1.2. Трансформация

Для трансформации брали 40-50 мкл компетентных клеток. В случае трансформации плазмидной ДНК брали водный раствор с концентрацией 5-10 нг/мл. Для этого разводили в 100-200 раз раствор пДНК, полученный после выделения ^ плазмиды (смотри раздел IIIA.1). 1-2 мкл раствора плазмидной ДНК добавляли к компетентным клеткам и выдерживали во льду 30 минут. Затем проводили тепловой шок в течение 45 с при 42°С и пробирки, не перемешивая клетки, помещали на 2 мин в лед. После этого добавляли 200 мкл среды SOC (2% Bacto-пептон, 0.55% Bacto дрожжевой экстракт, 10 мМ NaCI, 10 мМ KCI, 10 мМ MgCI2, 10 мМ MgS04, 20 мМ глюкоза, стерилизация фильтрованием через 0.22 мкм фильтр) и растили при перемешивании в течение 1 часа при 37°С. 75-100 мкл клеток рассеивали на чашки со средой LB, содержащей необходимые антибиотики.

IIIB.2. Введение мутации в рРНК (мутагенез по методу Кункеля)

Для введения мутаций в рРНК участок рибосомного оперона, содержащего З'-концевую область гена 16S рРНК, перенесли в ДНК фага М13тр18 по сайтам рестрикции Hindlll и Shpl. Одноцепочечную урацилсодержащую ДНК для проведения мутагенеза получали с использованием штамма CJ236 (dut1, ungí, th¡1, relA1/pCJ105 СCm'')). Для этого 3 мл среды 2xYT (1.6% Bacto-пептон, 1% Bacto дрожжевой экстракт, 0.5% NaCI), содержащей хлорамфеникол, засеивали 200 мкл ночной культуры клеток CJ236, добавляли 5-10 мкл супернатанта, содержащего фаги, и растили в течение 6 часов при 37°С. После этого клетки осаждали центрифугированием в течение 30 мин при 5000 об/мин и 4°С. К 4-м объемам супернатанта добавляли 1 объем 5х раствора PEG/NaCI (0.15 г/мл полиэтиленгликоль 8000, 0.146 г/мл NaCI) и инкубировали во льду в течение 1 часа. Фаги осаждали центрифугированием в течение 15 мин при 5000 об/мин и 4°С, осадок фагов растворяли в 100 мкл высокосолевого буфера (100 мМ TrisHCI рН 8.0, 300 мМ NaCI, 1 мМ EDTA), осторожно перемещивали на вортексе, инкубировали во льду в течение 1 часа и центрифугировали как описано выше. Супернатант по прежнему содержал фаги. Экстракцию одноцепоцечной ДНК проводили путем последовательной обработки супернатанта два раза фенолом и один раз смесью хлороформ/изоамиловый спирт (24:1). ДНК осаждали добавлением 0.1 объема 3 M NaOAc рН 5 и 3 объемов этилового спирта. Пробы выдерживали в течение 1.5 часов при -20°С или в течение 10 минут в жидком азоте, и ДНК осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 14000 об/мин. Осадок ДНК растворяли в 20 мкл буфера ТЕ (10 мМ TrisHCI рН 8.0, 0.1 мМ EDTA) и концентрацию определяли спектрофотометрически (1 А2ео составляет примерно 36 мкг одноцепочечной ДНК). Чистоту полученной ДНК проверяли с помощью 0.8% агарозного геля.

Фосфорилирование праймера проводили в 20 мкл реакционной смеси (50 мМ TrisHCI рН 7.5, 10 мМ MgCI2, 5 мМ DTT, 0.4 мМ АТР), содержащей 2-5 ед Т4 полинуклеотид киназы и 200-250 нг олигонуклеотида, в течение 2 часов при 37°С. Киназу дезактивировали нагреванием в течение 15 мин при 75°С. 4

Гибридизацию олигонуклеотида проводили в 10 мкл реакционной смеси. Для этого к 7-8 мкл фосфорилированного праймера добавляли 1 мкл 10х буфера для отжига (200 мМ TrisHCI рН 7.5, 20 мМ MgCI2, 500 мМ NaCI) и 1-2 мкл (0.5-1 мкг) урацилсодержащей одноцепочечной ДНК. Гибридизацию проводили при охлаждении термостата с 80°С до 37°С со скростью 1 °/мин.

Для синтеза комплиментарной цепи к 10 мкл смеси с предыдущего шага добавляли 1.3 мкл смеси для удлинения праймера (200 мМ TrisHCI рН 7.5, 100 мМ MgCI2, 20 мМ DTT, 5 мМ dATP, 5 мМ dCTP, 5 мМ dGTP, 5 мМ dTTP, 4 мМ АТР), 1 мкл Т4 ДНК полимеразы (10 ед) и 1 мкл Т4 ДНК лигазы (10 ед). Смесь инкубировали в течение 1 часа при 37°С и замораживали.

Полученную смесь разбавляли в 10-25 раз и 1-2 мкл использовали для трансформации 50 мкл компетентных клеток штамма XL1. После трансформации клетки добавляли к 10 мл Soft агара (1% Bacto-пептон, 0.5% Bacto дрожжевой экстракт, 1% NaCI, 0.8% Bacto агар), находящимся в водяной бане при 42°С и заливали в чашку Петри. Чашку инкубировали в течение 12-15 часов (ночь) при 37°С.

Для анализа мутаций 3-4 фаговых бляшки переносили на 3 мл среды 2xYT, добавляли 200 мкл ночной культуры клеток штамма XL1 и растили в течение 6 часов. После этого клетки осаждали центрифугированием в течение 30 мин при 5000 об/мин и 4°С. К 4-м объемам супернатанта добавляли 1 объем 5х раствора PEG/NaCI и инкубировали во льду 1 час. Фаги осаждали центрифугированием в течение 15 мин при 5000 об/мин и 4°С, осадок фагов растворяли в 100 мкл буфера ТЕ. Экстракцию одноцепоцечной ДНК проводили путем последовательной обработки супернатанта два раза фенолом и один раз смесью хлороформ/изоамиловый спирт (24:1). Для осаждения ДНК добавляли 0.1 объема 3 М NaOAc рН 5 и 3 объемов этилового спирта, пробы выдерживали в течение 1.5 часа на -20°С или в течение 10 минут в жидком азоте и центрифугировали в течение 10 минут при 14000 об/мин. Осадок ДНК растворяли в 20 мкл буфера ТЕ и концентрацию определяли спекгрофотометрически (1 А2бо составляет примерно 36 мкг одноцепочечной ДНК). Чистоту полученной ДНК проверяли с помощью 0.8% агарозного геля. Нуклеотидную последовательность полученной ДНК определяли по методу Сенгера.

IIIB.3. Создание А7 штаммов МС250 и AVS69009, несущих мутированный рибосомный оперон на плазмиде pSTLxxxx

Для создания А7 штаммов, несущих рибосомный оперон, содержащий введенную нами мутацию, использовали штаммы AVS69009 и МС250 и плазмиду pSTL102, несущую ген устойчивости к ампицилину.

Часть рибосомного оперона, содержащего З'-концевую область гена 16Э рРНК в ДНК фага М13тр18Н8, переносили из репликативной формы ДНК фага по сайтам эндонуклеаз рестрикции Ара1 и ХЬа1 в плазмиду рЗТ1.102. Полученной плазмидой рЭЛ-хххх, где хххх обозначение мутанта, трансформировали компетентные клетки штамма А\/869009 или МС250. После трансформации клетки высеивали на среду 1.В-агар (1% ВасЬ-пептон, 0.5% Вас1о дрожжевой экстракт, 1% МаС1, 1.5% Вайо-агар), содержащую ампицилин (50 мкг/мл), и инкубировали в течение 12-15 часов при 37°С.

Для замещения исходной плазмиды, несущей немутированный рибосомный оперон и ген устойчивости к канамицину, плазмидой рЭЛхххх несколько колоний после трансформации пересеивали на среду ЬВ-агар со вторым антибиотиком -эритромицином (100 мкг/мл) в случае штамма АХ/БбЭООЭ и стрептомицином (20 мкг/мл) в случае штамма МС250 - и инкубировали в течение 12-15 часов при 37°С. Для проверки полноты замещения исходной плазмиды одну и ту же колонию рассевали параллельно на среды ЬВ-агар, содержищие канамицин (50 мкг/мл) и ампицилин (50 мкг/мл). Для дальнейшей работы отбирали только те колонии, которые росли на среде с ампицилином, но не росли на среде с канамицином.

ШВА Измерение времени удвоения клеток

Получение кривых роста клеток проводили в трех независимых экспериментах. Для этого в каждом эксперименте колонию клеток штамма МС250-рЗТ1.хххх высевали на жидкую среду 1.В (1% Вайо-пептон, 0.5% Вайо дрожжевой экстракт, 1% МаС1) с ампицилином (50 мкг/мл) и растили в течение 12-15 часов при 37°С. Далее 200-400 мкл ночной культуры засеивали 50 мл среды 1.В с ампицилином (50 мкг/мл) и растили в орбитальном термостатируемом шейкере при 200 об/мин. Измерение оптической плотности при длине волны 600 нм производили на начальной стадии кривой роста с интеревалом 1 час, в средней части кривой роста с интервалом 15-20 минут.

ШВ.5. Стандартная методика выделения рибосом

Для выделения рибосом и рибосомных субчастиц на первом этапе нарабатывали необходимую клеточную массу, 40-50 грамм клеток. Для этого использовали ферментеры емкостью 2 литра. 200 мл ночной культуры соответствующего штамма МС250, содержащего плазмиду рЭЛХХХ, засеивали 2 литра среды 2х1.В (2% Вайо-пептон, 1% Вас1о дрожжевой экстракт, 1% №С1, рН 7.1) и ферментацию проводили, при поддерживании рН 7.1, аэрации и активном перемешивании культуры клеток, до оптической плотности Абоо равной 4-5 ед. Одна ферментация позволяла получить с 2 литров культуры 10-12 г клеток. Клетки осаждали центрифугированием в течение 20 мин при 6000 об/мин (ротор МЮ), замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С.

50 г замороженных клеток разбивали пестиком в холодной ступке диаметром 20 см, добавляли 100-125 г охлажденного оксида алюминия (А1203) и перетирали в холодной комнате в течение 30 минут. После этого добавляли несколько кристаллов ДНКазы I и продолжали перетирание в течение еще 10 минут. Полученную клеточную массу ресуспендировали в буфере ^Ьо1 (20 мМ ТпэНС! рН 7.6, 100 мМ МН4С1, 10.5 мМ Мд(ОАс)2, 0.5 мМ ЕОТА, 3 мМ р-меркаптоэтанол) и центрифугировали последовательно в течение 10 мин при 1500 див течение 30 мин при 12500 д и 4°С (ротор иА14). Полученный супернатант фильтровали через бумажный фильтр и центифугировали в течение 30 мин при 16000 об/мин и 4°С (ротор "П 50.2) для получения БЗО экстракта. Первичную очистку рибосом проводили с помощью центрифугирования через сахарозную подушку (20 мМ ТпэНС! рН 7.6, 100 мМ 1ЧН4С1, 10.5 мМ Мд(ОАс)2, 0.5 мМ ЕРТА, 1.1 М сахароза, 3 мМ р-меркаптоэтанол). 14 мл БЗО экстракта наслаивали на 9 мл сахарозной подушки и центрифугировали в течение 16 часов при 33000 об/мин и 4°С (ротор "П 50.2). После центрифугирования полученный осадок рибосом промывали буфером ШЬо2 (20 мМ ТпэНС! рН 7.6, 500 мМ 1ЧН4С1, 10.5 мМ Мд(ОАс)2, 0.5 мМ ЕРТА, 3 мМ р-меркаптоэтанол), растворяли в буфере Я1Ьо2 и конечный объем доводили до 92 мл. 23 мл раствора рибосом наслаивали на 1 мл сахарозной подушки и центрифугировали в течение 6 часов при 50000 об/мин и 4°С (ротор "Л 50.2). Осадок рибосом промывали буфером Я'|Ьо2, растворяли в буфере Я1Ьо2 и конечный объем доводили до 90 мл. 30 мл раствора рибосом наслаивали на 1.5 мл сахарозной подушки и центрифугировали в течение 13 часов при 28000 об/мин и 4°С (ротор 5\Л/28). Полученный осадок рибосом растворяли в 15-20 мл буфера для нанесения на градиент концентрации сахарозы Я1ЬоЗ (20 мМ ТпэНС! рН 7.6, 60 мМ 1ЧН4С1, 5.25 мМ Мд(ОАс)2, 0.25 мМ ЕРТА, 3 мМ р-меркаптоэтанол), измеряли концентрацию рибосом, добавляли сахарозу до концентрации 5%, и либо сразу использовали на следующем шаге выделения (зональное центрифугирование), либо замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С.

На одно зональное центрифугирование брали не более 10000 ед А600 рибосом. В зональный ротор с помощью перестатического наноса последовательно добавляли 400 мл буфера Р^ЬоЗ, рибосомы в буфере для нанесения на градиент концентрации сахарозы с 5% сахарозой, 1400 мл градиента концентрации сахарозы 10-40% в буфере ^ЬоЗ и еще 150 мл буфера Я1ЬоЗ, содержащего 50% сахарозу. Центрифугирование проводили в течение 19 часов при 28000 об/мин и 4°С. Собирали фракции градиента по 50 мл (32 фракции), измеряли оптическую плотность каждой фракции при 260 нм и отбирали 6 фракций, соответствующих пику 70S рибосом. Рибосомы осаждали центрифугированием в течение 24 часов при 50000 об/мин и 4°С (ротор Ti 50.2). Осадок рибосом растворяли в рабочем буфере ТАКМ7 (50 мМ TrisHCI pH 7.6, 70 мМ NH4CI, 30 мМ KCl, 7 мМ MgCI2), аликвотили по 50-100 мкл, замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С.

ШВ.6. Выделение рибосом при повышенной концентрации Мд2+

В тех случаях, когда выделение рибосом в стандартных условиях (смотри раздел ШВ.5) было невозможно из-за диссоциации на субчастицы, рибосомы выделяли в условиях повышенной концентрации магния. Выделение проводили согласно описанной выше методике, заменяя соответствующие буферы на буферы с повышенной концентрацией магния: РИЬо1-21 (20 мМ ТпэНС! рН 7.6, 100 мМ МН4С1, 21 мМ Мд(ОАс)2, 0.5 мМ ЕйТА, 3 мМ р-меркаптоэтанол), сахарозная подушка (20 мМ ТпвНС! рН 7.6, 100 мМ МН4С1, 21 мМ Мд(ОАс)2, 0.5 мМ ЕОТА, 1.1 М сахароза, 3 мМ Р-меркаптоэтанол), ^Ьо2 (20 мМ ТпзНС! рН 7.6, 500 мМ МН4С1, 10.5 мМ Мд(ОАс)2, 0.5 мМ ЕОТА, 3 мМ р-меркаптоэтанол), ^ЬоЗ-21 (20 мМ ТпзНС1 рН 7.6, 60 мМ МН4С), 21 мМ Мд(ОАс)2, 0.25 мМ ЕОТА, 3 мМ р-меркаптоэтанол).

IIIB.7. Проверка наличия мутации в рибосомной РНК (RT анализ)

Проверку наличия мутации в рибосомной РНК проводили с помощью реакции обратной транскрипции с праймера, синтезированного таким образом, чтобы при гибридизации его З'-конец был комплементарен последовательности 16S рРНК, непосредственно предшествующей месту мутации (см. таблицу IIIB.1). Таблица IIIB.1. Праймеры к 16S рРНК, использованные для анализа наличия мутации в рРНК. ml .

•.-.-.~|ШГЭ2У>

Seq1 A1191(C,G,U) 1192-1203 5' -GATGACTTGACG-3'

Seq2 A1067(C,G,U) 1068-1179 5' -CACAACACGAGC-3'

Seq3 C1109(A,G,U) 1110-1121 5' -AGGATAAGGGTT-3'

Seq4 A1201U 1202-1213 5' -TAAGGGCCATGA-3'

Seq5 U961A 962-973 5' -CGCGTTGCATCG-3'

ШВ.7.1. Выделение рибосомной РНК

Выделение рибосомной РНК проводили из 100 пмол рибосом с помощью фенольной депротеинизации. 100 пмол рибосом разводили в 200 мкл ТЕ буфера (ЮмМ Тиэ-НС! рН 8.0, 0.1 мМ ЭДТА), проводили последовательно два раза фенольную депротеинизацию равным объемом насыщенного водой фенола (200 мкл) и один раз экстракцию смесью хлороформ:изоамиловый спирт (24:1). Затем рибосомную РНК высаживали добавлением 3-х объемов (600 мкл) 99.9% этилового стирта (ЕЮН) и 0.1 объема (20 мкл) 3 М №Ас рН 5.5. Осадок рРНК растворяли в 20-30 мкл буфера ТЕ и концентрацию определяли спекгрофотометрически по абсорбции РНК при 260 нм. ШВ.7.2. Реакция обратной транскрипции

Радиоактивную метку вводили на 5'-конец олигонуклеотида с помощью полинуклеотид киназы и у-[32Р]АТР. В реакцию фосфорилирования праймера на 20 мкл реакционной смеси брали 20 пмоль праймера, 2 мкл 10-ти кратного киназного буфера (500мМ ТпэНС! рН 7.6, ЮОмМ МдС12, 50мМ ОТТ, 1мМ спермидин, 1мМ ЭДТА), 1.0-2.0 мкл у-[32Р]АТР (10 мкКю/мкл) и 1.0 мкл Т4 полинуклеотид киназы (10 ед/мкл). Инкубировали в течение 2.5 часа при 37°С. После инкубации прогревали в течение 15 мин при 75°С для дезактивации полинуклеотид киназы. Конечная концентрация праймера составляла 1 пмол/мкл.

На одну реакцию удлинения праймера брали 0.5 пмол рРНК. Отжиг праймера проводили в объеме 5 мкл - 0.5 пмол рРНК, 0.5 пмол фосфорилированного праймера, 0.5 мкл 10-ти кратного буфера ЮхРТ (500мМ ТпэНС! рН 8.3, 600 мМ №С1, ЮОмМ РТТ, бОмМ МдС12), стерильная Н20 до 5 мкл. Отжиг проводили при охлаждении термостата с 80°С до 37°С со скоростью 1°/мин. Затем к реакционной смеси добавляли 5 мкл соответствующей смеси сЮМТР (таблица ШВ.2), содержащей один из нуклеотидов в дидезокси форме, и 0.1 мкл обратной трансктиптазы (20 ед/мкл). Инкубировали в течение 15 мин при 45°С.

1. Bourne, H.R., Sanders, D.A., and McCormick, F. (1990) The GTPase superfamily: a conserved switch for diverse cell functions. Nature 348: 125-132.

2. Nissen, P., Kjeldgaard, M., and Nyborg, J. (2000) Macromolecular mimicry. EMBO J. 19: 489-495.

3. Tate, W.P., Beaudet, A.L., and Caskey, C.T. (1973) Influence of guanine nucleotides and elongation factors on interaction of release factors with the ribosome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70: 2350-2355.

4. La Teana, A., Gualerzi, C.O., and Dahlberg, A.E. (2001) Initiation factor IF 2 binds to the alpha-sarcin loop and helix 89 of Escherichia coli 23S ribosomal RNA. RNA 7:1173-1179.

5. Richman, N., and Bodley, J.W. (1972) Ribosomes cannot interact simultaneously with elongation factors EF Tu and EF G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 686-689.

6. Moazed, D., Robertson, J.M., and Noller, H.F. (1988) Interaction of elongation factors EF-G and EF-Tu with a conserved loop in 23S RNA. Nature 334: 362-364.

7. Lodmell, J.S., and Dahlberg, A.E. (1997) A conformational switch in Escherichia coli 16S ribosomal RNA during decoding of messenger RNA. Science 277: 1262-1267.

8. Gabashvili, I.S., Agrawal, R.K., Grassucci, R., Squires, C.L., Dahlberg, A.E., and Frank, J. (1999) Major rearrangements in the 70S ribosomal 3D structure caused by a conformational switch in 16S ribosomal RNA. EMBO J. 18: 6501-6507.

9. Zavialov, A.V., and Ehrenberg, M. (2003) Peptidyl-tRNA regulates the GTPase activity of t translation factors. Cell 114: 113-122.

10. Bourne, H.R., Sanders, D.A., and McCormick, F. (1991) The GTPase superfamily: conserved structure and molecular mechanism. Nature 349: 117-127.

11. Vetter, I.R., and Wittinghofer, A. (2001) The guanine nucleotide-binding switch in three dimensions. Science 294: 1299-1304.

12. Berman, D.M., Kozasa, Т., and Gilman, A.G. (1996) The GTPase-activating protein RGS4 stabilizes the transition state for nucleotide hydrolysis. J. Biol. Chem. 271: 2720927212.

13. Seewald, M.J., Korner, C., Wittinghofer, A., and Vetter, I.R. (2002) RanGAP mediates GTP hydrolysis without an arginine finger. Nature 415: 662-666.

14. Moller, W., and Amons, R. (1985) Phosphate-binding sequences in nucleotide-binding proteins. FEBS Lett. 186: 1-7.

15. Moore, K.J., Webb, M.R., and Eccleston, J.F. (1993) Mechanism of GTP hydrolysis by p21N-ras catalyzed by GAP: studies with a fluorescent GTP analogue. Biochemistry 32:7451-7459.

16. Langen, R., Schweins, T., and Warshel, A. (1992) On the mechanism of guanosine triphosphate hydrolysis in ras p21 proteins. Biochemistry 31: 8691-8696.

17. Schweins, T., Langen, R., and Warshel, A. (1994) Why have mutagenesis studies not located the general base in ras p21. Nat. Struct. Biol. 1: 476-484.

18. Schweins, T., Geyer, M., Kalbitzer, H.R., Wittinghofer, A., and Warshel, A. (1996) Linear free energy relationships in the intrinsic and GTPase activating protein-stimulated guanosine 5'-triphosphate hydrolysis of p21ras. Biochemistry 35: 14225-14231.

19. Coleman, D.E., Berghuis, A.M., Lee, E., Linder, M.E., Gilman, A.G., and Sprang, S.R. (1994) Structures of active conformations of G| alpha 1 and the mechanism of GTP hydrolysis. Science 265: 1405-1412.

20. Sondek, J., Lambright, D.G., Noel, J.P., Hamm, H.E., and Sigler, P.B. (1994) GTPase mechanism of Gproteins from the 1.7-A crystal structure of transducin alpha-GDP-AIF4\ Nature 372: 276-279.

21. Rittinger, K., Walker, P.A., Eccleston, J.F., Smerdon, S.J., and Gamblin, S.J. (1997) Structure at 1.65 A of RhoA and its GTPase-activating protein in complex with a transitionstate analogue. Nature 389: 758-762.

22. Scheffzek, K., Ahmadian, M.R., Kabsch, W., Wiesmuller, L., Lautwein, A., Schmitz, F., and Wittinghofer, A. (1997) The Ras-RasGAP complex: structural basis for GTPase activation and its loss in oncogenic Ras mutants. Science 277: 333-338.

23. Tesmer, J.J., Berman, D.M., Gilman, A.G., and Sprang, S.R. (1997) Structure of RGS4 bound to AIF4"-activated Gj alphal: stabilization of the transition state for GTP hydrolysis. Cell 89: 251-261.

24. Maegley, K.A., Admiraal, S.J., and Herschlag, D. (1996) Ras-catalyzed hydrolysis of GTP: a new perspective from model studies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8160-8166.

25. Scheidig, A.J., Burmester, C., and Goody, R.S. (1999) The pre-hydrolysis state of p21 (ras) in complex with GTP: new insights into the role of water molecules in the GTP hydrolysis reaction of ras-like proteins. Structure Fold. Des. 7: 1311-1324.

26. Kjeldgaard, M., and Nyborg, J. (1992) Refined structure of elongation factor EF-Tu from Escherichia coii. J. Moi. Biol. 223: 721-742.

27. Abel, K., Yoder, M.D., Hilgenfeld, R., and Jurnak, F. (1996) An alpha to beta conformational switch in EF-Tu. Structure 4:1153-1159.

28. Polekhina, G., Thirup, S., Kjeldgaard, M., Nissen, P., Lippmann, C., and Nyborg, J. (1996) Helix unwinding in the effector region of elongation factor EF-Tu-GDP. Structure 4: 1141-1151.

29. Berchtold, H., Reshetnikova, L., Reiser, C.O., Schirmer, N.K., Sprinzl, M., and Hilgenfeld, R. (1993) Crystal structure of active elongation factor Tu reveals major domain rearrangements. Nature 365:126-132.

30. Kjeldgaard, M., Nissen, P., Thirup, S., and Nyborg, J. (1993) The crystal structure of elongation factor EF-Tu from Thermus aquaticus in the GTP conformation. Structure 1: 3550.

31. Nissen, P., Kjeldgaard, M., Thirup, S., Polekhina, G., Reshetnikova, L., Clark, B.F., and Nyborg, J. (1995) Crystal structure of the ternary complex of Phe-tRNAPhe, EF-Tu, and a GTP analog. Science 270: 1464-1472.

32. Nissen, P., Thirup, S., Kjeldgaard, M., and Nyborg, J. (1999) The crystal structure of Cys-tRNACys-EF-Tu-GDPNP reveals general and specific features in the ternary complex and in tRNA. Structure Fold. Des. 7:143-156.

33. Roll-Mecak, A., Cao, C., Dever, T.E., and Burley, S.K. (2000) X-Ray structures of the universal translation initiation factor IF2/elF5B: conformational changes on GDP and GTP binding. Cell 103: 781-792.

34. Meunier, S., Spurio, R., Czisch, M., Wechselberger, R., Guenneugues, M., Gualerzi, C.O., and Boelens, R. (2000) Structure of the fMet-tRNA(fMet)-binding domain of B. stearothermophilus initiation factor IF2. EMBO J. 19: 1918-1926.

35. Moore, P.B. (1995) Molecular mimicry in protein synthesis? Science 270: 1453-1454.

36. Liljas, A. (1996) Imprinting through molecular mimicry. Protein synthesis. Curr. Biol. 6: 247-249.

37. Nyborg, J., Nissen, P., Kjeldgaard, M., Thirup, S., Polekhina, G., Clark, B.F., and Reshetnikova, L. (1997) Macromolecular mimicry in protein biosynthesis. Fold. Des. 2: S7-11.

38. Ito, K., Ebihara, K., Uno, M., and Nakamura, Y. (1996) Conserved motifs In prokaryotic and eukaryotic polypeptide release factors: tRNA-protein mimicry hypothesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5443-5448.

39. Nakamura, Y., Ito, K., and Isaksson, L.A. (1996) Emerging understanding of translation termination. Cell 87:147-150.

40. Brock, S., Szkaradkiewicz, K., and Sprinzl, M. (1998) Initiation factors of protein biosynthesis in bacteria and their structural relationship to elongation and termination factors. Mol. Microbiol. 29: 409-417.

41. Selmer, M., Al-Karadaghi, S., Hirokawa, G., Kaji, A., and Liljas, A. (1999) Crystal structure of Thermotoga maritima ribosome recycling factor: a tRNA mimic. Science 286: 2349-2352.

42. Hilgenfeld, R. (1995) How do the GTPases really work? Nat. Struct. Biol. 2: 3-6.

43. Kaziro, Y. (1978) The role of guanosine 5'-triphosphate in polypeptide chain elongation. Biochim. Biophys. Acta 505: 95-127.

44. Rodnina, M.V., Savelsbergh, A., Katunin, V.I., and Wintermeyer, W. (1997) Hydrolysis of GTP by elongation factor G drives tRNA movement on the ribosome. Nature 385: 37-41.

45. Tomsic, J., Vitali, L.A., Daviter, T., Savelsbergh, A., Spurio, R., Striebeck, P., Wintermeyer, W., Rodnina, M.V., and Gualerzi, C.O. (2000) Late events of translation initiation in bacteria: a kinetic analysis. EMBO J. 19: 2127-2136.

46. Zavialov, A.V., Buckingham, R.H., and Ehrenberg, M. (2001) A posttermination ribosomal complex is the guanine nucleotide exchange factor for peptide release factor RF3. Cell 107: 115-124.

47. Rodnina, M.V., Stark, H., Savelsbergh, A., Wieden, H.J., Mohr, D., Matassova, N.B., Peske, F., Daviter, T., Gualerzi, C.O., and Wintermeyer, W. (2000) GTPases mechanisms and functions of translation factors on the ribosome. Biol. Chem. 381: 377-387.

48. Pape, T., Wintermeyer, W., and Rodnina, M.V. (1998) Complete kinetic mechanism of elongation factor Tu-dependent binding of aminoacyl-tRNA to the A site of the E. coli ribosome. EMBO J. 17: 7490-7497.

49. Rodnina, M.V., Pape, T., Fricke, R., Kuhn, L., and Wintermeyer, W. (1996) Initial binding of the elongation factor Tu.GTP.aminoacyl-tRNA complex preceding codon recognition on the ribosome. J. Biol. Chem. 271: 646-652.

50. Rodnina, M.V., Fricke, R., Kuhn, L., and Wintermeyer, W. (1995) Codon-dependent conformational change of elongation factor Tu preceding GTP hydrolysis on the ribosome. EMBOJ. 14: 2613-2619.

51. Rodnina, M.V., Pape, T., Fricke, R., and Wintermeyer, W. (1995) Elongation factor Tu, a GTPase triggered by codon recognition on the ribosome: mechanism and GTP consumption. Biochem Cell Biol 73: 1221-1227.

52. Savelsbergh, A., Katunin, V., Mohr, D., Peske, F., Rodnina, M., and Wintermeyer, W. (2003) An elongation factor G-induced ribosome rearrangement precedes tRNA-mRNA translocation. Mol. Cell 11: 1517-1523.

53. Dell, V.A., Miller, D.L., and Johnson, A.E. (1990) Effects of nucleotide- and aurodox-induced changes in elongation factor Tu conformation upon its interactions with aminoacyl transfer RNA. A fluorescence study. Biochemistry 29: 1757-1763.

54. Rodnina, M.V., Pape, T., Fricke, R., and Wintermeyer, W. (1995) Elongation factor Tu, a GTPase triggered by codon recognition on the ribosome: mechanism and GTP consumption. Biochem. Cell Biol. 73:1221-1227.

55. Parmeggiani, A., and Sander, G. (1981) Properties and regulation of the GTPase activities of elongation factors Tu and G, and of initiation factor 2. Mol. Cell Biochem. 35: 129-158.

56. Piepenburg, O., Pape, T., Pleiss, J.A., Wintermeyer, W., Uhlenbeck, O.C., and Rodnina, M.V. (2000) Intact aminoacyl-tRNA is required to trigger GTP hydrolysis by elongation factor Tu on the ribosome. Biochemistry 39: 1734-1738.

57. Ogle, J.M., Brodersen, D.E., Clemons, W.M., Jr., Tarry, M.J., Carter, A.P., and Ramakrishnan, V. (2001) Recognition of cognate transfer RNA by the 30S ribosomal subunit. Science 292: 897-902.

58. Pape, T., Wintermeyer, W., and Rodnina, M.V. (2000) Conformational switch in the decoding region of 16S rRNA during aminoacyl-tRNA selection on the ribosome. Nat. Struct. Biol. 7: 104-107.

59. Ogle, J.M., Murphy, F.V., Tarry, M.J., and Ramakrishnan, V. (2002) Selection of tRNA by the ribosome requires a transition from an open to a closed form. Cell 111: 721-732.

60. Cate, J.H., Yusupov, M.M., Yusupova, G.Z., Earnest, T.N., and Noller, H.F. (1999) X-ray crystal structures of 70S ribosome functional complexes. Science 285: 2095-2104.

61. Tapprich, W.E., and Dahlberg, A.E. (1990) A single base mutation at position 2661 in E. coli 23S ribosomal RNA affects the binding of ternary complex to the ribosome. EMBO J. 9: 2649-2655.

62. Powers, T., and Noller, H.F. (1993) Evidence for functional interaction between elongation factor Tu and 16S ribosomal RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1364-1368.

63. O'Connor, M., Brunelli, C.A., Firpo, M.A., Gregory, S.T., Lieberman, K.R., Lodmell, J.S., Moine, H., Van Ryk, D.I., and Dahlberg, A.E. (1995) Genetic probes of ribosomal RNA function. Biochem. Cell Biol. 73: 859-868.

64. Lodmell, J.S., and Dahlberg, A.E. (1997) A conformational switch in Escherichia coli 16S ribosomal RNA during decoding of messenger RNA. Science 277:1262-1267.

65. Yarus, M., and Smith, D. (1995) tRNA on the ribosome: a waggle theory. In tRNA: Structure, Biosynthesis and Function. RajBhandary, D.S.a.U. (ed). Washington, D.C.: USA: American Society for Microbiology, pp. 443-468.

66. Rodnina, M.V., Fricke, R., and Wintermeyer, W. (1994) Transient conformational states of aminoacyl-tRNA during ribosome binding catalyzed by elongation factor Tu. Biochemistry 33:12267-12275.

67. Stark, H., Rodnina, M.V., Rinke-Appel, J., Brimacombe, R., Wintermeyer, W., and van Heel, M. (1997) Visualization of elongation factor Tu on the Escherichia coli ribosome. Nature 389: 403-406.

68. Stark, H., Rodnina, M.V., Wieden, H.J., Zemlin, F., Wintermeyer, W., and van Heel, M. (2002) Ribosome interactions of aminoacyl-tRNA and elongation factor Tu in the codon-recognition complex. Nat. Struct. Biol. 9: 849-854.

69. Valle, M., Sengupta, J., Swami, N.K., Grassucci, R.A., Burkhardt, N., Nierhaus, K.H., Agrawal, R.K., and Frank, J. (2002) Cryo-EM reveals an active role for aminoacyl-tRNA in the accommodation process. EMBO J. 21: 3557-3567.

70. Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Capel, M., Moore, P.B., and Steitz, T.A. (1999) Placement of protein and RNA structures into a 5 A-resolution map of the 50S ribosomal subunit. Nature 400: 841-847.

71. Katunin, V.I., Savelsbergh, A., Rodnina, M.V., and Wintermeyer, W. (2002) Coupling of GTP hydrolysis by elongation factor G to translocation and factor recycling on the ribosome. Biochemistry 41: 12806-12812.

72. Spirin, A.S. (1968) On the mechanism of ribosome function. The hypothesis of locking-unlocking of subparticles. Dokl. Akad. Nauk SSSR179:1467-1470.

73. Ramakrishnan, V. (2002) Ribosome structure and the mechanism of translation. Cell 108: 557-572.

74. Scolnick, E., Tompkins, R., Caskey, T., and Nirenberg, M. (1968) Release factors differing in specificity for terminator codons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 61: 768-774.

75. Kisselev, L.L., and Buckingham, R.H. (2000) Translational termination comes of age. Trends Biochem. Sci. 25: 561-566.

76. Milman, G., Goldstein, J., Scolnick, E., and Caskey, T. (1969) Peptide chain termination. 3. Stimulation of in vitro termination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63: 183-190.

77. Grentzmann, G., Brechemier-Baey, D., Heurgue, V., Mora, L., and Buckingham, R.H. (1994) Localization and characterization of the gene encoding release factor RF3 in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad Sci. USA 91: 5848-5852.

78. Mikuni, O., Ito, K., Moffat, J., Matsumura, K., McCaughan, K., Nobukuni, T., Tate, W., and Nakamura, Y. (1994) Identification of the prfC gene, which encodes peptide-chain-release factor 3 of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5798-5802.

79. Freistroffer, D.V., Pavlov, M.Y., MacDougall, J., Buckingham, R.H., and Ehrenberg, M. (1997) Release factor RF3 in E.coli accelerates the dissociation of release factors RF1 and RF2 from the ribosome in a GTP-dependent manner. EMBO J. 16: 4126-4133.

80. Goldstein, J.L., and Caskey, C.T. (1970) Peptide chain termination: effect of protein S on ribosomal binding of release factors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 67: 537-543.

81. Pel, H.J., Moffat, J.G., Ito, K., Nakamura, Y.f and Tate, W.P. (1998) Escherichia coli release factor 3: resolving the paradox of a typical G protein structure and atypical function with guanine nucleotides. RNA 4: 47-54.

82. Sprang, S.R. (1997) G protein mechanisms: insights from structural analysis. Annu. Rev. Biochem. 66: 639-678.

83. Frolova, L., Le Goff, X., Zhouravleva, G., Davydova, E., Philippe, M., and Kisselev, L. (1996) Eukaryotic polypeptide chain release factor eRF3 is an eRF1- and ribosome-dependent guanosine triphosphatase. RNA 2: 334-341.

84. Zavialov, A.V., Mora, L., Buckingham, R.H., and Ehrenberg, M. (2002) Release of peptide promoted by the GGQ motif of class 1 release factors regulates the GTPase activity of RF3. Mol. Cell 10: 789-798.

85. Ott, G., Faulhammer, H.G., and Sprinzl, M. (1989) Interaction of elongation factor Tu from Escherichia coli with aminoacyl-tRNA carrying a fluorescent reporter group on the 3' terminus. Eur. J. Biochem. 184: 345-352.

86. Abrahamson, J.K., Laue, T.M., Miller, D.L., and Johnson, A.E. (1985) Direct determination of the association constant between elongation factor Tu X GTP and aminoacyl-tRNA using fluorescence. Biochemistry 24: 692-700.

87. Baca, O.G., Rohrbach, M.S., and Bodley, J.W. (1976) Equilibrium measurements of the interactions of guanine nucleotides with Escherichia coli elongation factor G and the ribosome. Biochemistry 15: 4570-4574.

88. Gromadski, K.B., Wieden, H.J., and Rodnina, M.V. (2002) Kinetic mechanism of elongation factor Ts-catalyzed nucleotide exchange in elongation factor Tu. Biochemistry 41: 162-169.

89. Wittinghofer, F. (1998) Ras signalling. Caught in the act of the switch-on. Nature 394: 317,319-320.

90. Nixon, A.E., Brune, M., Lowe, P.N., and Webb, M.R. (1995) Kinetics of inorganic phosphate release during the interaction of p21ras with the GTPase-activating proteins, p120-GAP and neurofibromin. Biochemistry 34: 15592-15598.

91. Ting, T.D., and Ho, Y.K. (1991) Molecular mechanism of GTP hydrolysis by bovine transducin: pre-steady-state kinetic analyses. Biochemistry 30: 8996-9007.

92. Agrawal, R.K., Penczek, P., Grassucci, R.A., and Frank, J. (1998) Visualization of elongation factor G on the Escherichia coli 70S ribosome: the mechanism of translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 6134-6138.

93. Stark, H., Rodnina, M.V., Wieden, H.J., van Heel, M., and Wintermeyer, W. (2000) Large-scale movement of elongation factor G and extensive conformational change of the ribosome during translocation. Cell 100: 301-309.

94. Wahl, M.C., Bourenkov, G.P., Bartunik, H.D., and Huber, R. (2000) Flexibility, conformational diversity and two dimerization modes in complexes of ribosomal protein L12. EMBOJ. 19: 174-186.

95. Mohr, D., Wintermeyer, W., and Rodnina, M.V. (2002) GTPase activation of elongation factors Tu and G on the ribosome. Biochemistry 41: 12520-12528.

96. Savelsbergh, A., Mohr, D., Wilden, B., Wintermeyer, W., and Rodnina, M.V. (2000) Stimulation of the GTPase Activity of Translation Elongation Factor G by Ribosomal Protein L7/12. J. Biol. Chem. 275: 890-894.

97. Stoffler, G., Cundliffe, E., Stoffler-Meilicke, M., and Dabbs, E.R. (1980) Mutants of Escherichia coli lacking ribosomal protein L11. J. Biol. Chem. 255: 10517-10522.

98. Rodnina, M.V., Savelsbergh, A., Matassova, N.B., Katunin, V.I., Semenkov, Y.P., and Wintermeyer, W. (1999) Thiostrepton inhibits the turnover but not the GTPase of elongation factor G on the ribosome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 9586-9590.

99. Savelsbergh, A., Matassova, N.B., Rodnina, M.V., and Wintermeyer, W. (2000) Role of domains 4 and 5 in elongation factor G functions on the ribosome. J. Mol. Biol. 300: 951961.

100. Knudsen, C.R., and Clark, B.F. (1995) Site-directed mutagenesis of Arg58 and Asp86 of elongation factor Tu from Escherichia coli: effects on the GTPase reaction and aminoacyl-tRNA binding. Protein Eng. 8: 1267-1273.

101. Mohr, D., Wintermeyer, W., and Rodnina, M.V. (2000) Arginines 29 and 59 of elongation factor G are important for GTP hydrolysis or translocation on the ribosome. EMBOJ. 19: 3458-3464.

102. Belitsina, N.V., Glukhova, M.A., and Spirln, A.S. (1975) Translocation in ribosomes by attachment-detachment of elongation factor G without GTP cleavage: evidence from a column-bound ribosome system. FEBS Lett. 54: 35-38.

103. Spirin, A.S. (1985) Ribosomal translocation: facts and models. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 32: 75-114.

104. Abel, K., and Jurnak, F. (1996) A complex profile of protein elongation: translating chemical energy into molecular movement. Structure 4: 229-238.

105. Gavrilova, L.P., Kostiashkina, O.E., Koteliansky, V.E., Rutkevitch, N.M., and Spirin, A.S. (1976) Factor-free ("non-enzymic") and factor-dependent systems of translation of polyuridylic acid by Escherichia coli ribosomes. J. Mol. Biol. 101: 537-552.

106. Southworth, D.R., Brunelle, J.L., and Green, R. (2002) EFG-independent translocation of the mRNA:tRNA complex is promoted by modification of the ribosome with thiol-specific reagents. J. Mol. Biol. 324: 611-623.

107. Moazed, D., and Noller, H.F. (1989) Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome. Nature 342:142-148.

108. Cundliffe, E. (1990) Recognition sites for antibiotics within rRNA. Washington, DC: American Society for Microbiology, 479-490.

109. Modolell, J., and Vazquez (1977) The Inhibition of ribosomal translocation by viomycin. Eur. J. Biochem. 81:491-497.

110. Cundliffe, E. (1972) The mode of action of fusidic acid. Biochem. Biophys. Res. Commun. 46:1794-1801.

111. Borowski, C., Rodnina, M.V., and Wintermeyer, W. (1996) Truncated elongation factor G lacking the G domain promotes translocation of the 3' end but not of the anticodon domain of peptidyl-tRNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 4202-4206.

112. Clark, B.F., and Nyborg, J. (1997) The ternary complex of EF-Tu and its role in protein biosynthesis. Curr. Opiri. Struct. Biol. 7:110-116.

113. Liljas, A., A, A.E., al-Karadaghi, S., Garber, M., Zheltonosova, J., and Brazhnikov, E. (1995) Crystallographic studies of elongation factor G. Biochem. Cell Biol. 73: 1209-1216.

114. Nyborg, J., Nissen, P., Kjeldgaard, M., Thirup, S„ Polekhina, G., and Clark, B.F. (1996) Structure of the ternary complex of EF-Tu: macromolecular mimicry in translation. Trends Biochem. Sci. 21: 81-82.

115. Martemyanov, K.A., and Gudkov, A.T. (1999) Domain IV of elongation factor G from Thermus thermophilus is strictly required for translocation. FEBS Lett. 452: 155-159.

116. Martemyanov, K.A., Yarunin, A.S., Liljas, A., and Gudkov, A.T. (1998) An intact conformation at the tip of elongation factor G domain IV is functionally important. FEBS Lett. 434: 205-208.

117. Kimata, Y., and Kohno, K. (1994) Elongation factor 2 mutants deficient in diphthamide formation show temperature-sensitive cell growth. J. Biol. Chem. 269:13497-13501.

118. Foley, B.T., Moehring, J.M., and Moehring, T.J. (1995) Mutations in the elongation factor 2 gene which confer resistance to diphtheria toxin and Pseudomonas exotoxin A. Genetic and biochemical analyses. J. Biol. Chem. 270: 23218-23225.

119. Martemyanov, K.A., and Gudkov, A.T. (2000) Domain III of elongation factor G from Thermus thermophilus is essential for induction of GTP hydrolysis on the ribosome. J. Biol. Chem. 275: 35820-35824.

120. Rodnina, M.V., Savelsbergh, A., and Wintermeyer, W. (1999) Dynamics of translation on the ribosome: molecular mechanics of translocation. FEMS Microbiol. Rev. 23: 317333.

121. Sharer, J.D., Koosha, H., Church, W.B., and March, P.E. (1999) The function of conserved amino acid residues adjacent to the effector domain in elongation factor G. Proteins 37: 293-302.

122. Laurberg, M., Kristensen, O., Martemyanov, K., Gudkov, A.T., Nagaev, I., Hughes, D., and Liljas, A. (2000) Structure of a mutant EF-G reveals domain III and possibly the fusidic acid binding site. J. Mol. Biol. 303: 593-603.

123. Johanson, U., and Hughes, D. (1994) Fusidic acid-resistant mutants define three regions in elongation factor G of Salmonella typhimurium. Gene 143: 55-59.

124. Johanson, U., Aevarsson, A., Liljas, A., and Hughes, D. (1996) The dynamic structure of EF-G studied by fusidic acid resistance and internal revertants. J. Mol. Biol. 258: 420-432.

125. Czworkowski, J., and Moore, P.B. (1997) The conformational properties of elongation factor G and the mechanism of translocation. Biochemistry 36: 10327-10334.

126. Johanson, U., and Hughes, D. (1994) Fusidic acid-resistant mutants define three regions in elongation factor G of Salmonella typhimurium. Gene 143: 55-59.

127. Spirin, A.S. (1969) A model of the functioning ribosome: locking and unlocking of the ribosome subparticles. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 34: 197-207.

128. Liljas, A., and Garber, M. (1995) Ribosomal proteins and elongation factors. Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 721-727.

129. Girshovich, A.S., Bochkareva, E.S., and Gudkov, A.T. (1982) Specific interaction of the elongation factor EF-G with the ribosomal 23 S RNA from Escherichia coli. FEBS Lett. 150: 99-102.

130. Skold, S.E. (1983) Chemical crosslinking of elongation factor G to the 23S RNA in 70S ribosomes from Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 11: 4923-4932.

131. Matassova, A.B., Rodnina, M.V., and Wintermeyer, W. (2001) Elongation factor G-induced structural change in helix 34 of 16S rRNA related to translocation on the ribosome. RNA 7: 1879-1885.

132. Hausner, T.P., Atmadja, J., and Nierhaus, K.H. (1987) Evidence that the G2661 region of 23S rRNA is located at the ribosomal binding sites of both elongation factors. Biochimie 69:911-923.

133. Munishkin, A., and Wool, I.G. (1997) The ribosome-in-pieces: binding of elongation factor EF-G to oligoribonucleotides that mimic the sarcin/ricin and thiostrepton domains of 23S ribosomal RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 12280-12284.

134. Wilson, K.S., and Noller, H.F. (1998) Mapping the position of translational elongation factor EF-G in the ribosome by directed hydroxyl radical probing. Cell 92: 131-139.

135. Moazed, D., and Noller, H.F. (1986) Transfer RNA shields specific nucleotides in 16S ribosomal RNA from attack by chemical probes. Cell 47: 985-994.

136. Prince, J.B., Taylor, B.H., Thurlow, D.L., Ofengand, J., and Zimmermann, R.A. (1982) Covalent crosslinking of tRNA/3' to 16S RNA at the ribosomal P site: identification of crosslinked residues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5450-5454.

137. Serdyuk, I., Baranov, V., Tsalkova, T., Gulyamova, D., Pavlov, M., Spirin, A., and May, R. (1992) Structural dynamics of translating ribosomes. Biochimie 74: 299-306.

138. Stark, H., Mueller, F., Orlova, E.V., Schatz, M., Dube, P., Erdemir, T., Zemlin, F., Brimacombe, R., and van Heel, M. (1995) The 70S Escherichia coli ribosome at 23 A resolution: fitting the ribosomal RNA. Structure 3: 815-821.

139. Stark, H., Orlova, E.V., Rinke-Appel, J., Junke, N., Mueller, F., Rodnina, M., Wintermeyer, W., Brimacombe, R., and van Heel, M. (1997) Arrangement of tRNAs in pre-and posttranslocational ribosomes revealed by electron cryomicroscopy. Cell 88: 19-28.

140. Frank, J., and Agrawal, R.K. (2000) A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation. Nature 406: 318-322.

141. Moine, H., and Dahlberg, A.E. (1994) Mutations in helix 34 of Escherichia coli 16 S ribosomal RNA have multiple effects on ribosome function and synthesis. J. Mol. Biol. 243: 402-412.

142. Prescott, C.D., and Kornau, H.C. (1992) Mutations in E.coli 16s rRNA that enhance and decrease the activity of a suppressor tRNA. Nucleic Acids Res. 20: 1567-1571.

143. Carter, A.P., Clemons, W.M., Brodersen, D.E., Morgan-Warren, R.J., Wimberly, B.T., and Ramakrishnan, V. (2000) Functional insights from the structure of the 30S ribosomal subunit and its interactions with antibiotics. Nature 407: 340-348.

144. Bollen, A., Davies, J., Ozaki, M., and Mizushima, S. (1968) Ribosomal protein conferring sensitivity to the antibiotic spectinomycin in Escherichia coli. Science 165: 8586.

145. Sigmund, C.D., Ettayebi, M., and Morgan, E.A. (1984) Antibiotic resistance mutations in 16S and 23S ribosomal RNA genes of Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 12: 4653-4663.

146. Powers, T., and Noller, H.F. (1995) Hydroxyl radical footprinting of ribosomal proteins on 16S rRNA. RNA 1:194-209.

147. Wimberly, B.T., Brodersen, D.E., Clemons, W.M.J., Morgan-Warren, R.J., Carter, A.P., Vonrhein, C., Hartsch, T., and Ramakrishnan, V. (2000) Structure of the 30S ribosomal subunit. Nature 407: 327-339.

148. Heilek, G.M., Marusak, R., Meares, C.F., and Noller, H.F. (1995) Directed hydroxyl radical probing of 16S rRNA using Fe(ll) tethered to ribosomal protein S4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1113-1116.

149. Powers, T., and Noller, H.F. (1991) A functional pseudoknot in 16S ribosomal RNA. EMBOJ. 10: 2203-2214.

150. Marsh, R.C., and Parmeggiani, A. (1973) Requirement of proteins S5 and S9 from 30S subunits for the ribosome-dependent GTPase activity of elongation factor G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70: 151-155.

151. Vila-Sanjurjo, A., Ridgeway, W.K., Seymaner, V., Zhang, W., Santoso, S., Yu, K., and Cate, J.H. (2003) X-ray crystal structures of the WT and a hyper-accurate ribosome from Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 100: 8682-8687.

152. Pape, T., Wintermeyer, W., and Rodnina, M. (1999) Induced fit in initial selection and proofreading of aminoacyl-tRNA on the ribosome. EMBO J. 18: 3800-3807.

153. Osswald, M., and Brimacombe, R. (1999) The environment of 5S rRNA in the ribosome: cross-links to 23S rRNA from sites within helices II and III of the 5S molecule. Nucleic Acids Res. 27: 2283-2290.

154. Sergiev, P., Dokudovskaya, S., Romanova, E., Topin, A., Bogdanov, A., Brimacombe, R., and Dontsova, O. (1998) The environment of 5S rRNA in the ribosome: cross-links to the GTPase-associated area of 23S rRNA. Nucleic Acids Res. 26: 2519-2525.

155. Goddard, D.R., and Michaelis, L. (1935). J. Bio. Chem. 236: 416.

156. Anfinsen, C.B. (1958) In Symposium on protein structure N.Y., pp. 223.

157. Sela, M., White, F.H., and Anfinsen, C.B. (1959). Biochim. et Biophys. Acta 31: 417.

158. O'Connor, M„ Lee, W.M., Mankad, A., Squires, C.L., and Dahlberg, A.E. (2001) Mutagenesis of the peptidyltransferase center of 23S rRNA: the invariant U2449 is dispensable. Nucleic Acids Res. 29: 710-715.

159. Rodnina, M.V., and Wintermeyer, W. (1995) GTP consumption of elongation factor Tu during translation of heteropolymeric mRNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1945-1949.

160. Roughton, F.J.W. (1934). Proc. R. Soc. B115: 475.

161. Chance, B. (1940). J. Franklin Inst. 229: 455, 613, 537.

162. Wintermeyer, W., and Zachau, H.G. (1970) A specific chemical chain scission of tRNA at 7-methylguanosine. FEBS Lett. 11: 160-164.

163. Wintermeyer, W., and Zachau, H.G. (1971) Replacement of Y base, dihydrouracil, and 7-methylguanine in tRNA by artificial odd bases. FEBS Lett. 18: 214-218.

164. O'Connor, M., and Dahlberg, A.E. (1993) Mutations at U2555, a tRNA-protected base in 23S rRNA, affect translational fidelity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 9214-9218.

165. Miller, J.H. (1991) A Short Course in Bacterial Genetics. Plainview, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

166. Hirsh, D., and Gold, L. (1971) Translation of the UGA triplet in vitro by tryptophan transfer RNA's. J. Mol. Biol. 58: 459-468.

167. Davies, J., Jones, D.S., and Khorana, H.G. (1966) A further study of misreading of codons induced by streptomycin and neomycin using ribopolynucleotides containing two nucleotides in alternating sequence as templates. J. Mol. Biol. 18: 48-57.

168. Weiss, W.A., Edelman, I., Culbertson, M.R., and Friedberg, E.C. (1987) Physiological levels of normal tRNA(CAGGIn) can effect partial suppression of amber mutations in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8031-8034.

169. Harger, J.W., Meskauskas, A., and Dinman, J.D. (2002) An "integrated model" of programmed ribosomal frameshifting. Trends Biochem. Sci. 27: 448-454.

170. O'Connor, M., Thomas, C.L., Zimmermann, R.A., and Dahlberg, A.E. (1997) Decoding fidelity at the ribosomal A and P sites: influence of mutations in three different regions of the decoding domain in 16S rRNA. Nucleic Acids Res. 25:1185-1193.

171. Merryman, C., Moazed, D., McWhirter, J., and Noller, H.F. (1999) Nucleotides in 16S rRNA protected by the association of 30S and 50S ribosomal subunits. J. Mol. Biol. 285: 97-105.

172. Nissen, P., Hansen, J., Ban, N., Moore, P.B., and Steitz, T.A. (2000) The structural basis of ribosome activity in peptide bond synthesis. Science 289: 920-930.

173. Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P.B., and Steitz, T.A. (2000) The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution. Science 289: 905-920.

174. Correll, C.C., Munishkin, A., Chan, Y.-L., Ren, Z., Wool, I.G., and Steitz, T.A. (1998) Crystal structure of the ribosomal RNA domain essential for binding elongation factors.

175. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13436-13441.

176. Harms, J., Schiuenzen, F., Zarivach, R., Bashan, A., Gat, S., Agmon, I., Bartels, H., Franceschi, F., and Yonath, A. (2001) High resolution structure of the large ribosomal subunit from a mesophilic eubacterium. Cell 107: 679-688.

177. Macbeth, M.R., and Wool, I.G. (1999) The phenotype of mutations of G2655 in the sarcin/ricin domain of 23 S ribosomal RNA. J. Mol. Biol. 285: 965-975.

178. Leonov, A.A., Sergiev, P.V., Bogdanov, A.A., Brimacombe, R., and Dontsova, O.A. (2003) Affinity purification of ribosomes with a lethal G2655C mutation in 23 S rRNA that affects the translocation. J. Biol. Chem. 278: 25664-25670.

179. Macon, J.B., and Wolfenden, R. (1968) 1-Methyladenosine. Dimroth rearrangement and reversible reduction. Biochemistry 7: 3453-3458.

180. Lynch, S.R., and Puglisi, J.D. (2001) Structure of a eukaryotic decoding region A-site RNA. J. Mol. Biol. 306: 1023-1035.

181. Blanchard, S.C., and Puglisi, J.D. (2001) Solution structure of the A loop of 23S ribosomal RNA. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98: 3720-3725.

182. Hoibrook, S.R., Cheong, C., Tinoco, I., Jr., and Kim, S.H. (1991) Crystal structure of an RNA double helix incorporating a track of non-Watson-Crick base pairs. Nature 353: 579581.

183. Auffinger, P., and Westhof, E. (1999) Singly and bifurcated hydrogen-bonded base-pairs in tRNA anticodon hairpins and ribozymes. J. Mol. Biol. 292: 467-483.

184. Hartman, K.A.J., and Rich, A. (1965) The tautomeric form of helical polyribocytidylic acid. J. Am. Chem. Soc. 87: 2033-2039.

185. Chen, L., Cai, L., Zhang, X., and Rich, A. (1994) Crystal structure of a four-stranded intercalated DNA: d(C4). Biochemistry 33:13540-13546.

186. Holland, J.A., and Hoffman, D.W. (1996) Structural features and stability of an RNA triple helix in solution. Nucleic Acids Res. 24: 2841-2848.

187. Brodsky, A.S., Erlacher, H.A., and Williamson, J.R. (1998) NMR evidence for a base triple in the HIV-2 TAR C"G.C+ mutant-argininamide complex. Nucleic Acids Res. 26: 1991-1995.

188. Pan, B., Mitra, S.N., and Sundaralingam, M. (1999) Crystal structure of an RNA 16-mer duplex R(GCAGAGUUAAAUCUGC)2 with nonadjacent G(syn).A+(anti) mispairs. Biochemistry 38: 2826-2831.

189. Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.

190. Rodnina, M.V., Savelsbergh, A., Matassova, N.B., Katunin, V.l., Semenkov, Y.P., and Wintermeyer, W. (1999) Thiostrepton inhibits the turnover but not the GTPase of elongation factor G on the ribosome. Proc. Natl. Acad. Sc.i USA 96: 9586-9590.