Структурно-функциональные исследования новых токсичных белков яда гадюки Vipera nikolskii тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. АКАДЕМИКОВ М.М.ШЕМЯКИНА И Ю.А.ОВЧИННИКОВА РАН

На правах рукописи

Рамазанова Анна Сергеевна

Структурно-функциональные исследования новых токсичных белков яда гадюки Vípera nikolskii

4855349

Специальность 02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

-6 ОПТ 2011

Москва-2011

4855349

Работа выполнена в Отделе молекулярных основ нейросигнализации Учреждения Российской Академии Наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Научный руководитель:

профессор, доктор химических наук, Уткин Юрий Николаевич

Официальные оппоненты:

профессор, доктор химических наук, Золотарев Юрий Александрович

доцент, доктор биологических наук, Патрушев Лев Иванович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биофизики клетки

Защита состоится «12» октября 2011 г. В 11 часов на заседании диссертационного совета Д.002.019.01 при Учреждении Российской Академии Наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН по адресу: 117997, Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской Академии Наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.

Автореферат разослан «_» 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

Доктор физико-математических наук

В.А.Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Поиск белков с новыми фармакологическими свойствами, которые могут использоваться в качестве инструментов для фундаментальных исследований физиологических процессов, протекающих в живых организмах, а также служить основой для создания новых лекарственных препаратов, является актуальной проблемой современной биоорганической химии. Яды змей, представляющие собой сложные многокомпонентные белковые смеси с ярко выраженной биологической активностью, до сих пор остаются ценными источниками таких соединений. Яды змей исследуются уже давно и к настоящему моменту большинство из них достаточно хорошо изучено. Наиболее вероятно, что соединения с новыми свойствами. могут быть обнаружены либо среди мало представленных в ядах соединений, либо в малоизученных или вовсе не изученных ядах. В свете этого представлялось весьма актуальным проведение исследования компонентов яда гадюки Никольского (Vipern nikolskii), обитающей в лесостепной зоне на юге России и Украины. Эта змея лишь недавно была выделена в новый вид, а ранее рассматривалась как черная (меланистическая) форма гадюки обыкновенной Vipern bertis. Яд V. nikolskii совершенно не исследован и может содержать новые белки, не встречающиеся у V. berus.

Следует также отметить, что в последнее время с применением методов генной инженерии идентифицировано большое количество белков, представляющих собой новые типы и подтипы рецепторов и ионных каналов. Однако их функциональная характеристика зачастую затруднена отсутствием специфических лигандов. Яды змей служили и продолжают служить источником селективных лигандов рецепторов и ионных каналов. В качестве примера можно привести а-нейротоксины, сыгравшие важную роль в изучении никотиновых холинорецепторов. Тем не менее, возможности змеиных ядов как источников для выделения токсинов со специфической структурой и функцией использованы лишь в небольшой степени.

Данная работа посвящена изучению яда гадюки Никольского с целью структурной характеристики новых белков, которые могут быть использованы для решения обозначенных проблем.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлись идентификация, выделение и структурно-функциональные исследования ранее неизвестных . белковых токсинов, принадлежащих к разным

структурным семействам. В качестве объекта исследования была выбрана гадюка V. nikolskii.

Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:

1. Выбрать семейства белков змеиных ядов, новые представители которых могут быть найдены у гадюк V. nikolskii и V. berus.

2. Осуществить оптимизацию условий клонирования для идентификации экспрессирующихся новых белков.

3. Провести клонирование и секвенирование кДНК, кодирующих новые белки ядов V. nikolskii и V. berus, и установить полные аминокислотные последовательности идентифицированных новых компонентов.

4. Выделить из ядов новые белки, для которых установлены аминокислотные последовательности, и исследовать их биологическую активность.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые проведено исследование яда нового вида гадюки - гадюки Никольского. В результате идентифицирован ряд новых белков, для которых установлены аминокислотные последовательности. Эти белки принадлежат к различным структурно-функциональным семействам, включая фосфолипазы А2) протеолитические ферменты и их ингибиторы, трехпетельные токсины и др. Так, в яде V. nikolskii обнаружены две гетеродимерные фосфолипазы А2, установлены их полные аминокислотные последовательности и изучена биологическая активность. Отсутствие этих ферментов в яде гадюки обыкновенной V. berus подтверждает корректность выделения V. nikolskii в отдельный вид. Определены также аминокислотные последовательности никобина, новой тромбиноподобной сериновой протеиназы, и ингибитора протеиназ типа Кунитц. Некоторые тромбиноподобные протеиназы используются в диагностике состояния системы гомеостаза, в частности, в так называемом рептилазном тесте. Поскольку никобин отличается по последовательности от известных протеиназ, он может обладать уникальными свойствами. Впервые в яде змей подсемейства Viperinae идентифицированы белки семейства CRISP (цистеин-богатые секреторные белки), для которых установлены аминокислотные последовательности. Также впервые в подсемействе Viperinae показана экспрессия трехпетельных токсинов в ядовитой железе V. nikolskii. Эти токсины являются основными компонентами ядов змей семейства Elapidae. У всех изученных белков обнаружены уникальные замены в функционально-важных участках молекул, что может приводить к изменению специфичности воздействие на их биологические мишени. Таким образом, в практическом плане эти белки

могут оказаться перспективными для создания новых инструментов исследований физиологических процессов, протекающих в живых организмах, а также в качестве основы для создания новых фармацевтических препаратов.

Апробация работы. Результаты работы представлялись на следующих симпозиумах и конференциях: VIII Международная конференция по физико-химической биологии, посвященная памяти академика Ю.А. Овчинникова, (Москва, 2006), IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, (Новосибирск, 2008), IV Российский симпозиум "Белки и пептиды", (Казань, 2009), 13-я Международная пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 2009), второй международный симпозиум "Биофарма-2010 от науки к промышленности" (Ереван, 2010), V Российский симпозиум "Белки и пептиды", (Петрозаводск, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, выводов и списка литературы, включающего 220 цитируемых работ. Работа изложена на 115 страницах, содержит 7 таблиц и 26 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Яды змей содержат множество полипептидных соединений, с высокой избирательностью воздействующих на различные жизненно важные процессы, происходящие в животных организмах. Идентификация и характеристика таких соединений позволяют получать новые ценные инструменты для изучения процессов жизнедеятельности. Одним из подходов к характеристике белков змеиных ядов является использование методов молекулярной биологии для установления аминокислотных последовательностей белков, экспрессирующихся в ядовитых железах змей, на основе структуры кДНК. В данной работе наряду с методами химии белка такой подход был использован для изучения яда нового вида гадюки Vípera nikolskii. В ходе работы были установлены аминокислотные последовательности и изучены свойства белков, относящихся к различным структурно-функциональным семействам, включая фосфолипазы А2 (ФЛА2), протеазы, ингибиторы ферментов и ионных каналов.

Выбор рациональной схемы клонирования.

При выборе рациональной схемы клонирования кДНК, кодирующих разные классы белков, мы руководствовались следующими положениями:

- простота используемого метода клонирования, т.е. клонирование в разрезанный Т-вектор без предварительной стадии обработки его рестриктазами и без встраивания в праймеры соответствующих сайтов рестрикции;

- использование ПЦР со ступенчатым понижением температуры на стадии отжига для получения специфического продукта;

- использования гнездового ПЦР (nested) для получения искомого продукта в составе продуктов ПЦР;

- учет длины аминокислотной последовательности, кодируемой клонируемыми нуклеотидными последовательностями, при выборе времени элонгации. Так, например, для ФЛА2 (122 аминокислотных остатка) это время составляло 2 минуты, для трехпетельных токсинов (67 аминокислотных остатков) - 20 сек.

Использованный подход позволил установить нуклеотидные последовательности кДНК, кодирующих белки, содержащиеся в яде в различных количествах или не обнаруженные вовсе. Так, гетеродимерные ФЛА2 составляют около 20% сухого яда по весу, а трехпетельные токсины как белки в яде гадюки пока обнаружить не удалось.

Изучение гетеродимерных ФЛА2 V. nikolskiL

Выделение гетеродимерных ФЛА2 из яда.

Для выделения новых белков проводили разделение яда V. nikolskii методом катионнообменной ВЭЖХ (Рис.1А). Полученные в результате фракции 4 и 5 обладали фосфолипазной активностью и были названы HDP-1 (от английского названия HeteroDimeric Phospholipase - 1, гетеродимерная фосфолипаза - 1) и HDP-2, соответственно. На следующем этапе после фракционирования методом обращено-фазовой хроматографии (Рис.1Б) HDP-1 и HDP-2 были разделены каждая на две основные фракции. Определение липолитической активности показало, что более гидрофобные белки (HDP-1P и HDP-2P), элюирующиеся при более высокой концентрации ацетонитрила, обладали ферментативной активностью. Более гидрофильные белки (HDP-1I и HDP-2I) являлись ферментативно неактивными и всегда элюировались как пик с предплечьем, которое не отделялось от главного пика. Молекулярные массы белков HDP-1P и HDP-2P по данным MALDI масс-спектрометрии составили 13798±1 и 13827±1 Да, соответственно. В то время как молекулярные массы ферментативно неактивных компонентов

(НОР-II и НБР-21) совпали (очень сильный сигнал составил 13,624±1Да и небольшой сигнал 13,662±1 Да.). Поэтому в дальнейшем будем называть эту

Рисунок 1. Выделение гетеродимерных ФЛА2 из яда гадюки Никольского. Разделение сырого яда методом катионообменной ВЭЖХ (А) с последующим фракционированием 1ЮР-1 и НОР-2 методом обращенно-фазной ВЭЖХ (Б).

субъединицу - HDP-In. Каждый из выделенных белков восстанавливали дитиоэритритом, алкилировали винилпиридином и подвергали автоматической деградации по Эдману для определения N-концевой аминокислотной последовательности. Полученные данные показали (Рис.2), что N-концевые последовательности компонентов HDP-1P и HDP-2P ФЛА2 из гадюки Никольского гомологичны основным субъединицам гетеродимерных ФЛА2 васпина из V. aspis и вайпоксина из V.ammodites. В тоже время, N-концевая последовательность компонента HDP-In является гомологичной кислым субъединицам васпина и вайпоксина. На основании этих данных мы заключили, что белки HDP-1 и HDP-2 являются гетеродимерными фосфолипазами.

Определение полных аминокислотных последовательностей гетеродимерных ФЛА2.

Наиболее простым способом получения кДНК является обратная транскрипция мРНК и последующая амплификация со специфическими праймерами, структура которых выбирается на основании известных участков аминокислотной последовательности изучаемого белка, или по гомологии с ранее установленными последовательностями родственных белков. В данном случае праймеры выбирались на 5' и З'-нетранслируемые области кДНК, кодирующие последовательности васпина и вайпоксина. Полученный в результате амплификации ПЦР-продукт включал в себя изоформы, соответствующие основным субъединицам HDP-1P и HDP-2P, а также аммодитину II, одноцепочечной ФЛА2 из гадюки V. ammodytes. Выделить из полученных клонов тот, который бы содержал последовательность кислой субъединицы HDP-In, оказалось непросто. Из 23-х изученных клонов лишь один соответствовал кислой субъединице, что для надежного установления последовательности было недостаточно. На основании различий в аминокислотных последовательностях кислой и основных субъединиц, а также аммодитина были выбраны высоко специфические праймеры, соответствующие кодирующим участкам мРНК HDP-In. С использованием этих праймеров, а также праймеров, соответствующих 5' и З'-нетранслируемым участкам методом гнездового (nested) ПЦР был получен ампликон, в результате определения последовательности которого (без стадии клонирования) надежно установили последовательность субъединицы HDP-In (Рис. 2).

Таким образом, нами были установлены аминокислотные последовательности двух гетеродимерных ФЛА2 экспрессирующихся в ядовитой железе гадюки Никольского. Присутствие двух гетеродимерных

ФЛА2 в яде змеи одного вида показано впервые. Идентифицированные нами ФЛА2 обладают высоким сходством с белками из яда европейских видов гадюк: васпином из V. aspis и вайпоксином из V.ammodites. ФЛА2 такого типа отсутствуют в яде гадюки обыкновенной V. berus, что подтверждает справедливость выделения гадюки Никольского в отдельный вид.

ю

20

зо

40

50

ЕО

70

NLFQFAKMTH GKLGAFSVWN YISYGCYCGW GGQGTPKDAT DRCCFVBDCC YGKVRGCNPK LAIYJ^YSFKK GNTVCGKNNG NbFQFAKMZN GKLGAFSWIN YXSYGCYCGW GGQGTPKDAT ttCCFVHDCC YGRVRGCNPK LA1YAYSFKK GHXycgKMWS NLFQFAKMIN GKLGAFSVWN YISYGCYCGW GGQGTPKDAT DRCCFVHDCC YGRVRGCNPK LAIYSYSFKK GNIVCGKNNG NLFQFAKHIN GKLGAFSVWN YISYGCYCGW GGQGTPKDAT DRCCFVHDCC YGRVHGCNPK LAIYSYSFKK GNIVCGKNNG NLFQFAKMIN GKLGAFSVWN YISYGCYCGW GGQGTPKDAT DRCCFVHDCC YGKVKQCNPK r.AIYSYSFKN GNIVCGKNliG

NLFQFGDMIL QKTGKEAVH SYA1YGCYCGW GGQGRAQDAT DRCCFAQDCC YGRVNDCHPK TATYTYSFEN GDIVCGDNUL NLFQFGDMIL QKTGKEAVH SYAIYGCYCGW GGQGRAQDAT DRCCFAQDCC YGKVNDCNPK §ATYTYSFEN GDTVCGDNDL NLFQFGDMIL QKTGKEAVH SYAIYGCYCGW GGQGRAQDAT DRCCFAQDCC YGRVNDCNPK j|ATYTYSFEN GDIVCGDNDL NLFQFGDMIL QKTGKEAVH SYAIYGCYCGW GGQGRAQDAT DRCCFAQDCC YGKVNDCNPK IATYTYSFEH GDIVCGDNDL

90

100

110

120

CLR.DXCECDJ? VAJUfCFSQNQ NTYNKNYKFb SSSRCRQTSE QC HDP-1P

CbRBICECDR VAANCFHQNK NTYNRHYRFL SSSRCRQTSE QC HDP-2P

CLRDICECDR VAANCFHQNK NTYNKNYRFL SSSRCRQTSE QC Q8JFG0

CLRDICECDR VAANCFHQNK NTYNKNYJEFL SSSRCRQTSE QC P14420

CLRDICECDR VAANCFHQNK NTYNKNYHFK SSSRCRQTSE QC 010755

Вэспин субъединица

Вайпохсии субпединица

ФЛА2-1 комплекс суб*ьединица

CLRAVCECDR AAAICLGENV NTYDKNYEYY SISHCTEESE QC BDP-I

CLRAVCECDR AAAICLGENV NTYDKNYEYY SISHCTEESE QC P04084

CLRAVCECDR AAAICLGENV NTYDKNYEYY SISHCTEESE QC Q8JFG1

CLRAVCECDR AAAICLGENV NTYDKNYEYY SISHCTEESE QC Q10754

Вайпоксин субъединица

Васпин суб<ьединица

ФЛА2-1 комплекс суб-ьединица

Рисунок 2. Сравнение аминокислотных последовательностей фосфолипаз А2 V. nikolskii с гомологичными белками других видов змей. Подчеркнуты последовательности, установленные методом Эдмана. Уникальные замены в HDP-1 и 2 выделены серым.

Биологическая активность гетеродимерных ФЛА2.

Исследование биологической активности выделенных белков показало, что основные субъединицы HDP-1P и HDP-2P обладают более высокой ферментативной активностью, чем гетеродимеры HDP-1 и HDP-2, а кислая субъединица HDP-In не активна. Было изучено влияние этих белков на процессы сворачивания крови, включая агрегацию тромбоцитов. Во всех экспериментах ферментативно активные, основные субъединицы HDP-1P и HDP-2P проявляли более высокую по сравнению с гетеродимерами биологическую активность. Они обладали более высокой ферментативной и антикоагулянтной активностью и более эффективно ингибировали агрегацию тромбоцитов. Кислая субъединица HDP-In обладала наименьшей

активностью или была не активна вовсе в этих тестах. В ряде работ было высказано предположение, что в случае вайпоксина эта субъединица при образовании гетеродимера стабилизирует основную активную субъединицу, защищая ее в частности от протеолиза. Исследование биологической активности гетеродимерных фосфолипаз показало наличие у них нейротоксической активности. Так, при изучении влияния этих белков на нервно-мышечную передачу в нервно-мышечном сочленении лягушки была выявлена картина действия типичная для так называемых пресинаптических нейротоксичных ФЛА2. При добавлении HDP-2 и HDP-2P наблюдалось постепенное уменьшение стимулированной секреции ацетилхолина, которое сопровождалось уменьшением частоты миниатюрных потенциалов концевой пластинки и появлением медленно растущих миниатюрных сигналов. Аналогичный эффект наблюдался для типичного нейротоксина кротоксина из яда Crotalus durissus, но при меньших концентрациях.

Изучение тромбиноподобной сериноеой протеииазы и ингибитора сериновых протеиназ типа Кунитиа из гадюки Никольского.

Яды змей содержат целый ряд протеолитических ферментов, воздействующих на разные стадии процесса коагуляции. Эти ферменты относятся к двум разным классам: металлопротеиназам и сериновым протеиназам (СП). Некоторые из СП, сходные по структуре с тромбином, обладают способностью сворачивать плазму крови in vitro. Такие белки, называемые тромбиноподобными ферментами (ТПФ), представлены в ядах многих змей семейств Crotalinae и Viperinae. Это хорошо согласуется с симптомами отравления ядами этих змей - образованием микроциркуляторных и макроциркуляторных тромбозов. Исследования, посвященные изучению влияния на коагуляцию компонентов ядов змей, позволили выделить и охарактеризовать большое число ТПФ, однако, полные первичные структуры определены далеко не для всех выделенных ферментов. В основном это было сделано с применением молекулярного клонирования. Однако, до сих не было установлено ни одной полной аминокислотной последовательности СП змей рода Vípera.

Определение полной аминокислотной последовательности тромбиноподобного белка никобина.

Для экстракции РНК были использованы ядовитые железы нескольких гадюк V. nikolskii. Для клонирования кДНК применяли метод ПЦР со ступенчатым

16 20+ 30 40+ 50 + 60 70 80 90+

tu Jt L VIGGDECNINEHRFLVALYDGLSGTFLCGGTLINQEWVLTAQHCN----------RSLMNIYLGMHNKNVKFDDEQÍWY PKKAYFFRC -N

БСЛИНЕОБИН IIGGDHCNIHEHRFLVALYD-.TJSGSPLCGGTLINÜEVWLTAAHCN----------MSNIYT YLGMHNQSVQFDDEERRYPKEKYLFRC-S

АНКРОЦ VIG'DEONINEHRFLVALYDSTTRNFLCGG^^HPEWVITAXHCN----------KKSMVLYLGKHKQSVKFDDEQERFPKEXHFIRC-N

НИКОЕ t. H VIGGDECNINEHPFLAFVTSDRRR---CAGTLINQEWVbTAAHCN----------GKYMKIELGVHDKMVUNEDKQTRVPKQK- TF-CLS

ТРИПСИН IVG . YTC3ANTVPYQVSLMS---GYHFCGGSIiINSQWVVSAAHCYK- - - - 5GIQVRLGEDNINWE-GNEQFISASKSIVHPSY

ТРОМБИН IVE" QDA EVGr.SPWQWLFRKSPQEIiLCGASLISDRW'/LTAAJlCLLYPPVrtJKNFTVDDLLVRIGKHSRTRYERKVEKISMJ^KI YIHPRY

100 1X0 120 130 + 140 150 + 160 + 170

LMLTL -KNÍTK-WDEP---IRLNRPVRFSAHIEPLSLPSNPPS-----EDSVCRVMGWG-----fll TS PP ETL PDVPHC AN X NLFNYTVCRGAYP

БИЛИНЕОБИН -KNFTK-WDKDIMLIRLNKF'TRNSEHIAPLSLPSSPPI-----VGSYCRVMGWG-----TITSPNETLPDVPRCVNINLFHYTVCRGVFP

АНКРОД -KPRTR-WGEDIMLIRLNKPVNNSEHIAPLSTjPSNPPI-----VGSVCRVMGWG-----SINKYIDVLPDEPRCANINLYNYTVCRGVFP

НИКОБИН SKEYTM-WDKDXMLIRLHTPVMtfSlBIAPVSLASRPPV-----VGSVCRIMGWG-----TISSPKVTLPDVPHCANXEIIKYSKCQGVHP

ТРИПСИН NSN---TLNNDIMblKr.KSA-ASLNSRVASISLPTSCAS-----AGTQCLISGWG-----NTKSSGTS YPDVLKCLKAPILSDSSCKSAYP

ТРОМБИН NWKE- -NLDRDXALLKLXRPIELSDYIHPVCbPDKQTAAKLLKAGFKGRVTGVíGNRRE'II'.'TTSVAEVQPSVLQVVNLPLVERPVCKASTR

180 *190 200 210 • +220 « 230 240 +

LM_TC, --RJIP-T-KVLCAGVLEGGI---DTCNRDSGGPLICNGQFQ------GIVFWGPDPCAQPDXPGVYTKVFDYLDWIQSVIAGNT--TCS-

БИГИНЕОБИН —RLPERSRILCAGVLEGGI---DTCKRDSGGPLICNGQFQ------GIVSVJGPKRCAQPRKPALYSKVFDHLDWIQSIIAGNXTVNCP-

АНКРОЦ —RIPKXSKILCAGDLQGRL---DSCHCDSGGPLICSEEFH------GIVYHGPNPCAQPDKPALYTNIFDHLHWILSIMAGNA--TCYP

НИКОЕ ЛН - - ELPAKGRVVCAGIWQGGK---DSCHGDSGAPLICNGQLQ------GLLSWGGDPCAQPLgPGLYTDirDYSDWIQSIIAGNTT-ATCPP

ТРИПСИН ---GQITSNMFCAGYLEGGC---DSCQGDSGGPWCSGKLQ------GTVSWGSG-CAQKNKPGVYTK7CNYVSWIK0TIASN-------

ТРОМБИН ---IRITDNMFCAGYKPGEGKRGDACEGDSGGPFVI^SPYNNRWYQMGIVSWGEG-CDRTCKYGFYTHVFRÍKKa'IQKVIDRXiGS-----

Рисунок 3. Аминокислотные последовательности ТИФ шеи. Для сравнения приведши,! последовательности трипсина (РОИ760) и тромбина (P0073S) крупного рогатого скита. Остатки цистеина обозначены люком (+). Зве1дочки.чи обозначены позиции 57 (OIH9), S2 (G2I6) и S3(G226) критически важные для субстратной специфичности. На примере фермента LM-TL аминокислоты каталитической триады (¡157, D102, S19S) выделены серым фоном, а пространственные аналоги аниоп-спя ¡ывиннчего сайта и гидрофобного сайта выделены полужирным курсивом с подчеркивание.и и без подче1>кивания. соответственно. В последовательности никобина, выделенной полужирным шрифтам, уникальные замены подчеркнуты, а сайты 1Ч-гликозилированин выделены курсивом. Используется нумерация по химотрипсину.

понижением температуры на стадии отжига праймеров ("Step-down"), используя праймеры, соответствующие консервативным нетранслируемым 5'- и З'-концевым участкам генов ТПФ других гадюк, в частности, Cerastes cerastes, V. russellii и Bitis gabonica. Полученные ПЦР продукты содержали фрагмент кДНК длиной 902 пары оснований. Всего были установлены нуклеотидные последовательности для 20 клонов. Последовательность каждого из клонов кодировала белок, состоящий из сигнального пептида длиной 18 аминокислотных остатков, пропептида - 6 аминокислотных остатков и собственно полипептидной цепи фермента равной 234 остаткам (Рис. 3). Полученная аминокислотная последовательность была использована для поиска родственных белков с применением программы BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). Результаты поиска показали, что новый белок, идентифицированный нами и названный никобином, имеет высокую степень гомологии с другими ТПФ змей. Никобин содержит 12 остатков цистеина, которые консервативны для всех известных СП. Последовательность этого белка в 15 положениях имеет аминокислотные остатки, не встречающиеся в других СП (рис. 3, подчеркнуты). Тромбин взаимодействует с фибриногеном и другими важными субстратами посредством двух различных участков, называемых анион-связывающими экзосайтами - anion binding exosite (ABE-I и ABE-II), а также гиброфобным участком, так называемым арил-связывающим сайтом. Сайт ABE-I участвует в связывании и гидролизе природных субстратов - фибриногена, тромбиновых рецепторов (PAR-1, PAR-3 и GPIb), тромбомодулина. Сайт ABE-II связывает гликозаминогликаны, в частности, гепарин. Вместо этих сайтов в СП имеются кластеры положительно заряженных аминокислот. Для выяснения наличия и структуры таких кластеров в никобине нами построена модель его пространственной структуры (Рис. 4).

Анализ полученной модели показал, что в случае никобина основными остатками, формирующими ABE-I-подобный сайт, являются Lys65, Lys73, Arg76 и Arg82. В то же время Lys96, LyslOl, Lysl67, Lysl77 и Argl79 формируют ABE-II-подобный участок. У никобина в положениях 37-39 имеются три остатка аргинина; это - уникальный кластер, не встречающийся в других СП. Арил-связывающий сайт (Tyr98, Trp99, Hisl72, Leul75, Val 181, Leu213, Trp215) также сформирован у никобина (Рис. 4). Таким образом, на основании наличия в никобине двух сайтов связывания фибриногена можно сделать вывод, что этот фермент может взаимодействовать с фибриногеном.

Рисунок 4. Модель пространственной структуры никобина. Аминокислотные остатки, образующие каталитическую триаду (HS7, D102, S19S), подчеркнуты. Выделены аналоги эюосайтов.

СП проявляют различную субстратную специфичность. Некоторые подобно тромбину гидролизуют фибриноген, являясь ТПФ. Для других субстратами служат кининоген или плазминоген. Некоторые ТПФ в отличие от тромбина отщепляют от молекулы фибриногена только один какой-нибудь фибринопептид. Анализ специфичности различных СП змей позволил предположить, что определяющим фактором для отщепления обоих фибринопептидов является наличие ароматического остатка в положении 65 аминокислотной последовательности фермента. Так, если в этом положении находится остаток Туг или Тгр, отщепляются оба фибринопептида, в противном случае отщепляется фибринопептид А. В случае никобина в этом положении находится остаток лизина. Следовательно, исходя из особенностей строения и сравнения с другими СП, можно высказать предположение, что никобин способен отщеплять фибринопептид А.

В настоящее время СП классифицируются на три подтипа ферментов: коагуляционные, киногеназы и активаторы плазминогена. На основании данных сравнительного анализа никобин можно отнести к подтипу кининогеназ. Это заключение подтверждается данными проведенного нами филогенетического анализа, согласно которым никобин попадает в группу кининогеназ.

Таким образом, впервые для рода Vípera определена полная аминокислотная последовательность ТПФ - никобина. На основании анализа установленной последовательности сделано предположение, что данный фермент будет отщеплять Аа-фибринопептид и в дальнейшем, после выделения белка, он может иметь хорошие перспективы для применения в биофармацевтике.

Определение полной аминокислотной последовательности ингибитора протеинов типа Кунитка (ИПТК)

Для клонирования кДНК, кодирующих ИПТК, применяли ПЦР при постоянной температуре на стадии отжига праймеров, соответствующих консервативным нетранслируемым 5' и 3' концевым участкам генов ИПТК других змей. Для выбора праймеров были использованы последовательности ингибиторов типа Кунитца из гадюки V. ammodytes ammodytes. Полученные ПЦР продукты содержали фрагмент кДНК длиной ~ 600 п.о. Всего были установлены нуклеотидные последовательности для 10 клонов. Последовательность каждого из клонов кодировала белок, состоящий из сигнального пептида длиной 24 а.о. и, собственно, полипептидной цепи ингибитора, содержащей 71 а.о. (рис. 5). Полученная аминокислотная последовательность была использована для поиска родственных белков в базе данных UniProtKB с использованием программы BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/b1ast/Blast.cgi). Результаты поиска показали, что новый белок, идентифицированный нами, имеет высокую степень гомологии с другими ИПТК змей (рис. 4). ИПТК, экспрессирующийся в гадюке Никольского, имеет шесть консервативных остатков цистеина (рис. 4). Активный сайт ИПТК, взаимодействующий с сериновой протеиназой, сформирован довольно протяженной петлей; во взаимодействии с протеиназой непосредственно участвуют остатки Glyl4-Alal8, также Gly39 и Cys40. Анализ аминокислотной последовательности ИПТК из гадюки Никольского и молекулярное моделирование его взаимодействия с трипсином и химотрипсином показали, что эффективность его взаимодействия с этими ферментами ниже, чем у других ИПТК из ядов змей.

1 10 20 30 10 50 60 70

(1) -------------------------RPDFCLEPPYTGPCKARIIR YF ÍKÍ lKAGLCQTFVYGGCR¡ vKRNNFKSAEDCMRTCGGA------------

(2 )-------------------------FMRPTFCNLLPETGRCNALIPьFYIfNSHLHKCQKFNYGGCGGN\NNFKTIDECQRTCAAKYG-----RSS —

(3 ) MSSGGLLLLLGLLTLWEVLTPVSSKDRPDFCELPADTGPCRVRFP:FYiíNPDEKKCLEFIYGGCEGN\NNFITKEECESTCAA-------------

(4 ) MSSGGLLLLLGLLTLWAELTPV SGKKRPDFCYLPADTGPCMANF PRFYIDS»SKKCKKF I'V GGCHGN WNFETREECRKKCFASAARRPT------

(5) MSS3GLLLLLGLLTLWAELTPISGC.DRPKFCH_Pi/DSGICRAHIPRFYYNPASNQCQGFIYGGCEGNANNFETRDQCRHTCGASGKEGPRPRXASN

(6) LS33GLLLLLGLLTLWAELTPVSSIDRPKFCY Г-Р \EPGECNAYI-lPSFYYDSASrirCKKF IYGGCRGNANNFKTRDECHHTCVASGK-QIQPRIGSN (7 ) MSS3GLLLLLGLLTLWAELTPVSTbDRPKFCY L P ^DPGRCLAYMPSFYYDSASNKCKKF rYGGCRGNANNFKTWDECRHTCVASG---IQPRIASN

(8) MSS3GLLLLLGLLTLWAELTPVSGCDHPKFCYLPADPGRCKAHIPRFYYDSASNKCI4KFIYGGCPGNANNFKTWDECRQTCGASAMGRPT------

* * * * * *

Рисунок 4. Сравнение последовательностей некоторых сериновых протечназ типа Кунитца. (!) Апротинип - панкреатический ингибитор, (¿) BF9 - j илютрипсиповый ингибитор КЗ Rungarus fasciatus. (3) ингибитор плизмииа из Pseudonaja lextiiis, (4) сериновый ингибитор тип*Купгтц ut Bilisgabonica, (5) трипсиновый umuí.umop ui Dahi ia russcllii siamensis, (6) ингибитор in гадюки Никольского (7) химотрипсиночый u (S) трипсиновый ингибитор ш Vipira атт и'liles. Звездочками обозначены остатки цистеина. Активный сайт Р1, Р' подчеркнут в последовательности V. nikolskii.

Таким образом, клонированные нами кДНК, кодируют аминокислотные последовательности новых белков СП никобина и ИПТК из гадюки V. nikolskii. На основании анализа установленных последовательностей можно сделать вывод, что свойства этих белков могут отличаться от свойств уже известных ферментов и ингибиторов. ТПФ применяются в клинической практике, в частности для диагностики нарушений коагуляции. Поскольку никобин по аминокислотной последовательности отличается от используемых ферментов, он может оказаться специфичнее, легче поддаваться контролю и оказывать меньше побочных эффектов.

Изучение белков семейства CRISP (цистеин-богатых секреторных белков).

Белки этого семейства были обнаружены в ядах змей сравнительно недавно (Осипов и др., 2001). Они не обладают ферментативной активностью, состоят из одной полипептидной цепи с молекулярной массой 23-26 кДа и содержат 8 дисульфидных связей. Эти белки были обнаружены в ядах змей семейств Elapidae и Colubridae, а также подсемейства Crotalinae. Нами были впервые клонированы кДНК, и на их основе определены полные аминокислотные последовательности CRISP змей подсемейства Viperinae. Для выделения тотальной РНК использовались ядовитые железы гадюк V. nikolskii и V. berus. кДНК, как и ранее, амплифицировали с использованием ПЦР со ступенчатым понижением температуры на стадии отжига праймеров (Step-down PCR). Праймеры подбирали на консервативные нетранслируемые 5'и 3'- концевые участки генов CRISP других видов змей. Для получения нужного ПЦР-продукта использовали несколько комбинаций смысловых и антисмысловых праймеров (Рис. 5). Все комбинации праймеров приводили к амплификации продукта, содержащего фрагмент кДНК длинной около 1000 пар оснований. Секвенирование продуктов ПЦР позволило установить последовательности 880 и 971 нуклеотидных оснований для V. nikolskii и V. berus, соответственно. Установленные последовательности кДНК кодируют белки, состоящие из 220 аминокислотных остатков (Рис. 6). Установленные последовательности имеют наиболее высокую степень сходства с таковыми CRISP из Protobothrops jerdonii (85.5% идентичных аминокислотных остатков), абломина из A. blomhoffi (83.7%) и трифлина из Protobothrops flavoviridis (82.8%). Бежи из V. nikolskii и V. berus очень похожи друг на друга. Единственное различие - наличие в белке V. nikolskii остатка Lys92

1 2 3 4 5 6

3000 и.о. 2000 п.о.

1000 п.о. — 500 п.о.

Рисунок 5. Анализ продуктов ПЦР, полученных при использовании различных праймеров, методом электрофореза в 1,5% агарозном геле с окрашиванием бромистым ипидием. Дорожки 1, 3 и 5 - продукты ПЦР полученный из кДНК V.berus, дорожки 2,4-V. nikolskii, 6-ДНКмаркеры.

вместо Glu92 в V. benis. Установленные нами последовательности обнаруживают наибольшее сходство с последовательностями белков подсемейства Crotalinae. Однако, имеется несколько аминокислотных замен, которые уникальны для наших белков. Так, например остаток лизина в положении 92 имеется только в белке V. nikolskii. Другой такой заменой является остаток серина в положении 215, расположенный между двумя остатками цистеина в С-концевой части молекулы. Во всех других белках это положение занимает остаток фенилаланина. Замена фенилаланина на менее объемный остаток серина может привести к существенному увеличению подвижности в этой части молекулы и таким образом повлиять на биологическую активность белка. Проведенный филогенетический анализ показал, что CRISP гадюк наиболее близки к белкам из Евразийских змей.

Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о том, что белки CRISP могут взаимодействовать с различными ионными каналами. Для нескольких таких белков пространственная структура установлена методом ренттеноструктурного анализа. На основе этих данных, а также данных молекулярного моделирования были сделаны выводы об остатках CRISP, вовлеченных во взаимодействия с ионными каналами. Таковыми оказались

Lys 184, Argl 85, Glnl98, Ser200, Gin 202, Asp204 и Arg 217. Из этих остатков в последовательностях CRISP гадюк присутствует только Glnl98 (Рис. 6), что может свидетельствовать об отсутствии у найденных белков канал-блокирующей активности. Однако имеющиеся у них уникальные замены (Glu/Lys92 и Ser 215) позволяют выдвинуть гипотезу о том, что эти белки обладают биологической активностью, отличной от других CRISP. Присутствие CRISP в яде гадюки V. berus было показано с использованием метода масс-спектрометрии. С этой целью яд фракционировали гель-фильтрацией на колонке с Sephadex G-50 (Рис. 7). Полученные фракции затем анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле (Рис. 7). По данным электрофореза фракция IV содержит белок с массой около 25 кДа, которая близка массе 24555 Да, рассчитанной на основании установленной аминокислотной последовательности. Окрашенную полосу, соответствующую этому белку, вырезали из геля и подвергали гидролизу трипсином. Полученные в результате гидролиза пептиды анализировали методом MALDI масс-спектрометрии. Результаты анализа показали, что массы триптических пептидов соответствуют массам, рассчитанным на основании установленной аминокислотной последовательности. Около 70% всей последовательности CRISP подтверждено структурой пептидов, полученных из обнаруженного в яде белка. Таким образом, мы однозначно показали наличие в яде гадюки V. berus белка, принадлежащего семейству цистеин-богатых белков, причем это показано впервые для змей подсемейства Viperinae.

Трехпетельные токсины змей подсемейства Viperinae.

Трехпетельные токсины являются основными компонентами ядов змей семейства Elapidae. Экспрессия мРНК, кодирующих такие токсины, обнаружена в ядовитых железах некоторых ямкоголовых и ужеобразных змей, однако сами токсины в ядах этих змей до сих пор не идентифицированы. Также отсутствуют данные об экспрессии трехпетельных токсинов у гадюк. Нами клонированы кДНК, кодирующие трехпетельные белки в ядовитых железах гадюки Никольского и гадюки обыкновенной, и установлены их последовательности. Праймеры для проведения ПЦР были выбраны на основании литературных данных о последовательности геномной ДНК, кодирующей трехпетельные токсины у змеи Sistrurus catenatus edwardsii (Crotalinae) Для проведения ПЦР как и ранее был использован метод со ступенчатым понижение температуры на стадии отжига, поскольку ПЦР с постоянной температурой на стадии отжига

1.AAZ38982 P.tei tilis

2.Q8UW25 L.hard.'ickii

3.AM937249 V. nikolskii

4.AM937250 V.terus

5 Q8JI39 P.flavoviridis triilin 6.Q8JI40 A. blomuoffi ablomin

1 2

3

4

5

6

Рисунок 6. Аминокислотные последовательности CRISP. Последовательное»! / баков У. berus и У. nikolskii выделены полужир ны.У шрифтом. Уникальные аминокислотные замены подчеркнуты. Остатки и и тОШа выделены серым фоном.

1 10 20 30 40 50

TVDFASESSNKNDYQKEIVDKHNDLRRSVKPTARNMLQMKWNSRAAQNAKRWA TVIFASESSNKKDYR 4EIVDKHNA _,R R3 VK PTARNMLQMKWNS RAAQNAKRS А NVTFDSESP RKPEIQ MEIIDLHNSLPRS VNPTASNMLKMEWYPEAAANAERWA NVI FDSESP RK PEIQ SJEIIDLHNS LB RS VNPTASNMLKMEWYPEAAANAERWA NVCFDSESPRKPEIQNIEIIDLHNSLRRSv/NPTASNMLKMEWYPEAAANAERWA NVTFDSESPRKPEIQNEIVDLHNSLRRSVNPTASNMLKMEWYPEAAANAERWA

60 70 80 90 100 110 120 130

NR§TFAHSPPYTRWGKLR^ENIFMSSQPFAWSGWQAVr/DEVKKF\T/GIGAKPPSSVTGHYTQWWYKSHLLG§ASAKlSST DRlrFAHSPEHTRTVGKFRlG^IFMSSnPFAWSGWQDWYDEIKtJWDGIGAKPPGSVIGHYTQlWYKSHLL«ASAKpSST FR|ILSHSPRDSRVIGGIKSGENI YMSTSPMKWTAIIHKWHGEEKDFVYGQGASPJ^AVVGHYTQrVVmiSYRSGCAAAYCPSS FRglLSHSPRDSRVIGGIKgGENIYMSl SPMKWTAIIHEVraGEEKDFVYGQGASPATIAVVGHVTQIVVA'KSYRSGC.^AAYCPSS YRSlESHSSRDSRl'lGGIKKENIYTiATYPAKWTDl IHAWHGEYKDFKYGV^

YR|lEDHSSPDSRVLEGIKfGENIYMSPIP^WTDIIHIWHDEYKNFKYGIGADPraAVSGHFTQTVV^KSYRAGiAAAYfpSS

140 150 160 170 180 190 2 0 210 220

.—KYLYVfQYflPAGmVGSIATPYKSGPPfcl^PSAfcNGI^N^

. --KYLYVlQYlPAGNISSSIATPYKSGPsiGDlPSAivNG:!^^ I

.EYKYFYVCQYCFAGOTJQGKTATPYTSGPPCGDCPSACDNGLCTNPCTHEDKFTN^

. EYKYFYVgQYCPAGtMQGKTATPYTSGPPCGDCPSACUNGLCTNPQTHEDKFTN^KDLVT^QG -O^WNYLKTNCPAS i SGHIiEXX

. KYSYFYV|QYJP \GNIIGKTATPYKSGPPpGDgPSEeDNGlJfrNPirRENEFTNgDSLVQKSS|QDNYMKSK|PAS1F1QNKII . EYSYFYv|QYjp ^G№iRGKTATPiTSGPP^D^SAjDNGLjpNPj^

кДа

номер пробирки

Рисунок 7. Разделение яда V. berus гель-фильтрацией на Sephadex G-50 и анализ полученных фракций методом электрофореза в полиакриламидном геле (12%). Слева на электрофореграмме указаны молекулярные массы стандартных белков, сверху -номера фракций. Полоса, использованная для анализа методом MALDI масс-спектрометрии, отмечена стрелкой. Дорожка Nk содержит CRISP (P84S05) из яда N. kaothia (мол. масса: 24953 Да).

не давал результатов. С применением этого метода мы получили искомый продукт, длиной примерно 300 пар оснований. В целом для двух видов гадюк были установлены нуклеотидные последовательности 30 клонов. Все они кодировали белки, аминокислотная последовательность которых состояла из сигнального пептида - 21 аминокислотный остаток - и зрелого белка - 67 аминокислотных остатков (Рис. 8), включая 9 остатков цистеина. Для каждого вида змеи было идентифицировано 4 различных последовательности, которые представляют изофоромы трехпетельных токсинов. Три изоформы V. nikolskii совпали с таковыми из V. berus. Таким образом, всего идентифицировано 5 разных изоформ (Рис. 8). Сравнение установленных последовательностей с таковыми трехпетельных токсинов показало, что белки гадюк имеют наибольшее сходство с так называемыми необычными или слабыми токсинами, у которых дополнительная пятая дисульфидная связь расположена в первой полипептидной петле. Белки

гадюк также содержат остатки цистеина в гомологичных положениях первой петли. В целом, однако, число идентичных остатков в белках гадюк и трехпетельных токсинах не велико и не превышает 30%. В отличие от "классических" трехпетельных токсинов в установленных нами последовательностях один остаток цистеина в положении 63 (Рис. 8) заменен на тирозин, вследствие чего сульфгидрильная группа другого остатка цистеина в положении 51, участвующего в образований дисульфидной связи в «классических» токсинах, остается свободной. Наличие свободной сульфгидрильной группы может приводить к образованию дисульфидных связей как между двумя трехпетельными белками, так и с другими белками. Следует отметить, что, хотя транскрипты аналогов трехпетельных токсинов на уровне мРНК находили у змей подсемейств Сго1аНпае и Со1иЬппае, сами токсины в ядах этих змей до сих пор не обнаружены. Мы впервые показали наличие мРНК трехпетельных токсинов и у змей подсемейства \^реппае, но идет ли их трансляция пока также остается невыясненным.

ЗРТх1 ЗРТх2 ЗРТхЗ ЗРТхЬ ЗРТх5 VIГХ

стх

К-ВдЪ ЕгЬ

1 10 20 30

1.Т САТСЭЗ\ЛРС ГУТРЫУС С'1 ЕвЗ№СЕ -ККОТ'в-ЬТСА^ЗЗУРСРУТРИУССТЕОЗИОСР-КГОЛ'в-ЬТСАТСЗЗтаСТОТРЫУССТЕСЗЫОСГ-ККТО'С-ЬТСАЗСЗЛКК С ТОТРиУСС! ЕвЗ№СГ - КК№] 'в-

40 50 60 70

- БЕСЬЬТ К УЕНЕСА?ИСБ1!Т\ГГСЕЕК-"У М УСАТБЫС1МК

- ЗЕвЬЬТ' УЕ1ЮеААШ31ГУТОЕЕ11- V И УСАТБЫСЫК

- ЭЕвЬЬТК ГЕ1УЗСг А НСЗЬГУТООЕК- V М УСАТОЫСЫК

- ЗЕИБИТК ГЕ1«ЗСААШЗи\ГГОЕЕК- V М УСАТБНСЫК

Ыр^ЗСвКК» С ТОТРЫУОСТЕвг :№СГ - в - - вЕвЬЯТВ УЕРХЗСг. ШСвТУТСЕЕЛ- Vм УСАТ Б ЯСЫК ЬТСЬ1ГС:?ЕМБСЗ-КГ01-СКИвЕКХСР-КК1Нд--ККРЬЗМ5У1К&^А13ТСРУСКРУЕ-МГЕ7СЗТВ1<:СШ1 1КСР1ТРОХТЗ---КС--С-РЫОНУ|УТКтаСВАГС31КСК]!УСЬССААТСРТУКТСУ-ВГд;СЗТЕМОТРГРТТ1КРР

ктсызрввтрот-----сршдпхерхж/.осокгсз 11«зр 71Е<эастА гсротзиуиз с. ь :ётт е иски

Н1ЁРЫН0330Р0ТТКТ—СЗРСЕЗЗСУНКйЮЗО----РКвТ Г ХЕИССС—СРТУКРвХК-

Рисунок 8. Аминокислотные последовательности предполагаемых трехпет ш;пых токсинов из гадюк (ЗРТ..1 - ЗГТх$) и известных трехпетельных токсинов: слабого токсина И 7Х, альфа-коЛратоксипа (СТХ) каппа-Пунгаротоксина (К-В^0 и эрабутокс ина (Ег У-Остатки цистеина выделены серым фоном.

выводы

1. Сочетанием методов химии белка и молекулярной биологии установлены аминокислотные последовательности ряда новых белков различных структурно-функциональных семейств из ядов гадюк V. nikolskii и V. berus. При этом белки двух классов - секретируемые белки, богатые остатками цистеина (CRISP) и трехпетельные токсины - обнаружены у змей подсемейства Viperinae впервые. Все изученные белки содержат уникальные замены в функционально-важных участках молекул.

2. Из яда гадюки Никольского выделены две гетеродимерные фосфолипазы А2, изучена их биологическая активность и установлены аминокислотные последовательности составляющих субъединиц. Впервые показано присутствие двух гетеродимерных фосфолипаз А2 в яде змеи одного вида. Отсутствие подобных белков в яде гадюки обыкновенной подтверждает на молекулярном уровне справедливость выделения гадюки Никольского в отдельный вид.

3. Установлены аминокислотные последовательности белков семейства CRISP гадюки Никольского и гадюки обыкновенной. Показано наличие такого белка в яде гадюки обыкновенной.

4. Впервые установлена полная аминокислотная последовательность сериновой протеиназы у змей рода Vípera. Данная протеиназа относится к классу тромбиноподобных ферментов и, судя по анализу аминокислотной последовательности, может представлять собой кининогеназу.

5. Впервые показано присутствие генов трехпетельных белков в подсемействе Viperinae. В отличие от большинства трехпетельных токсинов, содержащих четное число остатков цистеина, образующих внутримолекулярные дисульфидные связи, белки гадюк содержат 9 остатков цистеина, что делает возможным образование межмолекулярных дисульфидных связей.

Список публикаций

1. Ramazanova A.S., Zavada L.L., Starkov V.G., Kovyazina I.V., Subbotina T.F., Kostyukhina E.E., Dementieva I.N., Ovchinnikova T.V., Utkin Yu.N. (2008) Heterodimeric neurotoxic phospholipases A2 - the first proteins from venom of recently established species Vipera nikolskii: Implication of venom composition in viper systematics. Toxicon. V.51. P. 524-537.

2. Ramazanova A.S., Starkov V.G., Osipov A.V., Ziganshin R.H., Filkin S.Yu., Tsetlin V.I., Utkin Yu.N. (2009) Cysteine-rich venom proteins from the snakes of Viperinae subfamily - Molecular cloning and phylogenetic relationship. Toxicon. V. 53 P. 162-168.

3. Рамазанова A.C., Старков В.Г., Филькин С.Ю., Цетлин В.И., Уткин Ю.Н. (2011) Молекулярное клонирование и анализ последовательностей кДНК кодирующих сериновую протеиназу и ингибиторы типа Куниц в ядовитой железе гадюки Vipera nikolskii. Биоорганическая химия. Т. 37 С. 374-385.

4. Рамазанова А.С., Завада JT.JI., Баландин С.Б., Овчинникова Т.В., Уткин Ю.Н. (2006) Структурные исследования гетеродимерных фосфолипаз А2 из яда гадюки Vipera nikolskii. Международная конференция по физико-химимической биологии, посвященная памяти академика Ю.А. Овчинникова (VIII чтения). Москва. Тезисы докладов и стендовых сообщений. С. 93.

5. Уткин Ю.Н., Осипов А.В., Рамазанова А.С., Старков В.Г., Филькин С.Ю. (2008) Протеомный анализ ядов змей и характеристика минорных белков. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск. Тезисы. С. 283.

6. Рамазанова А.С., Осипов А.В., Старков В.Г., Цетлин В.И., Уткин Ю.Н. (2009) Структурные исследования новых токсичных белков из яда гадюк Vipera nikolskii и Vipera berus. IV Российский симпозиум «Белки и пептиды». Казань. Тезисы. С. 132.

7. Рамазанова А.С., Осипов А.В., Старков В.Г., Цетлин В.И., Уткин Ю.Н. (2009) Характеристика новых белков, экспрессирующихся в ядовитых железах гадюки Никольского и гадюки обыкновенной. 13-я Международная пущинская школа-конференция молодых ученых. Пущино. Тезисы. С 39.

22

8. Рамазанова A.C., Старков В.Г., Филькин С.Ю., Цетлин В.И.,Уткин Ю.Н. (2010) Тромбиноподобные сериновые протеиназы из ядов змей в терапии и диагностике нарушений кровообращения. 2-й Международный симпозиум "Биофарма-2010 от науки к промышленности" Ереван. Тезисы. С. 41.

9. Рамазанова A.C., Осипов A.B., Филькин С.Ю., Старков В.Г., Уткин Ю.Н. (2011) Новые гемотоксичные протеолитические ферменты из ядов змей. V Российский симпозиум «Белки и пептиды». Петрозаводск. Тезисы. С. 59.

Подписано в печать: 06.09.11

Объем: 1,5 усл.пл. Тираж: 100 экз. Заказ № 784 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

1. Введение

2. Семейства белков ядов змей

2.1. Фосфолипазы А

2.1.1. Фосфолипазы А2 и их классификация

2.1.2. Фосфолипазы А2 ядов змей

2.1.3. Роль ФЛА2 в поражающем действии яда

2.1.4. Классы нейротоксичных ФЛА

2.1.5. Нуклеотидные последовательности, кодирующие ФЛА

2.1.6. Структура генов ФЛА

2.1.7. Пространственная структура ФЛА

2.1.8. Ферментативная активность

2.1.9. Механизмы нейротоксического действия ФЛА

2.1.10. Белковые ингибиторы ФЛА

2.1.11. Перспективы исследования ФЛА

2.2. Тромбиноподобные ферменты из ядов змей

2.3. Ингибиторы сериновых протеиназ типа Кунитца

2.4. Структура и функции цистеин-богатых секреторных белков из ядов змей

2.4.1. Цистеин-богатые секреторные белки

2.4.2. CRISP ядов змей - блокаторы ионных каналов

2.4.3. Потенциальный сайт взаимодействия

2.5. Трехпетельные токсины

2.6 Заключение

В обзоре было рассмотрено несколько семейств токсинов змеиных ядов. Среди них представлены белки как обладающие ферментативной, активностью, так и не обладающие ею. В обзоре было также отмечено, что некоторые токсины (например, а-нейротоксины) широко используются в качестве инструментов исследований, другие пр вставляют интерес в качестве основы для создания новых лекарственных препаратов. Однако и те и другие имеют ряд недостатков (в частности, ограниченная селективность или высокая токсичность), что делает актуальной задачу поиска белков (токсинов) с новыми фармакологическими свойствам. Решению этой задачи и посвящена настоящая работа.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 3.1. Реактивы и расходные материалы

В работе использовались реактивы следующих фирм: ацетонитрил (Криохром, Россия), водный* раствор аммиака, уксусная кислота ихидроксикарбонат аммония (Химмед, Россия), натрия ацетат, KCl, NaHC03 (Реахим, Россия), трифторуксусная кислота, 4-винилпиридин, гуанидин гидрохлорид, NaCl (Merck, Германия), Tris-HCl, PEG-6000 (Ferak, Германия), дитиотреитол, этидий бромид, Orange G (Serva), трипсин, пепсин, 2,5-дигидроксибензойная кислота (Sigma, США), Tersus-полимераза (Евроген, Россия), бакто-агар, бакто-тригггон, дрожжевой экстракт (Диа-М, Россия), изопропилтио-В-Г)-галактопиранозид (IPTG), X-Gal, ДНК-маркеры молекулярных масс, дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP), агароза (Fermentas, Литва), этанол, ампицилина натриевая соль (Ферейн, Россия), ß-меркаптоэтанол (Fluka), 1-пальмитоил-2-(10-пиренилдеканоил)-зп-глицеро-3-фосфорилхолин (Molecular Probes, Нидерланды), СаС12 (Acros, США).

Набор для выделения РНК "SV Total RNA Isolation System", обратная транскриптаза M-MLV, набор для клонирования продуктов ПЦР "pGEM-T Vector System I", набор для выделения и очистки продуктов ПЦР "Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System" (Promega, США).

Термостабилькая химически инактивированная ДНК-полимераза ChemTaq была предоставлена сотрудником лаборатории биотехнологии ИБХ РАН В.М. Крамаровым.

Клонирование плазмидной ДНК осуществляли в клетках E.coli штаммов XL-1 Blue (Stratagene) и DH-10B (Life Technologies). Праймеры для обратной транскрипции и ПЦР (табл. 1) были синтезированы и очищены сотрудником ИБХ РАН И.М. Альтшулером.

Табл. 4. Олигонуклеотиды, использованные в работе

Название Последовательность (5'—>3') Примечание

ТЗОСар AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T30)VN (N=A,C,G или Т; V=A,G или С) Праймер для обратной транскрипции

1 GGACCCCCTTCAACTCTGAGAC •s-етопраймер для ФЛА2 из V. nikolskii

2 GCATTCAGAATAATAGAGTAACAC antisense-upmuGp для ФЛА2 из V. nikolskii

3 TTCGGGGACATGATCTTACA ¿•еж-е-праймер для кислой ферментативно неактивной субъединицы

4 CTCCTCCGTGCAATGAGAGAT antisense-праймер для кислой ферментативно неактивной субъединицы

5 ACGATTTTCTGAAAGCAACA леш-е-праймер для CRISP из V. nikolskii и V.berus

6 GAAAGCAACAAAGAAG sense-щшшо^ для CRISP из К nikolskii и V.berus

7 GTTATCTTTACGTTTATTC •seme-праймер для CRISP из V. Nikolskii и V.berus

8 ATTTTGGTGAT(C,G)TTATTTTC ¿шШтуе-праймер для CRISP из V. nikolskii и V.berus

9 AG(C,G)TTTAAGTTTGGMACTGG яеияе-праймер для тромбин-подобных сериновых протеиназ из V. nikolskii

10 GGTTAGG(A, G) ATATAGAAGAGAT(C, G)T <з«/75бтое-праймер для тромбин-подобных сериновых протеиназ из V. nikolskii

11 GTCTTCTGGAGGTCTTCTTC •seme-праймер для ингибиторов сериновых протеиназ

12 GCAGAAKAGAAGGGATGAAG апШете-пршм&р для ингибиторов сериновых протеиназ

13 ATGAAAACTCTGCTGTTGATCCTGGGGGT ¿еше-праймср для трехпетельных токсинов из V. berus

14 GCCAATAGTCACTTTTAGAACTATTT-GTTGCAGTTGTCTG antisense-npalíuep для трехпетельных токсинов из V. berus

3.2. Методы

3.2.1. Получение яда змей

Содержание гадюк Vípera nikolskii и V. berus и отбор яда осуществлялись В.Г. Старковым. Гадюк держали в неволе при 25-26° С и кормили крысами и мышами. Яд получали ручным массажем желёз; полученный яд высушивали над хлоридом кальция и хранили при —20° С.

3.2.2. Фракционирование ядов

Катиопообменная ВЭЖХ. Высушенный яд разделяли на катионообменной колонке НЕМА ВЮ 1000 СМ (250x8 мм, Tessek, Чехия) в линейном градиенте концентрации аммонийно-ацетатного буфера (рН 7.5) от 5 до 700 мМ за 140 мин со скоростью потока 1мл/мин.

Обращенно-фазовая ВЭЖХ. Фракции 4 и 5 (Рис. 1) далее разделяли на колонке Vydac С18 (10x250 мм) в присутствии 0.1% трифторуксусной кислоты в линейном градиенте концентрации ацетонитрила в воде от 30 до 40% при скорости потока 2 мл/мин.

3.2.3.Анализ аминокислотных последовательностей

Пирндшэтгтирование белков. К 0.2-0.4 мг белка в 300 мл 0.2М Tris-НС1 буфера (рН 8.5), содержащего 6 М гидрохлорид гуанидина, добавляли 10 мкл раствора дитиотреитола (100 мг/мл) в том же буфере. После инкубации в течение 18 ч при комнатной температуре добавляли 3 мкл 4-винилпиридина и инкубировали 3 ч при комнатной температуре. Выделение пиридилэтилированных производных белка осуществляли с помощью обращённо-фазовой ВЭЖХ на колонке Vydac С18 (4.6x250мм) в присутствии 0.1% трифторуксусной кислоты в линейном градиенте концентрации ацетонитрила в воде от 30 до 40% в течении 40 мин. Затем проводили лиофилизацию производных.

Тргтсиновый гидролиз белков. К раствору, содержащему 14.5 .нмоль пиридилэтилированного белка в 600 мкл 50 мМ Tris- НС1 (рН 8.5) буфера добавляли 10 мкл раствора свиного трипсина (1 мг/мл) в том же буфере. После инкубации смеси в течение 3 ч при 37°С полученные пептиды разделяли обращённо-фазовой ВЭЖХ на колонке Vydac С18 (4.6x250 мм) в градиенте концентрации ацетонитрила в воде от 2 до 42% за 80 мин в присутствии 0.1% трифторуксусной кислоты при скорости потока 1 мл/мин.

Пепсиновый гидролиз белков. К раствору, содержащему 29 нмоль пиридилэтилированного белка в 800 мкл 0.5% трифторуксусной кислоты, добавляли 16 мкл раствора свиного пепсина (0.05мг/мл) в воде. После инкубации раствора в течение 2 часов при комнатной температуре полученные пептиды разделяли, как описано выше для трипсинов ого гидролиза.

Анализ аминокислотных последовательностей. N-концевые аминокислотные последовательности пиридилэтилированных белков и продуктов их гидролиза определяли путём деградации по методу Эдмана с использованием автоматического секвенатора 477А (Applied Biosystems, Foster City, CA, США)

3.2.4. Масс спектрометрия

Молекулярные массы выделенных соединений, их производных и пептидных фрагментов определяли на времяпролетном MALDI масс-спектрометре BRUKER REFLEX III (Bruker, Германия), оборудованном источниками ионов с матрично-стимулированной лазерной десорбцией и ионизацией (Matrix-assisted Laser Desorption Ionization). При нанесении образца на мишень использовали метод высушенной капли, описанный в работе [183]. Образец на мишени облучали ультрафиолетовым лазером с длиной волны излучения 337 нм и максимальной мощностью энергии в импульсе 250 мкДж. Регистрировали положительно заряженные ионы для соединений с молекулярными массами до 20 кДа в режиме отражения, используя раствор 2,5-дигидроксибензойной кислоты (10мг/мл в 30% ацетонитриле/0.5% трифторуксусной кислоты) в качестве матрицы.

3.2.5. Выделение общей РЕПС

Для получения ядовитых желез змею обезглавливали и быстро извлекали ядовитые железы. Извлеченные железы немедленно замораживали в жидком азоте и хранили в морозильнике при -70°С. Для выделения и очистки суммарной РЕК использовали набор реактивов "SV Total RNA Isolation System". Навеску массой 1 г растирали в ступке с жидким азотом. Приблизительно 30 мг гомогенизированных тканей смешивали со 175 мкл лизирующего буфера (рН 7.5), содержащего 4М гуанидин-тиоцианат и 1% (3-меркаптоэтанол. Добавляли 350 мкл буфера для разбавления лизата и прогревали на водяной бане при 70° С в течение 3 мин. Образец центрифугировали, после чего к супернатанту добавляли 200 мкл 95% этанола. Весь полученный раствор наносили на колонку, через которую затем последовательно пропускали раствор ДНК-азы I с 10 мМ МпС^ и отмывочный буфер. Очищенную суммарную РНК элюировали 100 мкл деионизированной воды, не обладающей нуклеазной активностью. РНК переосаждали 95% этанолом в присутствии подкисленного ацетата натрия (рН 4.5). Осадок растворяли в 100 мкл воды.

3.2.6. Обратная транскрипция и ОТ-ПЦР кДНК-матрица была получена следующим образом: 1 мкл раствора РНК смешивали с 2 мкл раствора праймера ТзоСар (Юпмоль/мкл) и 2 мкл воды и инкубировали при температуре 70°С в течение 2 мин, после чего добавляли смесь остальных компонентов, включая 4мкл 5х M-MLV буфера (250 мМ трис-HCl (рН 8,3); 375 мМ КС1; 30 мМ MgCl2), 2 мкл раствора dNTP (концентрация каждого нуклеотида 10 мМ), 1 мкл дитиотреитола (10 мМ), 1 мкл раствора обратной транскриптазы M-MLV (200 ед/мкл) 7 мкл воды. Реакция длилась 90 мин при 45-50°С. По окончании реакции объем смеси доводили водой до 100 мкл, затем инактивировали фермент нагреванием (5 мин при 80°С). Раствор кДНК хранили при температуре -20°С.

Для проведения ПЦР с целью получения последовательностей, кодирующих гетеродимерные фосфолипазы, были использованы праймеры 1 и 2. Для CRISP- 3,4,5 и 6, для тромбин-подобных сериновых протеиназ - 7,8, для трехпетельных токсинов - 9,10. ПЦР проводили в объеме 20 мкл, смешивая 2 мкл 10х буфера [670мМ трис-HCl (рН 8.8); 160 мкл (NH^SC^; 25мМ MgCl2], 3 мкл эквимолярной смеси dNTP (по 1,25 мкМ), по 1 мкл каждого из праймеров (10 пмоль/мкл), 2 мкл раствора кДНК, 0,5 мкл ДНК-полимеразы (5 ед/мкл) и требуемое количество воды.

Температурный режим реакции для получения продуктов, кодирующих гетеродимерные фосфолипазы, был следующим: 94°С — 1 мин, далее был выбран режим ступенчатого понижения температуры на стадии отжига ("step-down"): 94°С - 30 с, 65.53°С - 40 с, 68°С - 120с; 35 циклов.

Температурный режим реакции для получения продуктов, кодирующих CRISP, был следующим: 95 °С- 60с, далее 94 °С - 30с, 55.43 °С-40с, 68 °С -120с; 35 циклов.

Температурный режим реакции для получения продуктов, кодирующих тромбин-подобные сериновые протеиназы: 95 °С - 60с, далее 94 °С-30с, 55.43- 40с, 68°С-45с; 35 циклов, далее 94°С-30с, 43°С-40с, 68-10 мин.

Температурный режим реакции для получения продуктов, кодирующих ингибиторы сериновых протеиназ Типа Кунитца: 95°С - 60 с, отжиг праймеров при 55 °С в течение 40 сек, элонгация при 68 °С-2 мин

Температурный режим реакции для получения продуктов, кодирующих трехпетельные токсины: 95 °С - 60с, далее 94 °С-30с, 65.53-40с, 68 °С-20с; 35 циклов.

3.2.7. Клонирование и секвенирование продуктов ПЦР

Продукты ПЦР фракционировали в агарозном геле, элюировали стандартными способами (из легкоплавкой агарозы, электроэлюцией в 15%-PEG-6000) или с использованием набора "Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System" и клонировали по аденилированным З'-концам в векторе pGEM-T. Процедуры трансформации, скрининга, выделения и очистки плазмидной ДНК на данном и последующих этапах работы проводили согласно руководству [184]. Отбор клонов, содержащих требуемую вставку, осуществляли с помощью сине-белой селекции и ПЦР. Секвенирование ДНК проводилось в Центре коллективного пользования "Геном" ИМБ РАН с помощью набора реактивов ABI PRISM Big Dye Terminator v.3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant (Applied Biosystems). Для повышения достоверности полученных данных каждый клонированный фрагмент секвенировался дважды в противоположных направлениях.

3.2.8. Определение ферментативной активности гетеродимерной ФЛА2

Ферментативную активность белков определяли по методике, описанной в работе [185] с использованием 1-пальмитоил-2-(10-пиренилдеканоил)-зп-глицеро-3-фосфорилхолином в качестве субстрата.

3.2.9. Определение антикоагулянтной активности гетеродимерной ФЛА2

Фосфолипазы А2 были растворены в 0.02 M изотоническом верональном буфере (pH 7.4), содержащим 1мМ СаС12 с конечной концентрацией 1мг/мл. Взятая кровь от здоровых доноров была смешана с цитратом и отцентрифугирована при 1200g 20 мин. Для измерений были использованы полученная обедненная тромбоцитами крови плазма л .набор реагентов из Tekhnologia-Standart (Барнаул, Россия). Каждый тест был выполнен параллельно в трех повторах, контрольный образец не содержал фосфолипазы.

Для определения тромбинового времени (ТСТ), брали ОД мл плазмы и 0.05 мл раствора белка и инкубировали при 37°С 2 мин. Затем к смеси добавляли 0.5 единиц (НИ) в 0.1 мл и регстрировали время до образования тромбинового сгустка.

Протромбиновое время (РТ) определяли двумя методами. Метод А: 0.1 мл плазмы и 0.05 мл раствора белка инкубировали как описано выше. После чего прибавиляли 0.2 мл кальций-тромбопластиновой смеси и регистрировали время свертывания. В методе В 0.2 мл тромбопластиново-кальциевой смеси инкубировали с белком 2 мин. Затем к смеси добавляли 0.1 мл плазмы и регистрировали время свертывания.

Для определения активного частичного тромбопластинового времени (АРТТ) 0.1 мл плазмы, 0.05 мл раствора белка и 0.1 мл каолин-кефалинового реагента ("Tekhnologiya-Standart") инкубировали 3 мин при 37°С. Затем к смеси добавляли 0.1 мл 25 мМ СаСЬ и регистрировали время образования сгустка.

Активированное время рекальцификации (ART) определяли так же как АРТТ, но в качестве реагента добавлялся только каолин. Для определения ART использовали обогащенную тромбоцитами плазму, полученную после центрифугирования крови с добавлением цитрата в течение 5 мин. при 240 g. Результаты всех тестов свертывания плазмы были выражены как минимальные эффективные концентрации, то есть минимальные конечные концентрации бежа в инкубационной смеси, которые вызывали увеличение времени свертывания во всех трех определениях для периода, превышающего ошибку метода, которая составляла 1с для ТСТ и РТ, Зс для АРТТ и 5с для ART. Для определения минимально эффективной концентрации было использовано 10-, 100- и 1000-кратное разведение белка.

3.2.10 Анти-тромбоцитарная активность гетеродимерной ФЛА2

Анти-тромбоцитарная активность была измерена как описано в методе [186] с использованием богатой тромбоцитами плазмы. Кратко, 0.5 мл плазмы и 0.1 мл раствора белка (0.2 мг/мл изотонического NaCI, 0.04 мг/мл HDP-2) инкубировали 1 мин при 37°С. Затем к смеси добавляли 0.05 мл раствора АДФ (конечная концентрация 2.5 мкМ) и определяли изменения проводимости каждые 5 мин. В качестве котроля использовался изотонический раствор NaCl.

3.2.11. Характеристка цистеин-богатых беков (CRISP) из гадюки обыкновенной

Сырой яд гадюки обыкновенной (170мг) растворяли в 2 мл 0,1М аммоний-ацетатного буфера (рН 6.2) и наносили на колонку с сефадексом G-50 (две колонки 2.5x90 мм, соединенных последовательно). Полученные фракции высушивали лиофилизацией. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия проводили по методике (Smith 1994) в восстанавливающих условиях в 12% геле. Толщина геля - 1,5 мм. Белки окрашивали кумасси бриллиантовым голубым. Часть (около 1.5x1.0 мм) окрашенной полосы белка вырезали из геля и обрабатывали трипсином (Шевченко и др. 2006). Продукты анализировали методом MALDI масс спектрометрии (MS). MALDI MS и MS/MS анализ проводили на масс спектрометре Ultraflex II MALDI-ToF-ToF (Bruker Daltonik, Germany), оборудованном Nd лазером. Молекулярные ионы МН4" измерялись в рефлекторной моде; точность измерения массы составляла 0.01%. Для проведения измерения аликвоту раствора (0.5 мкл) образца смешивали с равным объемом раствора 2,5-дигидроксибензойной кислоты (Aldrich, Milwaukee, WI) (10мг/мл в 30% ацетонитриле и 0.5% трифторуксусной кислоте) и оставляли сушиться при комнатной температуре. Каждый масс-спектр получал в сумме 500 лазерных ударов. Спектры фрагментных ионов генерировали индуцированной лазером диссоциацией, ускоренной низкоэнергетической ударной диссоциацией с использованием гелия в качестве вспомогательного газа. Соответствующие полученные массы пептидов токсина и пептидных фрагментов интерпретировали с применением програмного обеспечения GPMAW 4.04 (Lighthouse data, Denmark), используя критерий точности 0.01-0.02%.

3.2.12.Филогенетический анализ CRISP из гадюки Никольского и гадюки обыкновенной

Филогенетический анализ выполнен с использованием транслированной аминокислотной последовательности зрелого белка. Последовательности CRISP были подобраны с помощью программы BLAST (bttp://www.expasv.org/tools/blast). Выбранные последовательности выравнивали используя программу CLUSTAL-X. Наборы данных анализировали, используя распределение по Байесу, с помощью программы Mr. Bayes, версия 3.1.2. Анализ был выполнен, как описано в работе [187]. Визуальное древо было получено, используя программу TreeView, версия 1.6.6.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 4.1. Выделение гетеродимерных ФЛА2 и анализ их аминокислотной последовательности

Для выделения белков сырой яд гадюки Никольского разделяли катионо обменной хроматографией на колонке НЕМА BIO 1000 СМ (Рис.ИА). Фракции 4 и 5 обладали фосфолипазной А2 активностью и были названы HPD-1 (от английского названия HeteroDimeric Phospholipase - 1, гетеродимерная фосфолипаза -1) и HPD-2, соответственно. Выходы HPD-1 и HPD-2 составляли соответственно 7.5% и 14.5%. В целом, эти два белка составляли более чем 20% веса от высушенного яда. На следующем этапе после фракционирования методом обращено-фазовой хроматографии (Рис.ПБ) HDP-1 и HDP-2 были разделены каждая на две основные фракции. Определение липолитической активности показало, что более гидрофобные белки (HDP-1P и HDP-2P), элюирующиеся в более высокой концентрации ацетонитрила обладали ферментативной активностью. Более гидрофильные белки (HDP-1I и HDP-2I) являлись ферментативно неактивными и всегда элюировались как пик с предплечьем, которое не отделялось от главного пика. Массы белков HDP-1P и HDP-2P по данным MALDI масс спектроскопии составил 13798±1 и 13827±1 Да, соответственно. Молекулярные массы ферментативно неактивных компонентов (HDP-1I и HDP-2I) совпали (очень сильный сигнал составил 13624±1Да и небольшой сигнал 13662±1Да.). Поэтому в дальнейшем будем называть эту кислую субъединицу ФЛА2 - HDP-In. В каждом из выделенных белков восстанавливали дисульфидные связи, алкилировали образующиеся сульфгидрильные группы 4-винилпиридином и анализировали N-концевую аминокислотную последовательность методом автоматической деградации по Эдману. Данные показывают (Рис.14), что N-концевые последовательности компонентов ФЛА2 из гадюки Никольского (HDP-1P и HDP-2P) гомологичны основным субъединицам гетеродимерных фосфолипаз А2: васпину В из V. aspis и вайпоксину В из V.ammodites. В тоже время, NА

Рис 11. Выделение гетеродимерных ФЛА2 из яда гадюки Никольского. Разделение сырого яда методом катионообменной ВЭЖХ (А) с последующим фракционированием НОР-1 и ШЭР-2 методом обращенно-фазной ВЭЖХ (Б). концевая последовательность ферментативно неактивной компоненты НОР-1п является гомологичной кислым субъединицам этих гетеродимерных ФЛА2. На основании этих данных мы считаем, что белки НЕ)Р-1 и НВР-2 соответствуют двум разным гетеродимерным фосфолипазам.

Для подтверждения димерной природы ЬГОР-1 и НОР-2 мы применяли гель фильтрацию на колонке с Бирегдех 75 (Рис. 12).

СА ЕГО

10

20 30

ГП1П

40 I

50

Рис. 12. Гель фильтрация НОР-2 на колонке Бирегёех 75 ЬЖ (10x300мм). Скорость потока 0.5 мл/мин. Элюционный буфер: 50мМ Тт-НС! (рН 6.5), содержащий 0.1 М ИаСЬ Стрелками показаны позиции рибонуклеазы А (М-Т, -13.7 кДа) и карбонил ангидразы (СА, -ЗОкДа).

Как видно из рисунка НОР-2 элюировался с колонки раньше чем рибонуклеаза А, белок с молекулярной массой приблизительно 13.7 кДа, но при этом после карбонил ангидразы, имеющей молекулярную массу около 30 кДА. (Рис. 12). Похожие результаты были получены для НОР-1. (Данные не показаны). Эти данные согласуются с димерной структурой НОР-1 и НОР-2, которые имеют молекулярные массы ~27.5 кДа.

Для получения более детальных данных о последовательностях пиридилэтилированные белки обрабатывали трипсином. Полученные триптические пептиды разделяли с помощью обращено-фазовой НРЬС и анализировали методами МАЫЛ Мв и деградации по Эдману. Перекрывающиеся пептиды, полученные в результате гидролиза пиридилэтилированных производных белков пепсином, анализировали подобным образом. Полученные данные суммированы в таблицах 5 и 6, а также и на рис. 15.