Влияние эндогенных и экзогенных факторов на структуры и свойства каррагинанов красных водорослей Tichocarpus crinitus и Chondrus pinnulatus тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах

Барабанова Анна Олеговна

Влияние эндогенных и экзогенных факторов структуры и свойства каррагинанов красных водорослей ТкИосагрш сгткш и СИопЛгш ртпиШш

02.00.10-биоорганическая химия

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Владивосток-2005 г.

Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного

отделения РАН

Научный руководитель:

кандидат химических наук, старший научный сотрудник Ермак И.М.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Каминский В.Л. кандидат химических наук, старший научный сотрудник Сова В.В.

Ведущая организация:

Институт физиологии Коми НЦ УрО РАН

Защита состоится 24 июня 2005 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (4232) 314-050, e-mail: bcience(5,.piboe dvo ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Автореферат разослан "_" мая 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

старший научный сотрудник

Прокопенко Г.И.

Ш>£21 М где,//?

Актуальность. Каррагинаны - полисахариды красных водорослей - обладают уникальной способностью образовывать вязкие растворы и прочные гели, а также проявляют разностороннюю биологическую активностью, что в целом определяет их широкое практическое использование. Физико-химические и бжмкм ические свойства каррагинанов находятся в тесной зависимости от их структуры, которая характеризуется большим разнообразием.

Каррагинаны представляют собой сульфатированные галактаны, содержащие П-галактозу и ее производные, остатки которых соединены регулярно чередующимися (3-(1—>4) и а-(1—>3) гликозидными связями. К настоящему времени установлены структуры около 20 типов каррагинанов, различающихся местоположением и количеством сульфатных групп, а также содержанием 3,6-ангидро-О-галактозы В каждом виде каррагинанофитов может присутствовать несколько типов каррагинанов. Кроме того, в пределах одной полимерной цепи каррагинана чаще всего содержатся повторяющиеся звенья нескольких типов, что объясняется ступенчатым биосинтезом полисахаридов в клеточной стенке водорослей Биосинтез каррагинанов зависит как от экзогенных факторов, определяемых условиями обитания водорослей, так и от эндогенных, связанных с их физиологией, в частности стадией их развития. Последний фактор особенно важен, так как красные водоросли имеют сложный жизненный цикл, включающий чередование вегетативного, полового и бесполого размножения. Первые работы по структуре каррагинанов проводились в основном на образцах полисахаридов, выделенных из смеси водоросли разных генераций - гаметофитов и спорофитов. Такой подход к выбору исходного сырья часто приводил к получению противоречивых результатов при установлении структуры выделенных каррагинанов.

Ранее было показано, что водоросли ТкИосагрт сппНиз и СИопс1гш ртпиШш относятся к каррагинанофитам. Вместе с тем, одно только таксономическое положение водоросли не дает полной информации о структуре синтезируемого в ней полисахарида. До настоящего времени не было установлено, изменяется ли структура каррагинанов при переходе от одной стадии развития этих водорослей к другой и как влияют на структуру условия обитания макрофитов. Решение всех этих вопросов представляется актуальным как с точки зрения общей концепции биосинтеза полисахаридов в процессе онтогенеза водорослей, так и при решении вопросов плантационного культивирования каррагинанофитов и их рационального использования при промышленном получении каррагинана.

Немаловажным является изучение аспектов взаимосвязи структурных особенностей каррагинанов и их биологической активности.

Цель работы. Установить зависимость структуры и свойств каррагинанов от видовой принадлежности водоросли, стадии ее жизненного цикла и условий обитания макрофитов.

Задачи исследования:

1. Выделить каррагинаны из красных водорослей Тккосагри.ч сппИш и СИопФш ртпи1аШ5, собранных на разных стадиях их жизненного цикла, и установить их структуру.

2. Установить влияние условий обитания водоросли, в частности интенсивности света и температуры воды, на структуру каррагинана из вегетативной формы Т сппИт

3. Изучить взаимосвязь между структурой выделенных каррагинанов, их физико-химическими свойствами и антивирусной активностью.

Положения, выносимые на защиту:

1. Структура и свойства каррагинанов, продуцируемых водорослями Т спмНм и С р1птЛаШ, зависят не только от видовой принадлежности водоросли, но и от стадии ее развития.

2. Фотосинтетически активная радиация и температура воды оказывают существенное влияние на структуру и свойства каррагинанов из Т сгШ1и.\ При малой интенсивности света водоросли продуцируют в основном нежелирующие типы каррагинанов.

3. Полисахариды нежелирующего типа, выделенные из Т шпчш, представляют собой новый тип каррагинана.

4 Каррагинаны проявляют высокую антивирусную щщвность по отношению к вирусу табачной мозаики. Действие каррагинанов зависит от1

к

-"^гм

Научная новизна и практическая ценность работы.

Из Т crinitus выделен полисахарид, структура которого отнесена к новому типу каррагннанов Впервые показана антивирусная активность каррагинанов по отношению к вирусу табачной мозаики и установлена ее взаимосвязь со структурой полисахаридов Установлено влияние стадии развития водорослей, интенсивности света и температуры воды на структуру каррагинанов из Т crinitus и С pinnulatus.

Разработана методика количественного определения соотношения различных типов карра1инана с использованием ИК-спектроскопии.

Данные о влиянии различных факторов на сгруктуру и свойства каррагинанов могут быть использованы при выборе оптимального времени и места сбора сырья для получения каррагинанов с определенными свойствами, а также при решении вопросов плантационного ра¡ведения и культивирования водорослей Полученные данные по антивирусной активности каррагинанов позволяют рассматривать эти полисахариды в качестве перспективных экологически безопасных средства защиты растений от вирусов

Апробация результатов. Результаты исследований были доложены автором в виде устных докладов на International Symposium on Biotechnology of Marine Algae and Marine Bioactive Substences, Qindao, China, 2000, на Региональных конференциях no актуальным проблемам морской биологии, физико-химической биологии и биотехнологии, Владивосток, 1999, 2004, а также на 7,h International Phycological Congress, Thessoloniki, Greece, 2001 XVIII International Seaweed Symposium, Bergen, Norway, 2004; A satellite to the XVIII International Seaweed Symposium "Marine Biopolymers", Trondheim, Norway, 2004

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 12 тезисов.

Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы Работа изложена на 121 страницах машинописного текста, содержит 15 таблиц и 39 рисунков. Список литературы включает 242 цитируемых работ.

Автор выражает искреннюю признательность за помощь в проведении работы сотрудникам ТИБОХ ДВО РАН к.х.н. Ермак И.М., к.ф.-м.н Глазунову В.П., к х н Исакову В.В., д.б.н. Реунову A.B., к.б.н Нагорской В.П., к.х.н. Назаренко E.J1., сотрудникам Институт биологии моря, г. Владивосток, дб н. Титлянову А Э. и к.б.н Яковлевой И М , а так же сотрудникам Института органической химии РАН им. НД Зелинского, г. Москва, д.х.н Усову А.И и д.х.н. Шашкову A.C. Особая благодарность член-корр. РАН Васьковскому В.Е за помощь в обсуждении полученных результатов.

Содержание работы

Для карра[инанов характерно большое структурное разнообразие Структура каррагинанов зависит от вида водоросли, места ее обитания и фазы развития Достаточно трудно разделить влияние всех этих факторов на качественные и количественные характеристики полисахаридов, синтезируемых водорослями В связи с этим было проведено по)тапное исследование каррагинанов с учетом, как стадии развития водоросли, так и условий ее обитания.

Для установления влияния стадии развития водоросли на ее полисахаридный состав были выбраны две формы водорослей - вегетативная и репродуктивная

Предметом исследования являются каррагинаны из двух видов водорослей Tichocarpus crinitus и Chondrus pinnulatus - представителей широко распространенных в морях Дальнего Востока семейств Tichocarpaceae и Gigartinaceae

Структура и свойства полисахаридов, выделенных из вегетативной и репродуктивной форм водорослей T.crinitus

Водоросль Tichocarpus crinitus, относящаяся к семейству Thicocarpaceae, в процессе своего развития проходит через смену репродуктивной и вегетативной (стерильной) стадий, причем в стерильном состоянии она находится длительное время Благодаря своему быстрому росту, крупным размерам и особенностям развития Т crinitus может

рассматриваться как перспективный вид для промышленного получения полисахаридов, а так же для плантационного культивирования.

Полисахариды были выделены из водорослей Т сптШ, собранных в соответствии со стадиями их жизненного цикла - вегетативной и репродуктивной. Выделенные полисахариды фракционировали осаждением хлористым калием на желирующие (КС1-нерастворимые) и нежелирующие (КС1-растворимые) фракции. Выход и состав иолисахаридньгх фракций представлен в табл.1. Количество полисахаридов, выделенных из репродуктивной формы водоросли Т сгтИш, в 1,8 раза больше, чем из вегетативной, причем в первом случае преимущественно накапливаются полисахариды желирующей фракции. Основными моносахаридами всех фракций являются галактоза и 3,6-ангидрогалактоза.

Согласно химической структуре желирующих типов каррагинана, построенных их повторяющихся дисахаридных звеньев галактозы и 3,6-ангидрогалактозы, соотношение этих моносахаридов в случае регулярности полимерной цепи должно быть равным 1. Как видно из табл.1, только для полисахаридов из вегетативной формы водоросли наблюдается такая регулярность. Следует отметить, что нежелирующие полисахариды из двух форм водоросли содержат незначительное количество 3,6-ангидрогалактозы.

Табл.1. Характеристика полисахаридных фракций, выделенных из двух форм

Т. сгтииз

Вид Содержание (%) от

водоросли Тип Выход сухого вещества Молярное

образца (%) соотношение

Gal 3,6-AnGal SO„2" Белок AnGal: Gal

Вегетатив- А 16,0 33,1 30,0 20,0 5,2 10- 1.1

ная форма

Т сг 'ш 'Чих Б 5,0 37,7 5,6 27,0 10,5 1.0 : 6.0

Репродук- А 30,0 39,0 25,5 15,0 7,0 1.0 : 1.4

тивная

форма Б 7,0 33,2 7,2 6,8 7,8 1.0 : 4.0

Т сппИш

А-КС1-нерастворимая фракция полисахаридов Б-КС1-растворимая фракция полисахаридов

Для оценки молекулярно-массового распределения полисахаридов был использован метод высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке ЯЬоскх 08-620 (Рис. 1) Предварительно колонка была откалибрована сульфатированпыми декстранами с молекулярными массами 400-600,100 и 36-50 кДа.

Все исследуемые полисахариды полидисперсны по молекулярной массе, значения которой для нежелирующих полисахаридов находится в пределах 100-300 кДа, а для желирующих полисахаридов ее величина составляет от 200-400 кДа

1М0-ИМИ1—

1Я0»-

»-н^ 11|м|гт 0 5 16

Рис 1 Высокоэффективная жидкостная хроматография полисахаридов из Т сппНиз: а) КС1-нерастворимая фракция из вегетативной формы, б) КС1-растворимаяй фракция из репродуктивной формы.

Для определения средневесовой молекулярной массы исследуемых полисахаридов был использован метод вискозиметрии. Значения характеристической вязкости, полученные для полисахаридов в 0,2 М №С1 при 25°С, приведены в табл 2. Используя уравнение Марк-Хаувинка-Куна и параметры констант, рассчитанные для к-каррагинанов в 0,2 М ЫаС1 (К=Зх103, «=0.95), были определены молекулярные массы исследуемых полисахаридов, значения которых приведены в табл 2

Табл.2 Значения характеристической вязкости и молекулярной массы полисахаридов, выделенных из двух форм Т сппИш

Фракция Вегетативная форма Репродуктивная форма

полисахаридов Характеристическая вязкость, Гл1, мл/г М, Да Характеристическая вязкость, М, мл/г М, Да

А 0 62 10' 380 000 0.34 10' 202000

Б 0.36 103 214 000 0.46 103 250000

А-КС1-нерастворимая фракция полисахаридов

Б-КС1-расгворимая фракция полисахаридов

Как видно из 1абл.2, наибольшую средневесовую молекулярную массу (380 кДа) имеет полисахарид желирующей фракции из вегетативной формы водоросли, что согласуется с результатами ВЖХ.

Были определены некоторые реологические свойства полисахаридов желирующих фракций из двух форм водоросли. Динамическая вязкость растворао полисахаридов, выделенных И! репродуктивной формы Т сппИт, составляла 20 шРа при 25 С, уменьшаясь в 5 раз при повышении температуры до 50°С.

Таким образом, согласно полученным результатам, полисахариды, выделенные из вегетативной и репродуктивной форм Т сгтйт, отличаются по физико-химическим свойствам. Для желирующих полисахаридов из вегетативной формы водоросли наблюдается ре1улярносгь в полимерной цепи, состоящей из остатков галактозы и 3,6-ангидрогалактозы, и они обладают наибольшей молекулярной массой (380 кДа)

Для идентификации полисахаридов и отнесения их к определенному типу каррагинана использовали методы |3С-ЯМР и ИК-Фурье-спектроскопии Все полученные спектры полисахаридов были сопоставлены со спектрами известных предельных структур каррагинанов.

В ИК-спектрах интенсивная полоса поглощения в области 1240-1250 см'1, наблюдаемая для всех исследуемых полисахаридов, указывает на присутствие значительного количества сульфатных групп, что согласуется с результатами химического анализа (табл.1). В этих спектрах наблюдается интенсивная полоса поглощения при 932 см"1, характерная для 3,6-ангидрогалактозы и полоса поглощения при 847 см"1, относящаяся к сульфатной группе при С-4 остатка галактозы. На основании этих данных полисахариды желирующих фракций можно отнести к к-типу каррагинана. Полоса слабой интенсивности в области 893 см'1 указывает на присутствие несульфатированного остатка галактозы, что характерно для р-типа каррагинана. Таким образом, данные ИК-спектроскопии позволяют отнести полисахариды желирующих фракций из двух форм водорослей к к/р-типам каррагинана.

Рис. 2. ИК-спектры КС1-нерастворимой фракции полисахаридов, выделенной из вегетативной (а и а') и репродуктивной (б и б') форм Т сптШ.

Анализ |3С-ЯМР спектров полисахаридов желирующих фракций подтверждает данные ИК-Фурье-спектроскопии Химические сдвиги в |3С-ЯМР-спектрах исследуемых полисахаридов были сопоставлены с химическими сдвигами известных предельных структур каррагинана.

В |3С-ЯМР спектрах полисахаридов желирующих фракций из репродуктивной и вегетативной форм водоросли в области резонанса аномерных углеродных атомов наблюдаются четыре сигнала. Сигналы с 8 95.3 м.д. относятся к атомам С-1 остатков 3,6-ангидро-О-галактозы р-типа каррагинана, а сигналы с 8 95 8 м д. соответствуют атомам С-1 остатков 3,6-ангидро-0-галактозы к-каррагинана. Плохо разрешенные сигналы двойной интегральной интенсивности с химическими сдвигами 8 103.2 м д. и 103.3 м.д. являются результатом наложения сигналов атомов С-1 остатков галактозы к- и р-типов каррагинанов. Спектры |3С-ЯМР в области относительно сильного поля также имеют типичный для к- и Р-типов полисахарида вид.

Вместе с тем, в спектрах полисахарида желирующей фракции из репродуктивной формы водоросли наряду с перечисленными сигналами наблюдается слабый сигнал при 105.4 м.д, который может быть отнесен к атому С-1 остатков галактозы, имеющих сульфатную группу при С-4. Это могут быть каррагинаны ц- и у-типов. относящиеся к биологическим предшественникам к-каррагинанов.

Рис 3. 13С-ЯМР-спектр KCl-нерастворимой фракции полисахаридов из репродуктивной формы Т crinitus.

Таким образом, согласно данным 13С-ЯМР- и ИК-спектроскопии, полисахариды желирующих фракций, выделенные из двух форм водоросли Т crinitus имеют структуру каррагинанов, относящихся к k/ß-типу Имеют ли эти каррагинаны блочную к/р-структуру, или представляют собой смесь к- и ß-типов в настоящее время остается не установленным. Однако, данные аналитического центрифугирования и гель-фильтрации, а также идентичность ИК-спектров различных полисахаридных фракций, полученных дробным осаждением KCl, свидетельствуют больше в пользу блочной структуры этих полисахаридов. Имея идентичную структуру ic/ß-каррагинана, эти полисахариды отличаются между собой соотношением дисахаридных звеньев к- и ß-типов, что следует из интенсивности соответствующих сигналов в |3С-ЯМР-спектрах. В репродуктивной форме водоросли их содержание примерно одинаково (60:40), тогда как в вегетативной преобладают дисахаридные звенья к-типа (80%). Различие желирующих фракций из разных форм водоросли заключается еще и в том, что полисахариды из репродуктивной водоросли дополнительно содержат в небольшом количестве дисахаридные звенья, соответствующие предшественникам к-типа каррагинанов. Это согласуется с результатами химического анализа, представленными в табл.1.

ИК-спектры нежелирующих полисахаридов из разных форм водоросли (вегетативной формы и репродуктивной) имеют практически идентичную картину в характеристической области (950-800 см'1). Так, в ИК-спектрах полисахаридов из двух форм водоросли в обеих фракциях присутствует небольшая полоса поглощения при 935 см"' (Рис. 4), характерная для 3,6-ангидрогалактозы, что подтверждают и данные химического анализа В ИК-спектрах полисахаридов, выделенных из вегетативной формы Т crinitus (Рис. 4а') наблюдаются интенсивные полосы поглощения при 811 и 853 см'1, которые в спектрах нежелирующих полисахаридов, выделенных из репродуктивной водоросли (Рис. 46') сдвинуты в сторону больших частот 817 и 859 см'1 соответственно.

|3С-ЯМР-спектры полисахаридов нежелирующих фракций из двух форм водоросли Т crinitus сложны для интерпретации. Для улучшения разрешения С-ЯМР-спектров нежелирующие полисахариды были обработаны NaOH Как видно из рис 5, |3С-ЯМР спектры полученных продуктов содержат 12 сигналов, химические сдвиги которых представлены в таблице 3 При соотнесении этих спектров со спекграми известных структур каррагинанов отнести полисахариды к определенному типу не удалось. Результаты анализа продуктов частичного восстановительного гидролиза с помощью газо-жидкостоной хроматог рафии позволяют отнести нежелирующие полисахариды к группе каррагинана

Рис 4. ИК-спектры КС1-нерастворимой фракции полисахаридов, выделенной из вегетативной (а и а') и репродуктивной (б и б') форм Т. сгтИив.

О

VluM

IUIMUI.AU hi

Рис. 5.13С-ЯМР -спектр KCl-растворимых полисахаридов, обработанных NaOH.

С-ЯМР-спектры продуктов щелочной обработки содержат два сигнала аномерных атомов углерода при 101.3 и 93.8 мд, что указывает на дисахаридный состав повторяющегося звена. DEPT эксперимент показал наличие двух оксиметиленовых групп при 61.9 и 70.1 м.д., значение величины последнего указывает на замещение одной из оксиметиленовых групп. Gate эксперимент позволил определить значение констант спин-спинового взаимодействия КССС для аномерных атомов углерода tci-hi=162,2 для сигнала 5=101,4 м.д. и Tci-hi=169.6 для сигнала с 6=93,8 м.д. Это означает, что моносахаридный остаток (G), аномерный атом углерода которого резонирует при 8-101,4 м.д. имеет р конфигурацию, а моносахаридный остаток (DA) с аномерным сигналом при 5=93,8 м.д. имеет а конфигурацию.

Анализ спектров ПМР с использованием 2D экспериментов Cosy 4S, TOCSY и ROESY позволил провести отнесение сигналов протонов моносахаридных остатков, а использование HSQC эксперимента позволило провести С/Н корреляцию (табл 3).

3.8 м.д.

Рис.6. Спектр Н/ С HSQC KCl-растворимых полисахаридов, обработанных NaOH.

I

г b

w

«

- ■ 3.7

О 3.9

--- 4.1

а - - 4.3

-- 4.5

---т 4.7

« --

4.4

ф

5.1

5.3

5.2

4.8

4.4

4.0

Рис 7 Спектр 'Н/'Н ROESY KCl-растворимых полисахаридов, обработанных NaOH

Табл. 3. Величины химических сдвигов сигналов протонов и углеродных атомов в спектрах исследуемых полисахаридов.

Моносахаридный Н1/С1 Н2/С2 НЗ/СЗ Н4/С4 Н5/С5 Н6,6/С6

остаток

в 4.82 4.27 4.20 4.96 3.88 3.81

101.4 77.4 75.4 74.0 75.4 61.9

БА 5.21 4.06 4.59 4.66 4.84 4.12

93.8 70.5 79.2 79.2 77.7 70.2

Порядок гликозидных связей между моносахаридными остатками определен из данных ЯОЕЯУ эксперимента (Рис. 7). В ЯОЕБУ спектре сильный ядерный эффект Оверхаузера (ЯЭО) наблюдается между Н1 кольца ПА с 5=5.2 и сигналами с химическими сдвигами 4.2 и 4.96 м.д., соответствующие НЗ и Н4 кольца в, а также между Н1 (кольца в) 6=4.82 и сигналом с 8=4.66 м.д., который соответствует Н4 кольца ОА. Кроме этого, сильный ЯЭО наблюдается между протонами НЗ и Н6,6 остатка ОА, что указывает на присутствие 3,6-ангидросвязи.

Сопоставление данных, полученных методами ИК- и ЯМР-спектроскопий, с литературными данными позволяет сделать вывод о том, что в основе КС1-растворимых полисахаридов, выделенных из вегетативной и репродуктивной форм Т. сптш, лежит повторяющееся дисахаридное звено, состоящее из 3-|3-0-галактопиранозил-2,4-дисульфата и 4-3,6-ангидро а-О-галактопиранозида. Этот полисахарид был обозначен нами как каррагинан х-типа.

Структура и свойства полисахаридов, выделенных из вегетативной и репродуктивной

форм Скопйгш ртпиШм

Водоросли С ртпиЫих были собраны в конце августа в заливе Петра Великого и разделены на две группы в соответствии со стадией их жизненного цикла - вегетативную и репродуктивную. Полисахариды из С ргппиШш были экстрагированы горячей водой и фракционированы хлористым калием на желирующие (КС1-нерастворимые) и нежелирующие (КС1-растворимые) фракции. Выход и состав полученных фракций приведен в табл.4. Общее содержание полисахаридов, выделенных из вегетативной формы водоросли С. ртпиЫш, в 1,4 раза больше, чем из репродуктивной. В репродуктивной форме количество желирующей и нежелирующей фракций примерно одинаково, тогда как в вегетативной форме преобладает желирующая. Как показали результаты химического анализа, основными моносахаридами всех фракций являются галактоза и 3,6-ангидрогалактоза. Как видно из табл. 4, только для полисахаридов желирующей фракции из репродуктивной формы водоросли наблюдается регулярность в полимерной цепи. Как и в случае нежелирующих полисахаридов из Т сгтИш, нежелирующие фракции их двух форм С. ртпи1аШ содержат 3,6-ангидрогалактозу.

Согласно результатам, полученным методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, все исследуемые полисахариды полидисперсны по молекулярной массе, значения которых находятся в пределах 300-500 Ша (Рис. 8).

Табл 4 Характеристика полисахаридных фракций, выделенных из двух форм

С ртпиЫш

Форма Фракция Выход Содержание (%) Молярное

водоросли (%) ва! 3,6-АгЮа1 Белок Соотношение АгЮа!:Оа1

Вегета-

тивная форма А 40 0 32 9 23 9 23 9 28 10. 11

С ртпиЫш Б 94 36 5 24 9 3.1

Репродуктивная форма А 20 5 40 8 38 0 22 9 47 10 • 10

С ртпиЫш Б 18.2 35 5 27 0 5 7

А-КС1-нерастворимая фракция полисахаридов Б-КС1-растворимая фракция полисахаридов

2000150010005000-

Рис. 8. Высокоэффективная жидкостная хроматография полисахаридов КС1-нерастворимой (а) и КС1-растворимой фракций (б) из репродуктивной С ртпиЫш.

Для определения средневесовой молекулярной массы исследуемых полисахаридов был использован метод вискозиметрии. Значения характеристической вязкости полученные для растворов полисахаридов при 25°С, приведены в табл.5. На основании уравнения Марка-Хаувинка-Куна были определены молекулярные массы исследуемых полисахаридов, значения который приведены в табл.5.

Табл.5 Значения характеристической вязкости и молекулярной массы полисахаридов, выделенных из двух форм С ртпиЫш

Фракция полисахаридов Вегетативная форма Репродуктивная фо эма

Характеристическая вязкость, Гл1, мл/г М, кДа Характеристическая вязкость, Гл], мл/г М, кДа

А Б 0.48 103 0 39 101 294 237 0,28 Ю3 0 63 103 160 390

А-КС1-нерастворимая фракция полисахаридов Б-КС1-растворимая фракция полисахаридов

Как видно из табл.5, наибольшую средневесовую молекулярную массу (около 400 кДа) имеют полисахариды нежелирующей фракции из репродуктивной формы водоросли, что согласуется с результатами ВЖХ.

Были определены некоторые реологические свойства полисахаридов. Как известно, желирующие типы полисахаридов образуют прочные гели в присутствии ионов К+. В связи с этим, было изучено влияние концентрации КС1 на прочность образуемых полисахаридами гелей. Как показали результаты, с увеличением концентрации КС1 прочность геля полисахаридов возрастает, а потом резко падает, достигая максимального значения 450 дин/см2 для 1% раствора полисахарида из репродуктивной формы С ртпи1шш при концентрации КС1 1,5%. Прочность гелей полисахаридов из вегетативной формы С ртпиЫиз в 2 раза меньше.

Для идентификации выделенных полисахаридов были использованы методы ИК- и 13С-ЯМР-спектроскопии ИК-спектры смеси полисахаридов имеют довольно сложный контур, так как полосы поглощения, отвечающие каждом) типу, могут перекрываться. Для улучшения разрешения спектров была разработана специальная методика приготовления образцов Для количественной оценки состава каррагинана сложный спектр был разложен на индивидуальные компоненты, что позволило не только идентифицировать каррагинаны, но и рассчитать соотношение дисахаридных звеньев отдельных типов каррагинана в смеси.

В ИК-спектрах интенсивная полоса поглощения в области 1250 см'1, наблюдаемая для всех исследуемых полисахаридов, указывает на присутствие значительного количества сульфатных групп. ИК-спектры полисахаридов желирующего типа из двух форм водоросли в характеристической области 1000-700 см"1 похожи (Рис. 9). В этих спектрах наблюдается интенсивная полоса поглощения при 930-931 см"', характерная для 3,6-ангидрогалактозы и полоса поглощения при 848 см, относящаяся к сульфатной группе при С-4 остатка галактозы. На основании этих данных полисахариды желирующих фракций можно отнести к к-каррагинанам. Полоса поглощения в области 804 см*1 указывает на присутствие сульфатной группы при С-2 остатка 3,6-ангидрогалактозы, что является характерным для I-каррагинана.

Рис 9 ИК-спектры КС1-нерастворимых полисахаридов из вегетативной (а) и репродуктивной (б) форм С рттйаШ

Разложение ИК-спектров на индивидуальные компоненты позволило оценить содержание к- и 1-звеньев в исследуемых каррагинанах (Рис 10) Для этого были рассчитаны соотношения площадей полос поглощения при 848 и 806 см"1 см. Если для стандартного образца (1-каррагинана) величина этого соотношения составила 1,16, то для полисахаридов

Рис. 10. Разложение ИК-спектра KCl-нерастворимой фракции полисахаридов из вегетативной формы С pinnulatus на индивидуальные компоненты.

из репродуктивной и вегетативной форм водорослей оно равнялось 1,63 и 2,05, Увеличение величины соотношения S^g/Sgoe в ИК-спектрах исследуемых полисахаридах по сравнению с величиной Sg52/Sgo6 для стандарта указывает на присутствие смеси к- и i-каррагинанов. Таким образом, согласно данным ИК-спектроскопии желирующие полисахариды из двух форм С pinnulatui могут быть отнесены к к/1-типам каррагинана, при этом в вегетативной форме водоросли содержание i-типа меньше, чем в репродуктивной.

|3С-ЯМР-спектры полисахаридов желирующих фракций из вегетативной и репродуктивной форм водоросли содержат более 12 сигналов, что говорит об их нерегулярной структуре. Как видно из рис. 11, в области резонанса аномерных сигналов наблюдаются 4 сигнала. Двойные сигналы с 5 95.9 м.д. относятся к атомам С-1 остатков 3,6-ангидро-О-галактозы к-каррагинана, а сигналы с 6 92.7 м.д. соответствуют атомам С-1 остатков 3,6-ангидро-0-галактозы v-каррагинана. Двойные сигналы с химическими сдвигами 103 2 и 103.1 м.д. относятся к атомам С-1 остатков галактозы к- и i-типов каррагинанов.

В добавление к основным сигналам, в спектрах полисахаридов желирующих фракций из двух форм водоросли наблюдаются сигналы с 6 105.5 м.д. Согласно литературным данным эти сигналы соответствуют С-1 остатков галактозы, имеющих сульфатную группу при С-4, которые могут быть отнесены к предшественникам к-типа каррагинанов.

Рис. 11 1:!С-ЯМР-спектр KCl-нерастворимых полисахаридов из репродуктивной формы С pinnulatus.

Таким образом, по данным спектроскопии 13С-ЯМР- и ИК с Фурье-преобразованием, полисахариды желирующих фракций из разных форм Г ртпиЫш имеют идентичную структуру, относящуюся к кЛ-каррагинанам. Различие заключается в соотношении дисахаридных звеньев к- и 1-типов, что следует из интенсивности сигналов в |3С-ЯМР-спектрах. Для полисахаридов, выделенных из вегетативной формы водоросли, это соотношение составляет 60:40, тогда как для репродуктивной - 80:20.

ИК-спектры полисахаридов нежелирующих фракций из вегетативной и репродуктивной форм водоросли, существенно отличаются от спектров полисахаридов желирующих фракций (Рис. 12). Полоса поглощения, наблюдаемая в области 800-833 см"', соответствует сульфатным группам галактозы. В спектре полисахаридов из репродуктивной формы водоросли присутствует широкое плечо в области 833 см*', которое может быть отнесено либо к Х-, либо к у-типу каррагинана Полоса поглощения в области 935 см*' говорит о присутствии 3,6-ангидрогалактозы, что не характерно для полисахаридов нежелирующего типа.

Спектры |3С-ЯМР полисахаридов нежелирующих фракций грудны для интерпретации. Таким образом, анализ результатов, полученныих методом ИК-спектроскопии, позволяет предположить, что нежелирующие полисахариды из двух форм С ртпи1а1ш являются смесью Х-типа с другими каррагинанами, имеющим низкое содержание 3,6-ангидрогалактозы.

Рис 12 ИК-спектры КО-растворимых полисахаридов из вегетативной (а) и репродуктивной (б) форм С рЫпиЫш.

Влияние фотосинтетически активной радиации (ФАР) и температуры воды на структуру каррагинанов

Структура выделенного полисахарида зависит не только от фазы жизненного цикла водоросли, но и условий ее обитания Одним из важных параметром среды обитания водоросли является интенсивность падающего света, которая влияет на биосинтез полисахаридов в клеточной стенке макрофитов В связи с этим было изучено влияние фотосинтешчески активной радиации (ФАР) на обще: содержание полисахаридов в Тккосагрия сгтИиь и СИапс1ги& ртпиШич Как показали результаты, общее содержание полисахаридов в талломах водорослей меняется в зависимости от количес1ва поступающей на поверхность воды ФАР. Для всех видов водорослей максимальное количество

каррагинана (до 50%) наблюдается при низкой освещенности (10% ФАР). С увеличением интенсивности падающего света до 70% ФАР количество синтезируемого полисахарида уменьшается в 2,5 раза.

?50 ~ 40

Ф

1 30 а * 20

10

ш

□ 30-35% ФАР ■ 10-15% ФАР

1 2 вид водоросли

Рис. 13. Влияние интенсивности падающего света (ФАР) на общее содержание полисахаридов: 1- СИопЖия рттйшиз, 2- ТкНосагрш сппИш

Более подробно влияние интенсивности света и температуры воды на полисахаридный состав было изучено на примере водоросли Т сппНш, способной долгое время находятся в вегетативном состоянии.

Водоросль Т тпИш была взята из естественных условий ее обитания с глубины 1,5 м и размещена для дальнейшего роста в различные световые условия, а именно на глубину 1,5 м, где количество падающего света, измеренного в единицах ФАР, составляло 30-35% и на глубину 4 м с 10-15% ФАР. Сбор водоросли производили каждый месяц - с июля по октябрь.

Было установлено, что Т сппИш адаптируется к световым условиям обитания через изменения как морфологических и анатомических характеристик, так и через биохимические процессы, связанные с биосинтезом полисахаридов. Наибольшая скорость роста наблюдается у водоросли, растущей при 10-15% ФАР в августе месяце при температуре воды 24°С.

Полисахариды были экстрагированы горячей водой и фракционированы осаждением КС1 на желирующие (КС1-нерастворимые) и нежелирующие (КС1-растворимые) фракции. Характеристика полученных фракций приведена в таблице 6. Как видно из таблицы, все фракции содержат белок, причем содержание его в экстрактах водоросли, выращенной на глубине (10-15% ФАР), меньше чем у водоросли, взятой с поверхности Высокое содержание 3,6-ангидрогалактозы (до 30%) было обнаружено в желирующих фракциях полисахаридов из водорослей, выращенных при разных световых условиях Вместе с тем, нежелирующие фракции полисахаридов также содержат 3,6-ангидрогапактозу, количество которой уменьшается от 8 до 5% с понижением интенсивности падающего света.

Общее содержание полисахаридов в талломах водоросли хорошо коррелировало с ростовыми процессами. Наибольшее количество полисахарида было выделено в августе из водоросли, растущей при температуре 24°С и на глубине, где интенсивность падающего на поверхность воды света составляет 10-15% ФАР. С увеличением освещенности до 30-35% ФАР количество продуцируемого в водоросли полисахарида уменьшается в 1,5 раза. С августа по октябрь с понижением температуры воды с 24°С до 11°С наблюдается постепенное уменьшение содержания полисахарида во всех образцах водорослей независимо от количества падающего света.

Как видно из рис. 14, с изменением интенсивности падающего света изменяется и качественный состав полисахарида. С августа по октябрь содержание желирующей фракции полисахаридов в водоросли, растущей при низкой освещенности, было постоянным, тогда как количество нежелирующей фракции постепенно уменьшается. В тоже время в водоросли, выращенной при 30% ФАР, в течение всего экспериментального периода соотношение этих фракций практически не меняется. У водоросли, выращенной при 10-15%

ФАР преобладает содержание нежелирующих полисахаридов. При чем, в августе содержание нежелирующих полисахаридов в 3 раза больше, чем желирующих, тогда как при 30-35% ФАР и этой же температуре воды их количество примерно одинаково

Табл.6. Влияние ФАР и температуры воды на выход и химический состав полисахарида, выделенного из вегетативной формы Т сппИш.

Месяц ФАР Тип Кол-во Содержание (%)

образца % Моносахариды Белки Сульфаты

30% А 11,0

Июнь Б 9,0

контр. 15° С 10% А Б 11,0 9,0

А 12,1

30% Б 6,5

Июль

20° С 10% А Б 15,0 7,0

А 13,0 25,2 10,0 17,3

30% Б 11,0 65,7 7,5 20,9

Август 24° С 10% А 7,3 54,0 7,5 27,0

Б 22,8 18,9 6,86 15,9

А 8,0 49,0 10,51 17,3

Сентябрь 30% Б 12,0 4,0

18° С

10% А 8,0 40,0 3,0

Б 15,4 24,5 6,1 21,0

А 6,0

Октябрь 11° С 30% Б 9,0

10% А 5,0 44,4 8,8 15,7

Б 8,5 36,9 6,86 19,6

А-КС1-нерастворимая фракция полисахаридов Б-КС1-растворимая фракция полисахаридов

30-35% ФАР 10-15% ФАР

■ка-ирфр □ка-рф

июль(к) июнь август сентябрь октябрь 15°С 20°С 24°С 18°С 11°С

июль(к) июнь август сентябрь октябрь 15°С 20"С 24°С 18"С I |°С

Рис. 14. Влияние фотосинтетически активной радиации на полисахаридный состав вегетативной формы Т сппИю

ИК-спектры полисахаридов желирующих фракций из водорослей, выращенных при разных световых условиях, были похожими и идентичными ИК-спектрам желирующих полисахаридов, выделенных из вегетативной формы Т сгШШ Как было показано ранее, желирующие полисахариды имеют структуру к/р-типов каррагинана.

выращенных при 30-30% (1) и 10-15% (2) ФАР

Разложение ИК-спектров на индивидуальные компоненты позволило оценить соотношение к- и р-звеньев в исследуемых каррагинанах в зависимости от места произрастания водоросли. Для этого были рассчитаны соотношения площадей пиков, характеризующих остатки несульфатированной галактозы и 3,6-ангидрогалактозы (S893/S933). Величина этого соотношения составила 0,66 и 0,27 для полисахаридов, выделенных из водорослей, растущих в затемнении и на свету, соответственно. Следовательно, с уменьшением освещенности от 30-35% до 10-15% ФАР количество р-звеньев в полимерной цепи каррагинана увеличивается в 2,4 раза. Можно предположить, что низкая освещенность способствует дополнительному десульфатированию полисахаридов, продуцируемых водорослями.

ИК-спектры нежелирующих полисахаридов из водорослей, выращенных при 10-15% и 30-35% ФАР имеют некоторые различия (рис. 16). Широкие полосы поглощения в области 841-812 см"', наблюдаемые для полисахаридов из водоросли, растущей при 30-35% ФАР, могут быть результатом наложения полос поглощения при 845, 830 и 820 см"1, характеризующих ^-каррагинан В тоже время в ИК-спектрах полисахаридов из водоросли, выращенной при 10-15% ФАР, наблюдаются интенсивные полосы поглощения при 933 и 851 см"', указывающие на присутствие значительного количества желирующих типов каррагинана с низким содержанием сульфатных групп. Как было показано выше, этот полисахарид представляет собой в основном каррагинан, отнесенный к х-типу.

Таким образом, в зависимости от условий обитания водоросли наблюдаются изменения как в содержании каррагинанов, продуцируемых Т crinitus, так и в их составе. При этом, с увеличением освещенности общее содержание каррагинана в талломах водоросли уменьшается, тогда как с понижением температуры воды количество синтезируемого полисахарида не зависит от интенсивности падающего света При температуре 24°С и низкой интенсивности падающего света содержание х-каррагинана было в 3 раза больше, чем к/р-каррагинана.

а

ЮОО 900 800700 воо

V, см"'

Рис. 17. ИК-спектры KCl-растворимых полисахаридов, выделенных из водорослей, выращенных при 30-30% (1) и 10-15% (2) ФАР.

Изучение биологической активности каррагинанов

Среди большого спектра биологической активности каррагинана особый интерес исследователей вызывает его антивирусная активность Различные типы каррагинанов оказывают in vitro ингибирующее влияние на репликацию ряда ДНК- и РНК-вирусов человека и животных. В тоже время литературные данные по изучению действия каррагинанов на фитопатогенные вирусы отсутствуют. Поэтому нами было исследовано действие различных типов каррагинанов - к, X, к/р, к/i, х - на модели вируса табачной мозаики. Структуры к- и Х-каррагинанов из Chondrus armatus были установлены в лаборатории ЛМОАБИ ТИБОХ ранее.

Действие каррагинанов на вирус табачной мозаики оценивали по числу локальных некрозов индуцированных вирусом. Проявление антивирусной активности заключалось в значительном уменьшении количества ВТМ-индуцированных локальных некрозов, образующихся на листьях табака Ксанти-нк при инокуляции их смесью вируса и каррагинана, в сравнении с листьями, инокулированными только ВТМ.

Как видно из табл 7 важную роль в проявлении антивирусной активности каррагинанов играют их структуры. Максимальное ингибирование некрозообразования наблюдается под действием желирующих каррагинанов, в первую очередь, к-типа, которое несколько снижалось при действии гибридных к/р- и кЛ- типов.

Наши результаты не согласуются с представлением о том, что антивирусная активность сульфагированных полисахаридов обусловлена, в первую очередь, присутствием сульфатных групп в полимере. Как видно из таблицы, нежелирующие типы (X и х) содержат наибольшее количество сульфатных групп, проявляя при этом наименьшую антивирусную активность В то время как, каррагинаны, обладающие высокой антивирусной активностью по отношению к вирусу табачной мозаики, отличаются низкой степенью сульфатирования и высоким содержанием 3,6-ангидрогалактозы Вероятно, присутствие сульфатных групп является обязательным, но не единственным условием для проявления антивирусного действия Можно предположить, что определенную роль в образовании комплекса полисахарид-вирус играет вторичная структура каррагинана, которая, как известно, зависит от его типа.

Табл.7 Антивирусная активность различных типов каррагинана и их состав

Содержание Ингибирование

Вид водоросли Тип Мол.масса, (%) ВТМ (%)

полисахарида кДа белок

ОюпЛгш агтаШь к 312 22.0 1,9 89

вегетативная X 246 28.0 2,1 62

ТюИосагрш сппИил

Вегетативная форма к/р 354 20.0 5,2 82

X 214 27,0 10,5 59

15,0 7,0 71

Репродуктивная к/р 202 26,8 7,8 60

X 250

СЪопФ'ш ртпиШш

Вегетативная форма к/1 294 23.9 2,8 74

Представленные данные по ингибиторному действию каррагинанов в отношении фитопатогенного вируса табачной мозаики получены впервые и позволяют рассматривать препараты каррагинанов как потенциально перспективные экологически безопасные средства защиты растения от вирусов. Желирующие типы каррагинанов обладают большим противовирусным эффектом. В проявлении ингибирующего эффекта по отношению к вирусу табачной мозаики существенную роль играет структура полисахарида.

Выводы

1 Проведен сравнительный качественный и количественный анализ полисахаридов, выделенных из водорослей, собранных на разных стадиях их развития, на примере Т'ккосагриа сппИш (ТюЬосаграсеае) и СИопс/гш ртпьЛаШ (Gigartinaceae). Показано, что общее количество полисахаридов, экстрагируемых из репродуктивной формы ТкИосагрш сппиш, в 1,8 раза больше, чем из вегетативной, причем в репродуктивной форме присутствуют в основном желирующие полисахариды с высокой молекулярной массой. Напротив, из вегетативной формы Сйоис/ги$ ртпи1аш было выделено в 2 раза больше полисахаридов, чем из репродуктивной. Желирующие полисахариды из репродуктивной формы С ртпи1аШ образуют более прочные гели

2. Установлена структура полисахаридов, выделенных из двух форм водоросли ЛсИосагрич сптШч (Т1сЬосаграсеае)-вегетативной и репродуктивной Показано, что желирующие полисахариды из обеих форм водоросли имеют идентичную структуру, относящуюся к к/р-каррагинанам. Различие заключается в соотношении дисахаридных звеньев к- и Р-типов, а также присутствии небольшого количества сульфатированных дисахаридных звеньев (предшественников к-типа каррагинанов) в полисахаридах, выделенных из репродуктивной формы водоросли.

3. Показано, что нежелирующие полисахариды, выделенные из обеих форм ТгсИосагриу сгтиш относятся к новому типу каррагинанов В основе их структуры лежит дисахаридное звено, состоящее из остатков 3-связанного р-О-галактопираночил-2,4-дисульфата и 4-связанного-а-3,6-ангидро-П- галактопиранозида.

4. Установлена структура полисахаридов, выделенных из репродуктивной и вегетативной форм СИоЫгш ргппи1а1и$ Желирующие полисахариды из двух форм этой водоросли имеют структуру кЛ-каррагинанов, с преобладающим содержанием к: звеньев в каррагинане из репродуктивной формы СИопс!гш ртпиЫиз Нежелирующие полисахариды представляют собой смесь сульфатированных каррагинанов, содержащую небольшое количество 3,6-ангидро-галактозы

5 Установлено влияние фотосинтетически активной радиации и температуры воды на качественные и количественные характеристики каррагинана, выделенного из Tichocarpus crinitus Максимальное количество каррагинана в этой водоросли было получено при освещенности, равной 10-15% поверхностной ФАР, и температуре воды 24°С Увеличение интенсивности падающего света до 30-45% ФАР вызывало ингибирование роста водоросли и уменьшение количества синтезируемого каррагинана в 3 раза. Установлено, что при малой интенсивности света происходит биосинтез преимущественно нежелирующего типа каррагинана

6 Разработана методика количественного определения соотношения различных типов каррагинана с использованием ИК-спектроскопии

7 Впервые показана антивирусная активность каррагинана на модели вируса табачной мозаики Установлено, что в проявлении ингибирующего эффекта по отношению к вирусу табачной мозаики существенную роль играет структура полисахарида Наибольшую антивирусную активность проявляют полисахариды к-типа

Основные публикации по теме диссертации

I Yakovleva I. М , Yermak I М., Titlynov Е A., Barabanova А О , Glazunov V Р , Skriptsova А V Changes in growth rates, anatomy and polysaccharide content of a sterile form of Tichocarpus crtinitus (Omel.) Rupr (Rhodophyta, Tichocarpaceae) under differing photcn irradiances in the Sea of Japan (Russia) //Bot. Mar 2001 Vol 44, №5. P 493-500.

2. Barabanova A.O, Yermak I M , Glazunov V.P, Yakovleva l.M , Kim Yong Hwan, Solov'eva T F. Influence of life-history stage and photon irradiance on yield and quality of carrageenan in Tichocarpus crinitus (Rhodophyta, Tichocarpaceae) // Japanes J Phycology 2004. Vol. 52 (Supplement) P. 61-65.

3. Reunov A.V., Nagorskaya V P., Lapshina L A., Yermak l.M , Barabanova A O. Effect of к/p-carrageenan from red alga Tichocarpus crinitus (Tichocarpaceae) on infection of detached tobacco leaves with tobacco mosaic virus//J Plant Diseases and Protection 2004 Vol 111, № 2. P. 165-172.

4 Барабанова А О., Ермак И M., Глазунов В П , Исаков В В , Титлянов А Э , Соловьева Т.Ф Сравнительная характеристика карраг инанов, выделенных из вегетативной и репродуктивной форм водоросли Tichocarpus crinitus (Gmel) Rupr (Rhodophyta, Tichocarpaceae) // Биоорган химия. 2005 T 70, № 3. С 430-437

5. Барабанова А.О., Яковлева И.М. Количественный и качественный состав сульфатированного полисахарида красной водоросли Tichocarpus crinitus в зависимости от сезона сбора и световых условий обитания // II Региональная конференция по актуальным проблемам морской биологии, экологии и биотехнологии' сб тез докл -Владивосток, 1999 С 19

6 Ермак И М , Барабанова А.О , Соловьева Т.Ф. Влияние экзогенных и эндогенных факторов на биосинтез каррагинана из дальневосточных красных водорослей // Всероссийская конференция "Химия и технология растительных веществ"' сб тез докл -Сыктывкар, 2000. С. 63.

7 Barabanova А О. The content of structural polysaccharides in sterile form of Tichocarpus crinitus family Tichocarpaceae (Gmel) Rupr Under different irradiance conditions in the Sea of Japan, Russia // International Symposium on Biotechnology of Marine Algae and Marine Bioactive Substences' book of abstr - Qindao, China, 2000 P 29.

8 Yermak l.M, Kim Y.H, Shin K.S, Glasunov V.P, Barabanova A O, Solov eva I F Carrageenan from different life stage of Chondrus pinnulatus (Gigartinaceae) and Tichocarpus crtinitus (Tichocarpaceae) collected from Russian Pacific Coast // XVIIth International Seaweed Symposium-book of abstr - Cape Town, South Africa, 2001 P 78

9. Yermak. I M., Barabanova А О , Glazunov V.P , Yakovleva l.M , Titlynov E.A., Solov'eva T F Effect of environment parameters and reproductive stage of algae on the characteristics of carrageenans from Tichocarpus crtinitus and Chondrus pinnulatus // 7lh International Phycological Congress- book of abstr - Thessoloniki, Greece, 2001 P 61

10 Barabanova A.O., Yermak I.M., Nagorskay VP, Reyunov AV., Solov'eva T.F. Influence of different factors on carrageenan from red alga Tichocarpus crtinitus (Tichicarpaceae) of Russian Pacific Coast // International Symposium "Algae 2002". book of abstr. - Tsukuba, Japan, 2002. P 70.

11. Barabanova A O, Yermak. I M , Yong Hwan Kim, Yakovleva I.M , Solov'eva T.F., Titlyanov E.A. Influence of environmental factors on the content polysaccharides and phycobilin pigments of red seaweed collected from Russian Pacific Coast // XVIII International Seaweed Symposium- book of abstr. - Bergen, Norway, 2004. P. 92

12. Yermak I.M, Barabanova A.O., Glasunov VP, Davidova V.N, Solov'eva T.F., Polyakova A.M , Astriña О.P., Maleev V.V. Structure and biological properties carrageenan from red seaweed of Russian Pacific Coast and chitosans from golden crab shells // A satellite to the XVIII International Seaweed Symposium "Marine Biopolymers"' book of abstr. -Trondheim, Norway, 2004 P. 0-8.

13 Барабанова А.О, Ермак ИМ, Глазунов ВП, Исаков В.В , Соловьева Т.Ф. Структура каррагинанов из красных водорослей Tichocarpus crinilus и Chondrus pinnulatus II Региональная научная конференция "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии.": сб. тез. докл. - Владивосток. 2004. С 91.

Соискатель

Барабанова А О

111420

РНБ Русский фонд

2006-4 7578

Барабанова Анна Олеговна

Влияние эндогенных и экзогенных факторов на структуры и свойства каррагинанов красных водорослей Тккосагрш сггтШ и Скопит ртпиШт

АВТОРЕФЕРАТ

ЗАО "Фартоп" Г. Владивосток, ул. Алеутская, 28 Тираж 100 экз. Изготовлено с машинописных листов Отпечатано 21 мая 2005 г.

1. Введение.

2. Литературный обзор.

2.1. Источники выделения каррагинан.

2.2. Химическая структура каррагинанов.;Г.

2.3. Факторы, влияющие на биосинтез каррагинанов.

2.4. Физико-химические свойства каррагинанов.

2.5. Методы установления структуры каррагинанов.

2.6. Биологическая активность каррагинана.

2.7. Области использования каррагинанов.

3. Результаты и обсуждение.

3.1 Структура и свойства каррагинанов из 77сИосагрт сгтИш.

3.1.1.Физико-химические свойства полисахаридов, выделенных из вегетативной и репродуктивной форм Т. сппИш.

3.1.2. Структура полисахаридов, выделенных из вегетативной и репродуктивной форм Т. сгтНш.

3 2. Структура и свойства каррагинанов из СкопйгиьртпиШш.

3.2.1. Физико-химические свойства полисахаридов, выделенных из вегетативной и репродуктивной форм С. ртпиШш. щ 3.2.2. Структура полисахаридов, выделенных из вегетативной и репродуктивной форм С. ртпиШш.

3.3. Влияние фотосинтетически активной радиации (ФАР) и температуры воды на структуру каррагинанов.

3.4. Антивирусная активность каррагинанов.

4. Экспериментальная часть.

5. Выводы.

Красные водоросли содержат в значительных количествах сульфатированные полисахариды - каррагинаны, которые выполняют ряд важнейших функций в макрофитах. Эти полисахариды обладают уникальными физико-химическими "свойствами, благодаря чему широко используются в различных областях пищевой промышленности, и относятся к так называемым «пищевым» или «диетическим» волокнам. Не менее важными являются биологические свойства каррагинанов, среди которых наибольший интерес представляют антиязвенная, антикоагулирующая, иммуностимулирующая, противоопухолевая и противовирусная активности.

Физико-химические и биологические свойства этих полисахаридов находятся в тесной взаимосвязи с их структурой, которая характеризуется большим разнообразием и "замаскированной регулярностью". Каррагинаны построены из повторяющихся дисахаридных звеньев О-галактозы и ее производных, соединенных регулярно чередующимися Р-(1—>4) и а-(1—>3) гликозидными связями. В настоящее время установлены структуры около 20, так называемых, «идеализированных» типов каррагинанов, различающихся содержанием 3,6-ангидрогалактозы, местоположением и количеством сульфатных групп. Природные каррагинаны редко соответствуют таким регулярным структурам, состоящим из одинаковых дисахаридных звеньев, чаще всего они содержат повторяющиеся звенья нескольких типов, что объясняется многоступенчатым биосинтезом полисахаридов в клеточной стенке водоросли.

Структура каррагинанов зависит от множества факторов, которые условно можно разделить на экзогенные, определяемые условиями произрастания водоросли, а именно освещенностью, температурой и соленостью воды, и эндогенные, связанные с физиологией водоросли, в частности их видовой принадлежностью и стадиями развития. Последний фактор особенно важен, так как красные водоросли имеют сложный жизненный цикл, включающий чередование вегетативного, полового и бесполого размножения. Первые работы по структуре каррагинанов проводились в основном на образцах полисахаридов, выделенных из смеси водоросли разных генераций -гаметофитов и спорофитов. Такой подход часто приводил к получению противоречивых результатов. В последние годы структурные исследования каррагинанов, проводят учитывая фазы жизненного цикла водоросли, из которой они выделены. Это позволяет, во-первых, более точно установить структуру новых типов каррагинанов, а во-вторых, оценить влияние этого фактора на биосинтез полисахаридов. Взаимосвязь между условиями обитания водорослей и их физиологией, а также биохимическим составом изучалась несколькими группами иностранных исследователей. Были получены данные, свидетельствующие как о наличии корреляции между скоростью роста водорослей и биосинтезом ими каррагинанов, так и ее отсутствии. При этом, данные о влиянии таких важных параметров, как температура воды и фотосинтетически активная радиация (ФАР) на структуру и свойства синтезируемых полисахаридов немногочисленны. Вместе с тем, эти исследования могут служить хорошей основой для развития морской биотехнологии. В нашей стране, обладающей промысловыми запасами водорослей, подобные работы отсутствуют, хотя глубоким и систематическим изучением структуры полисахаридов водорослей занимается группа под руководством профессора А.И. Усова в Москве. Однако отдаленность источника предмета исследования от исполнителей не всегда позволяет учитывать те особенности, которые во многом определяют структуру и свойства выделяемых полисахаридов.

В морях Дальнего Востока обширные промысловые запасы водорослей образованы представителями семейств Gigartinaceae (Скопйгт агтШш и Скопйгт ртпиШш) и ИсЬосаграсеае (ТЧсНосагрш сппИш). . Водоросль Лскосагрш сгтНт, являясь эндемиком тихоокеанского побережья, представляет особый интерес, так как благодаря своему быстрому росту, крупным размерам и особенностям развития может рассматриваться как перспективный вид для производства полисахаридов Ранее было показано, что и Т. сппкш и С. ртпиШш относятся к каррагинанофитам. Однако, одно только таксономическое положение водоросли не дает полной информации о структуре синтезируемого полисахарида каррагинана. Оценка влияния различных факторов на структуру и свойства каррагинанов из промысловых видов водорослей имеет как фундаментальный, так и прикладной интерес. Эти исследования с одной стороны могут дополнить и уточнить общую концепцию биосинтеза полисахаридов в процессе .онтогенеза водорослей, а с другой стороны могут быть полезными при решении вопросов рационального использования водорослей, в частности их плантационного культивирования и промышленного производства каррагинанов.

2. Литературный обзор.

Морские водоросли используются в пищевых целях и медицинской практике более шести веков, но только в середине двадцатого столетия начинается активный поиск и выделение из них биологически-активных .веществ. Как и в случае наземных растений, преобладающим компонентом биомассы водорослей являются углеводы. Эти вещества служат энергетическим резервом и играют роль опорных структур, участвуя в построении клеточных стенок и образуя межклеточное вещество.

Красные водоросли содержат уникальные сульфатированные полисахариды - галактаны - агар и каррагинан, которые нигде в природе более не найдены [1]. Галактаны выполняют следующие функции в водорослях: а) ассоциируют с клеточной стенкой и образуют межклеточное вещество, назначение которого - цементировать клетки и обеспечивать целостность и механическую прочность всего растения. б) обладают ионнообменными свойствами, и таким образом защищают клетку от проникновения нежелательных катионов, или напротив, концентрируют необходимые. в) удерживают большое количество воды, защищая клетки от высыхания (особенно при отливах).

Впервые название "каррагин" появилось в 1837 г. для обозначения широко используемых в пище морских водорослей Irish moss, произрастающих в большом количестве на южном побережье Ирландии в небольшом местечке Каррагин [2]. Чуть позже эти водоросли обнаружены на побережье Соединенных Штатов, где они становятся предметом торговли [3]. Стэнфорд называет каррагином желирующее вещество, выделенное водной экстракцией из водорослей Chondrns crispus, больше известных как "ирландский мох" [2]. В 1871 г. был запатентован процесс его экстракции и очистки [4]. И только в 30-х гг. XX столетия начинается индустриальное производство этого продукта, его назвали - каррагинан, появившийся суффикс "-ан" отражает его принадлежность к полисахаридам [5].

В настоящее время наблюдается постоянный рост производства каррагинана. В начале 1990-х г.г. годовое производство полисахарида достигло 15.5 тыс. т. в год. Ежегодно оно увеличивается на 5% и в ближайшее время может составить свыше 30 тыс.т. [6]. Основные компании, производящие каррагинан, сосредоточены в Европе и США. В последнее время очень активно развивается производство каррагинана на Филиппинах, в Чили и в Китае. Ежегодные продажи каррагинана в мире исчисляются суммой более-чем 200 млн. долларов США. Увеличение объема производства каррагинана обусловлено повышенным спросом на продукты питания, в состав которых он входит. На рис. 1 показано распределение потребления каррагинана по регионам мира.

Япония 8%

Европа 36% Австралия 13%

Латинская Америка 17%

Северная Америка 26% Рис Л. Уровень потребления каррагинана по регионам мира [6].

Такой широкий интерес к каррагинану обусловлен его физико-химическими свойствами. Полисахарид обладает способностью увеличивать вязкость водных растворов и образовывать крепкие гели при определенных условиях, что обеспечивает его использование в пищевой и легкой промышленности, фармацевтике и биотехнологии. Разносторонняя биологическая активность каррагинана в сочетании с физико-химическими свойствами позволяет его использовать и в медицине.

2.1. Источники каррагинана.

В мировом океане насчитывается около 4000 видов красных водорослей, из которых более 250 имеют промышленное использование. Каррагинанофиты обнаружены среди многочисленных видов различных семейств красных водорослей: Gigartinaceae, Solieriaceae, Hypne~aceae, Phyllophoraceae, Petrocelidaceae, Caulacanthaceae, Cystocloniaceae, Rhabdoniaceae, Rhodophyllidaceae [7], Furcellariaceae [4], Tichocarpaceae [8] и Dicranemataceae

9].

Основные виды водоросли, которые используются для производства каррагинана, включают: Chondrns crispus, С. ocellatus, Gigartina aciculari, G. pistillata, G. stellata (.Mastacarpus stellatus), G. canaliculata (G. canaliculatus), G. radula, G. skottsbergii, Eucheuma coîtonii (Kappaphycus alvarezii), E. spinosum (E. denticulatum), E. gelatinae, Fur cellar ia fastigata и Hypnea musciformis [6, 4]. Большие запасы С. crispus находятся у берегов Канады, а вместе с G. stellata они образуют обширные залежи на побережье Франции и Испании [4, 10]. Вдоль южного побережья Франции, севера Португалии и Марокко распространены G. acicularis и G. pistillata [4]. Основные промысловые запасы красных водорослей в Чили представляют Sarcothalia crispata, G. skottsbergii и Mazzaella laminarioides [11]. В Индонезии и на Филиппинах добывают E. cottonii и Е. spinosum [4], В Австралии и Новой Зеландии преобладают некоторые виды Gigartina и завезенной с Филиппин и культивируемой Euchena sp. [12].

Большой вклад в поиск источников каррагинана среди водорослей Японского моря Российского побережья внес профессор А.И. Усов, который изучил состав и строение полисахаридов нескольких десятков водорослей. Итогом проведенного в середине 80-х гг. исследования явилось обнаружение среди красных водорослей Японского моря восьми источников каррагинанов, шесть из которых - Chondrus pinnulatus, С. armatus, С. yendoi, Gigartina ochotensis, G. unalaskensis, Rhodoglossum hemisphaericum - представители сем. Gigartinaceae.

Рис.2. Каррагинанофиты : 1 - Chondrus armaius 2-Tichocarpus crinitus один - Тюкосагрш сгтИш, из сем. 'ПсЬосаграсеае и один ТитеНа теНет'шпа, из сем. 8оНепасеае [1, 13].

Позднее в поисках новых источников каррагинанов были исследованы водоросли западного побережья залива Петра Великого Японского моря. Высокое содержание каррагинана обнаружено в представителях семейств РЬуНорЬогасеае (виды рода Сутп§01^гиз) и С^агйпасеае {МаьЬэсагрт расист и 1гес1аеа согписоргае), а также в трех видах рода СЬопс1гиз. Представители последнего широко распространены во всех морях Дальнего Востока, но чистых зарослей не образуют, а смешаны с другими красными водорослями [14].

5. Выводы.

1. Проведен сравнительный качественный и количественный анализ полисахаридов, выделенных из водорослей, собранных на разных стадиях их развития, на примере ЛсИосагриз сг'т'йт СПсИосаграсеае) и Скопйгт ртпи1а1ш (01§а11тасеае). Показано, что общее количество полисахаридов, экстрагируемых из репродуктивной формы Т. сгтНш, в 1,8 раза больше, чем из вегетативной, причем в репродуктивной форме присутствуют в основном желирующие полисахариды с высокой молекулярной массой. Напротив, из вегетативной формы С. ртпиШт было выделено в 2 раза больше полисахаридов, чем из репродуктивной. Желирующие полисахариды из репродуктивной формы С. ртпиШт образуют более прочные гели.

2. Установлена структура полисахаридов, выделенных из двух форм водоросли Тккосагрш сппИт СПсЬосаграсеае) - вегетативной и репродуктивной. Показано, что желирующие полисахариды из обеих форм водоросли имеют идентичную структуру, относящуюся к к/р-каррагинанам. Различие заключается в соотношении дисахаридных звеньев к- и р-типов, а также присутствии небольшого количества сульфатированных дисахаридных звеньев (предшественников к-типа каррагинанов) в полисахаридах, выделенных из репродуктивной формы водоросли.

3. Показано, что нежелирующие полисахариды, выделенные из обеих форм 77сНосагрш сппИш относятся к новому типу каррагинанов. В основе их структуры лежит дисахаридное звено, состоящее из остатков 3-связанного р-0-галактопиранозил-2,4-дисульфата и 4-связанного-а-3,6-ангидро-Б-галактопиранозида.

4. Установлена структура полисахаридов, выделенных из репродуктивной и вегетативной форм Скопйгт ртпиШш. Желирующие полисахариды из двух форм этой водоросли имеют структуру к/ь каррагинанов, с преобладающим содержанием к звеньев в каррагинане из репродуктивной формы СНопс1гш ртпиШш. Нежелирующие полисахариды представляют собой смесь сульфатированных каррагинанов, содержащую небольшое количество 3,6-ангидрогалактозы

5. Установлено влияние фотосинтетически активной радиации и температуры воды на качественные и количественные характеристики каррагинана, выделенного из Т1скосагрш сппИш. Максимальное количество каррагинана в этой водоросли было получено при освещенности, равной 1015% поверхностной ФАР, и температуре воды 24°С. Увеличение интенсивности падающего света до 30-35% ФАР вызывало ингибирование роста водоросли и уменьшение количества синтезируемого каррагинана в 3 раза. Установлено, что при малой интенсивности света происходит биосинтез преимущественно нежелирующего типа каррагинана.

6. Разработана методика количественного определения соотношения различных типов каррагинана с использованием ИК-спектроскопии.

7. Впервые показана антивирусная активность каррагинана на модели вируса табачной мозаики. Установлено, что в проявлении ингибирующего эффекта по отношению к вирусу табачной мозаики существенную роль играет структура полисахарида. Наибольшую антивирусную активность проявляют полисахариды к-типа.

102

1. А.И Усов. Полисахариды красных морских водорослей // Прогресс химии углеводов ; М.: Наука, 1985. С. 77-96.

2. Ethnopharmacol. 1983. Уо1. 9. P. 347-351.

3. Lewis G., Stanley N., Guist G. Commercial production and application of algal hydrocolloids. Algae and Human affairs, Lembi C. // Ed., Seattle: Univ. of Washington. 1988. P. 206-232.

4. Stanford E.C. On the economic application of seaweeds // J. Soc. Arts. 1962. Vol. 10. P. 185-195.

5. Bixler H.J. Recent developments in manufacturing and marketing carrageenan // Hydrobiologia. 1996. Vol. 326/327. P. 35-37.

6. Усов А.И. Химическое исследование полисахаридов красных морских водорослей: автореф. дис. д-ра биол.наук. Москва, 1976. - 7 с.

7. Liao M.L., Kraft G.T., Munro S., Craik D.J. Beta/kappa-carrageenans as evidence for continued separation of the families Didranemataceae and Sarcodiaceae (Gigartinales, Rhodophyta) // J. Phycology. 1993. Vol. 29. P. 933-844.

8. Блинова Е.И. Ресурсы морских водорослей // Биологические ресурсы океана; М. : Агропромиздат, 1985. С. 233-241.

9. И. Buschmann А.Н., Correa J., Westermeier R., Hernandez-Gonzalez M.C., Norambuena R. Red algal farming in Chile: a review // Aquaculture. 2001. Vol. 194. P. 203-220.

10. Pickmer S.E., Parsons M.J., Bailey R.M. Variation carrageenans levels and composition in three New Zealand species of Gigartina // New. Zeal. J. Sci. 1975. Vol. 18. P. 585-590.

11. Усов А.И. Полисахариды морских водорослей. Проблемы изучения и использования // Биологически активные вещества морских организмов; М. НО АНСССР, 1990. С. 97-111.

12. Chapman V.J., Chapman D.J. Seaweeds and their uses. New-York. 1980. P. 98148.

13. Rees D.A. The carrageenans system of polysaccharides. 1. The relation between the к- and ^-components // J. Chem. Soc. 1963. Vol. 1. P. 1821-1832.

14. Dolan T., Rees D. The carrageenans. II. The positions of the glycosidic linkages and sulfate esteres in ^-carrageenans // J. Chem. Soc. 1965. Vol. 1. P. 3534-3539.

15. Anderson N.S., Dolan T.C.S., Lawson C.J., Rees D.A. Carraginans. V. The masked repeating structures of carraginans // Carbohydr. Res. 1968. Vol. 7. P. 468-473.

16. Penman A., Rees D.R. Carrageenan. X. Synthesis of 3,6-di-O-methyl-D-galctose, a new sugar from the methylation analysis of polysaccharides related to i-carrageenan //J. Chem. Soc. Perckin Trans. 1973. Vol. 1, № 19. P. 2188-2191.

17. Stortz C., Cerezo A.S. The carbon-13 NMR spectroscopy of carrageenans: calculation of chemical shifts and computer aided structiral determination // Carbohydr. Polym. 1992. Vol. 19. P. 237-242.

18. Bellion C., Brigand G., Prome J.-C., Bociek D.W. Identification et caractérisation des précurseurs biologiques descarraghénanes par spectroscopie de RMN-13 /'/ Carbohydr. Res. 1983. Vol. 119. P. 31-48.

19. Liao M.-L., Chiovitti A., Munro S.L.A., Craik D.J., Kraft G.T., Bacic A. Sulfated galactans from Australian specimens of the alga Phacelocarpus peperocarpos (Gigartinales, Rhodophyta) // Carbohydr. Res. 1996. Vol. 296, № 5. P. 237-247.

20. Van de Velde F., Knutsen S.H., Usov A.I., Rollema H.S., Cerezo A.S. 'H and 13C high resolution NMR spectroscopy of carrageenans: application in research and industry // Trends in Food & Tehnology. 2002. Vol. 13. P. 73-92.

21. Chiovitti A., Bacic A., Craik D.J., Munro S.L., Kraft G.T., Liao M.-L., Falshaw R., Furneaux R.H. A pyruvated carrageenan from Australian specimens of the red alga Sacronemafiliforme II Carbohyd. Res. 1998. Vol. 314, № 3-4/ P. 229-243.

22. Falshaw R., Furneaux R. H. Carragenan from the tetrasporic stage of Gigartina clavifera and Gigartina alveata (Gigartinaceae, Rhodophyta) // Carbohyd. Res. 1995. Vol. 276, № LP. 155-165.

23. Takano R., Nose Y., Hayashi K., Hara S., Hirase S. Agarose-carrageenan hybrid polysaccharide from Lomentaria catenata // Phytochemistry. 1994. Vol. 37. P. 1615-1619.

24. Miller I.J., Furneaux R.H. A structural analysis of the polysaccharide from Kallymenia berggreniiJ. Ag. II Bot. Mar. 1996. Vol. 39. P. 141-147.

25. Falshaw R., Furneaux R.H., Miller I.J. The backbone structure of th sulfated galactan from Plocamium costatum (C. Agardh) Hook. F. Et. Harv. (Plocamiaceae, Rhodophyta) // Bot. Mar. 1999. Vol. 426, № 5. P. 431-435.

26. Miller I.J. The chemotaxonomic significance of the water-soluble red algal polysaccharides // Recent Research Developments in Phytochemistry. 1997. Vol. l.P. 531-565.

27. Craigie J.S. Cell wall // Biology of the Red Algae; Cambridge: Cambridge University Press, 1990. P. 221-257.

28. Knutsen S.H. Isolated and analysis of red algal galactans: doctoral thesis. -Norway, 1992.

29. Van de Velde F., Peppelman H.A., Rollema H.S.,Tromp R.H. On the structure of к/i-hybrid carrageenans // Carbohyd. Res. 2001. Vol. 331, № 3. P. 271-283.

30. Falshaw R., Bixler H.J., Johndro K. Structure and performance"of commercial к-2 carrageenan extracts. Part I. Structure analysis // Food Hydrocolloids. 2001. Vol. 15, №4-6. P. 441-452.

31. Estevez J.M., Ciancia M., Cerezo A.S. Carrageenans biosyntesized by carposporophytes of red seaweeds Gigartina skottsbergii (Gigartinaceae) and. Gymnogongrus torulosns (Phyllophoraceae) // J. Phycol. 2002. Vol. 38, № 2. P. 344-350.

32. Murano E., Toffanin R., Cecere E., Rizzo R., Knutsen S.H. Investigation of the carrageenans extracted from Solieria filiformis and Agardhiella subulata from Mar Piccolo, Taranto//Mar. Chem. 1997. Vol. 58, № 3-4. P. 319-325.

33. McCandless E.L., Craigie J.S. Sulphated polysaccharides in red and brown algae // Annu. Rev. Plant Physiol. 1979. Vol. 30, № 4. P. 41-53.

34. Mollion J., Moreau S., Christiaen D. Isolation of a new type of carrageenan from Risoella verruculosa (Bert.) J. Ag. (Rhodophyta, Gigartinales) // Bot. Mar. 1986. Vol. 29, № 5. P. 549-552.

35. Knutsen S.H., Crasdalen H. Analysis of carrageenans by enzymic degradation, gel-filtration and 'H-NMR spectroscopy // Carbohydr. Polym. 1992. Vol. 19, № 3.P. 199-210.

36. Knutsen S.H., Myslabodski D.E., Larsen В., Usov A.I. A modified system of nomenclature for red algal galactans // Bot. Mar. 1994. Vol. 37, № 2. P.163-169.

37. Chopin Т., Hanisak M.D., Craigie J.S. Carrageenans from Kallymenia westii (Rhodophyceae) with a review of the phycocolloids produced by the Cryptonemiales // Bot. Mar. 1994. Vol. 37, № 5. P. 433-444.

38. Bulboa C.R., Macchiavello J.E. The effects of light and temperature on different phases of the life cycle in the carrageenan producing alga Chondracanthus chamissoi (Rhodophyta, Gigartinales) // Bot. Mar. 2001. Vol. 44, № 4. P 371-374.

39. Пржйёнецкая В.Ф. Гербарий морских водорослей. Владивосток: Дальнаука, 2000. - 36-43 с.

40. McCandless Е., Craigie J., Waker J. Carrageenans in the gametophytic and sporophytic states of Chondrus crispus И Planta (Berl.). 1973. Vol. 112, № 3. P. 201-212.

41. Ayal H., Matsuhiro B. Polysaccharides from nuclear phases of Irideae ciliata and I. Membranaceae // Hydrobiologia. 1987. Vol. 151/152. P. 531-534.

42. Stortz C., Cerezo A. The system of carrageenans from cystocarpic and tetrasporic stages from Iridaea undolosa. Fraction with potassium chloride and methylation analysis of the fractions // Carbohyd. Res. 1993. Vol. 242, № 2. P. 217-227.

43. Stortz C., Bacon В., Cherniak R., Cerezo A. High field NMR spectroscopy of cystocarpic and tetrasporic carrageenans from Iridaea undolosa II Carbohyd. Res. 1994. Vol. 261, №2. P. 317-326.

44. Ciancia M., Matulewicz M.C., Cerezo A. A L-galactose-containing carrageenan from cystocarpic Gigartina skottbergii И Phytochem. 1997. Vol. 45, № 3 P. 10091013.

45. Falshaw R., Furneaux R. Carragenan from the tetrasporic stage of Gigartina decipiens (Gigartinaceae, Rhodophyta) // Carbohyd. Res. 1994. Vol. 252, № 1. P.171-182.

46. Falshaw R., Furneaux R. Structural analysis of carrageenans from the tertrasporic stages of the red algae, Gigartina lanceata and Gigartina chapmanii (Gigartinaceae, Rhodophyta) // Carbohyd. Res. 1998. Vol. 307, № 3-4. P. 325331.

47. McCandless E.L., West J.A., Guiry M.D. Carrageenan patterns in the Phyllophoraceae // Biochem. Syst. Ecol. 1982. Vol. 10, № 4. P. 275-284.

48. Dawes C.J., Stanley N., Standoff D. Seasonal and reproductive aspects- of plant chemistry and i-carrageenan from Floridian Euchema (Rhodophyta, Gigartinales) // Bot. Mar. 1977. Vol. 20, № 3. p. 137-147.

49. McCandless E.L. Biological control of carrageenan structure effects conferred by the phase of life cycle of the carrageenophyte // Proc. Int. Seaweed Symp. 1981. Vol. 8. P. 1-18.

50. Trono G., Lluisma A. Differences in biomass production and carrageenan yields among 4 strains of farmed carrageenophytes in Northern Bohol. Philippines // Hydrobiologia. 1992. Vol. 247, № 1-3. P. 223-227.

51. Chopin T., Sharp G., Belyea E., Semple R., Jones D. Open-water aquaculture of the red alga Chondrus crispus in Prince Edward Island, Canada // Hydrobiologia.1999. Vol. 398/399. P. 417-425.

52. Lopez-Acuno L.M., Pacheco-Ruiz I., Hernandez-Garibay E., Zertuche-Gonzalez J.A. Characterization of the Chondracanthus pectinatus (Rhodophyta, Gigartinales) // Cienciaz Marina. 2002. V. 28, № 3. P. 311-318.

53. Reani A., Cosson J., Parker A., Zaoui D. Influence of culture conditions on growth and rheological properties of carrageenans in Cystoclonium purpureum (Huds.) Batters // Bot. Mar. 1998. Vol. 41, № 3. P. 299-304.

54. Zinoun M., Cosson J., Deslandes E. Influence of culture conditions on growth and physicochemical properties of carrageenans in Gigartina tedii (Rhodophyceae, Gigartinales) //Bot. Mar. 1993. Vol. 36, № 2. P. 131-136.

55. Rivero-Carro H., Craigie J.S., Shacklock P.F. Influence of tissue source and growth rates on dry weght and carrageenan composition of Chondrus crispus (Gigartinales, Rhodophyta)//Hydrobiologia. 1990. Vol. 204/205. P. 533-538.

56. Chopin T., Wagey B.T. Factorial study of the effects of phosphorus and nitrogen enrichments on nutrient and carrageenan content in Chondrus crispus (Rhodophyceae) and residual nutrient concentration in seawater // Bot. Mar. 1999. Vol.42,№ LP.23-31. '

57. Moesly C.M. The effect of cultivation condition on the yield and quality of carrageenan in Chondrus crispus II Intr. Appl. Phycol.; Hague: SPB Academic, 1990. P. 565-574.

58. Heyraud A., Rinaudo M., Rochas C. Physical and chemical properties of phycolloids // Intr. Appl. Phycol.; Hague: SPB Academic, 1990. P. 151-176.

59. Yermak I.M., Khotimchenko Yu.S. Chemical Properties, biological activities and application of carrageenan from red algae // Recent Advances in Marine Biotechnology ; N.Y.: Science Publishers, Inc., 2003. Vol. 9. P. 207-255.

60. Piculell L.T. Gelling carrgeenans // Food Polysaccharides and Their Applications; N. Y.: MD Inc, 1995. P. 205-244.

61. Ekstrom L. Molecular-weight distribution and the behaviour of kappa carageenan II Carbohyd. Res. 1985. Vol. 135, № 2. P. 283-285.

62. Rochas C., Rinaudo M., Landry S. Role of the molecular weight on the mechanical properties of kappa carageenan gels // Carbohyd. Polym. 1990. Vol. 12, № 4. P. 255-266.

63. Lundin L., Hermansson A.-M. Influence of locust bean gum on the rheological behaviour and microxtructure of K-K-carrageenan // Carbohyd. Polym. 1995. Vol. 28, № l.P. 91-99.

64. Zhang W., Piculell L., Nilsson S., Knutsen S.H. Cation specificity and cation binding to low sulfated carrageenans // Carbohyd. Polym. 1994. Vol. 23, № 4. P. 105-110.

65. Hjerde T., Smidsrod O., Christensen B.E. Analysis of the conformational properties of kappa- and iota-carrageenan by size-exlusion chromotography combined with low-angel laser light scattering // Biopolym. 1999. Vol. 49, № l.P. 71-80.

66. Yuguchi Y., Thuy T.T.T., Urakawa H., Kajiwara K. Structural characteristic of carrageenan gels: temperature and concentration dependence // Food Hydrocolloids. 2002. Vol. 16, № 6. P. 515-522.

67. Witt M. H.J. Carrageenan nature is most versatile hydrocolloid // Biotecnology of marine polysaccharides; W: Colwell eds., 1985. P. 345-363.

68. Stanley N.F. Carrageenan // Food Gels; L.: Elsever Appl. Science, 1990. P. 79119.

69. Brunt D., Buliga G. Chemical structure and macromolecular conformation of polysaccharides in the aqueous enviroment // Biotechnology of Marine Polysaccharides; W.: Colwell eds., 1985. P.29-73.

70. Ueda K., Brady J. Molecular dynamics simulations of carrabiose // Biopolym. 1997. Vol. 41, №2. P. 323-330.

71. Smidsrod O., Grasdalen H. Conformations of K-carrageenan in solution // Hydrobiologia. 1984. Vol. 116. P. 19-28. ~

72. Rees D.A., Morris E.R., Thorn D., Madden S.K. Shapes and interaction of carbohydrate chains // The polysaccharides; O.: Academic Press, 1982. P. 195290.

73. Anderson N.S., Campbell J.W., Harding M.M., Res's D.A., Samuel J.W. X-ray diffraction studies of polysaccharide sulphates: double helix models for kappa and iota-carrageenan // J. Mol. Biol. 1969. Vol. 45, № 1. P. 85-99.

74. Hoffmann R.A., Gidley M.J., Cook D., Frith W.J. Effect of isolation prosedures on the molecular composition and physical properties of Euchemeuma cottonii carrageenan // Food Hydrocol. 1995. Vol. 39, № 2. P. 281-289.

75. Grasdalen H., Smidsrod O. Iodid-specific formation of kappa-carrageenan single helices. I-NMR-spectroscopic evidence for selective site binding of ioddide anions in ordered conformation // Macromol. 1981. Vol. 14, № 4, № 5. P. 1842-1845.

76. Vebke C., Borgstrom J., Piculell L. Characterisation of kappa- and iotacarrageenan coils and helices by Mall/GPC // Carbohyd. Polym. 1995. Vol. 27,5. P. 145-154.

77. Borgstrom J., Quist P., Piculell L. A novel chiral nematic phase in aqueous kcarrageenan // Macromolecules. 1996. Vol. 29, № 18. P. 5926-5933.

78. Borgstrom J., Piculell L., Vebke C., Talmon Y. On the structure of aggregatedkappa-carrageenan helices:' A study by cryo-TEM, optical rotation andviscometry // Int. J. Biol. Macromol. 1996. Vol. 18, № 3 P. 223-229.

79. Meunier V., Taco N., Durand D. Structure of aggregation k-carrageenan fractionsstudied by light scattering // Biol. Macromol. 2001. Vol. 28, № 6. P. 157-165.

80. Sandford P. Application of marine polysaccharides in the chemical industries //

81. Biotechnology of marine polysaccharides; W.: Colwell eds., 1985. P. 453-519.

82. King G.M., Lauterbach G.F. Characterisation of carrageenan nitrigen content andits susceptibility to enzymatic hydrolysis // Bot. Mar. 1987. Vol. 30, № 4. P. 3339.

83. Knutsen S., Murano M., Amato E., Toffanin R., Rizzo R., Paoletti S. Modified procedures for extraction and analysis of carragenan applied to the red alga Hypnea musciformis II J. Appl. Phycol. 1995. Vol. 7, № 6. P. 565-576.

84. Stevenson T.T., Fumeaux R. Chemical methods for analysis of sulphated galactans from red algae // Carbohyd. Res. 1991. Vol. 210, № 8. P. 277-298.

85. Lahaye M. Developments on gelling algal galactans, their strucure and physico-chemistry // J. Appl. Phycol. 2001. Vol. 13, № 2. P. 173-184.

86. Van de Velde F., Knutsen S.H., Usov A.I., Rollema H.S., Cerezo A.S. JH and 13C high resolution NMR spectroskopy of carrageenans: application in research and industry // Trends Food Sci. Tehnology. 2002.Vol. 13, № 3. P. 73-92.

87. Noseda M.D., Viana A.G., Duarte M.E.R., Cerezo A.S. Alklali modification ofcarrageenans. Part IV. Porphyrans as model compounds // Carbohyd. Polym.2000. Vol. 42, № 3. P. 301-305.

88. Bongaerts K., Paoletti S., Denef B., Vanneste K., Cuppo F., Reynaers H. Light scattering investihation of iota-carrageenan aqueous solutions. Concentration dependence of association // Macromolecules. 2000. Vol. 33, № 23. P. 8709-8719.

89. Matsuhiro В. Vibrational spectroscopy of seaweed galactans // Hydrobiologia. 1996. Vol. 327. P 481-489.

90. Mangin C.M., Goodall D.M., Roberts M.A. Separation of i-, ss- and X-carrageenans by capillary electrophoresis // Electrophoresis. 2001. Vol. 22, № 8. P. 1460-1467.

91. Michel G., Helbert W., Kahn R., Dideberg O., Kloareg. The structural bases of "the processive degradation of iota-carrageenan, a main cell wall polysaccharide of red algae //J. Mol. Biol. 2003. Vol. 334, № 3. P. 421-433.

92. Knutsen S.H., Sletmoen M., Kristensen T., Barbeyron T., Kloareg В., Potin P. A rapid method for the separation and analysis of carrageenan oligosaccharides released by iota- and kappa-carrageenase // Carbohyd. Res. 2001. Vol. 331, № 1. P. 101-106.

93. Усов А.И. Проблемы и достижения в структурном анализе сульфатированных полисахаридов красных водорослей // Химия растительного сырья. 2001. № 2. С. 7-20.

94. Usov A.I. A new chemical tool for characterization and partial depolymerization of red algal galactans //Hydrobiologia! 1993. Vol. 261. P. 641-645,

95. Quemener В., Lahaye M. Comparative analysis of sulfated galactans from red algae by reductive hydrolysis and mild methanolysis coupled to two different HPLC techniques // J. Appl. Phycol. 1998. Vol. 10. P. 75-81.

96. Usov A.I., Klochkova G.N. Polysaccharides of algae 45. Polysaccharide composition of red seaweed from Kamchatka coastal waters (Northwestern Pacific) studies by reductive hydrolysis of biomass // Bot. Mar. 1992. Vol. 35, № 5. P. 371-378.

97. Усов А.И., Элашвили М.Я. Количественное определение производных 3,6-ангидрогалактозы и специфическое расщепление галактанов красных водорослей в условиях восстановительного гидролиза // Биоорг. химия. Т. 17, №6. С. 839-848.

98. Usov A.I. Structural analysis of red seaweed galactans of agar and carrageenan groups // Food Hydrocolloids. 1998. Vol. 12. P. 301-308.

99. Cases M.R., Cerezo A.S., Stortz C.A. Separation and quantitation of enantiomeric galactoses and their mono-O-methylethers as their diastereomeric cetylated 1deoxy-l-(2-hydroxypropylamino)alditoIs // Carbohyd. Res. 1995. Vol. 269, № 2. P. 333-341.

100. Miller I.J., Blunt J.W. New ,3C NMR methods for determining the structure of algal polysaccharides. Part 1. The effect of substitution on the chemical shifts of sample diad galactans // Bot. Mar. 2000. Vol. 43, № 3. P. 239-250.

101. Miller I.J., Blunt J.W. 13C NMR methods for determining the structure of algal polysaccharides. Part-"2. Galactans consisting of mixed diads // Bot. Mar. 2000. Vol. 43, №3. P. 251-261.

102. Rees A. Enzymic synthesis of 3,6-anhydro-L-galactose within porphyran from L-galactose-6-sulphate units // Biochem. J. 1961. Vol. 81, № 4. P. 341-352.

103. Percival E., McDowell R.H. Chemistry and enzymology of marine algal polysaccharides; L.: Academic. Press, 1967.

104. Stanley N.F. Production, properties and uses of carrageenan // Production and utilization of products from commercial seaweed.

105. Usov A.I., Alamyants K.S., Miroshnikova L.I., Shaposhnikova A.A., Kochetkov N.K. Solvolytic desulphation of sulphated carbohydrates // Carbohyd. Res. 1971. Vol. 18, №2. P. 336-338.

106. Matsuo M., Takano R., Kamei-Hayashi K., Hara S. A novel regioselective desulfation of polysaccharide sulfates: specific 6-O-desulfation with N, O-bis(trimethysilyl)acetamide // Carbohyd. Res. 1993. Vol. 241, № 4. P. 209-215.

107. Miller I.J., Blunt J.W. Desulfation of algal galactans // Carbohyd. Res. 1998. Vol. 309, № l.P. 39-43.

108. Kolender A.A., Matulewicz M.C. Desulfation of sulfated galactans with chlorotrimethylsilane. Characterization of P-carrageenan by lH NMR spectroscopy // Carbohyd. Res. 2004. Vol. 339, № 2. P. 1619-1629.

109. Black W.A.P., Blakemore W.R., Colguhoun J.A., Dewar E.T. Evaluation of some red marine algae as a soursce of carageenan and its k and X components // J. Sci. Food. Agr. 1965. Vol. 16, № 1. P. 573-585.

110. Michell A.J. Second-derivative F.T.-I.R. spectra of naive cellulose // Carbohyd. Res. Vol. 1997, № 2. P. 53-60.

111. Rochas C., Lahaye M., Yaphe W. Sulfate content of carrageenan and agar determined by infrared spectroscopy // Bot. Mar. 1986. Vol. 29, № 5. P. 335-340.

112. Roberts M.A., Quemener B. Measurement of carrageenan in food: challenges, progress, and trends in analysis // Trends in Food Sciense and Technology. 1999. Vol. 10, №4-5. P. 169-181.

113. Chopin T., Whalen E. A new and rapid method for carrageenan identification by FT IR diffuse reflectance spectroscopy directly on dried, ground algal material // Carbohyd. Res. 1993. Vol. 246, № 2. P. 51-59.

114. Bhattacharjec S.S., Yaphe W., Hamer G.K. 13C-NMR spectroscopic analysisof agar, kappa-carrageenan and iota-carrageenan // Carbohyd. Res. 1978. Vol. 60, № 4. P. 977-990.

115. Usov A.I., Yrotskii S.V., Shashkov A.S. 13C-NMR spectroskopy of red algal galactans // Biopolym. 1980. Vol. 19, № 1. P. 977-990.

116. Cacerez P.J., Carlucci M.J., Damonte E.B., Matsuhiro B., Zuniga E.A. Carrageenans from Chilean samples of Stenogramme interrupta (Phyllophoraceae): structural analysis and biological activity // Phytochemistry. 2000. Vol. 53, № LP. 81-86.

117. Yu G., Guan H., Ioanoviciu S., Sikkander S.A., Thanawiroon C., Tobacman J.K., Toida T., Linhardt RJ. Structural studies on K-carrageenan derived oligosaccharides // Carbohyd. Res. 2002. Vol. 337, № 2. P. 433-440.

118. Aguilan J.T., Broom J.E., Hemmingson J.A., Dayrit F.M., Montano M.N.E., Dancel M.C.A., Ninonuevo M.R., Furneaux F.M. Structural analysis of carrageenan from farmed varieties of philippine seawed // Bot. Mar. 2003. Vol. 46, №2. P. 179-192.

119. Roberts M.A. Zhong H.J., Prodolliet L., Goodall D.M. Separation of high molecular weight carrageenan polysaccharided by capillary electrophoreses with laser induced fluirescence detection // J. Chrom. A. 1998. Vol. 817, № 3. P. 353366.

120. Novotny M., Sudor J. Electromigration behavior of polysaccharides in capillary electrophoresis under pulsed-field conditions // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 90. P. 9451-9455.

121. Hau L., Roberts M. Advantages of pressurization in capillary electrophoresis/electrospray ionization mass spectrometry // Anal. Chem. 1999. Vol. 71, №8. P. 3977-3984.

122. De Ruiter G.A., Rudolph B.'Carrageenan biotechnology // Trends Food Sci-Tech. 1997. Vol. 8, № 12. P. 389-395.

123. Araki T., Higashimoto Y., Morshita T. Purification and characterization of kappa-carrageenase from marine bacterium, Vibrio sp CA-1004 // Fisheries Science. 1999. Vol. 65, № 6. P. 937-942.

124. Dyrset N., Lystad K.Q., Leyine D.W. Development of a fermentation for production of a kappa-carageenase from Pseudomonas carrageenovora // Enzyme Microb. Tech. 1997. Vol. 20, № 6. P. 418-423.

125. Barbeyron T., Flament D., Michel G., Potin P., Kloareg B. The sulphated-galactan hydrolases, agarases and carrageenases: structural biology and molecular evolution // Cah. Biol. Mar. 2001. Vol. 42, № 1-2. P. 169-183.

126. Winter C.A., Risley E.A., Nuss G.W. Carrageenan-induced edema in the hindpawof the rat as an assat for anti-inflammatory drugs // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1962. Vol. 111. P. 544-547.

127. Roach J.T., Sufka K.J. Characterization of the chick carrageenan response // Breain Res. 2003. Vol. 994, № 2. P. 216-225.

128. Yamamoto T., Saito O., Shono K., Hirasawa S. Activation of spinal orexin-1 receptor produces anti-allodynic effect in the rat carrageenan test // Eur. J. Pharmacol. 2003. Vol. 481, № 2-3. P. 175-180.

129. Kupeli E., Erdemoglu N., Yesilada E., Sener B. Anti-inflommatory and antinociceptive activity of taxoids and lignans from the hearwood of Taxus baccata L. // J. Ethnopharmacol. 2003. Vol. 89, № 2-3. P. 265-270.

130. Chou T.C., Chang L.P., Wong C.S., Yang S.P. The anti-inflommatory and analgesic effects of baicalin in carrageenan-evoked thermal hyperalgesia // Anesth. Analg. 2003. Vol. 97, № 6. PI724-1729.

131. Rotrlli A.E., Guardia T., Juarez A.O., de la Rocha N.E., Pelzre L.E. Comparrative study of flavonoids in experimental models of inflammation // Pharmacol. Res. 2003. Vol. 48, № 6. P. 601-606.

132. Matsubara K. Anticoagulant from marine algae // Recent Advances in marine biotechnology; N.Y.: Science Publishers Inc., 2003. Vol. 9. P. 127-141.

133. Eisner H, Broser W., Burgel E. Uber das Vorkommen yon hochwirksamen, die Blutgerinnung hemmenden Stoffen in Rotalgen // Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem. 1937. Vol. 246, № 7. P. 244-247.

134. Eisner H. Uber das Vorkommen von hochwirksamen, die Blutgerinnung hemmenden Stoffen in Meersalgen // Hoppe-Seylers Z. Physiol. Che. 1938. Vol. 252, №8 P. 196-200.

135. Anderson W., Duncan J.C.C. The anticoagulant activity of carrgeenan // J. Pharm. Pharmocol. 1965. Vol. 17; 4. P. 647-654.

136. Farias W.R.L., Valente A.P., Pereira M.S., Mourao P.A.A. Structure and anticoagulant activity of sulfated galactans // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275, № 5. P. 29299-29307.

137. Kidness G., Long W.F., Williamson F.B. Enhancement of antithrombin III activity by carrageenan // Thromb. Res. 1979. Vol. 15, № 2. P. 49-60.

138. Kidness G., Long W.F., Williamson F.B., Boyd J. Effects of carrageenans on the aggregation of human blood platelets // Thromb. Res. 1979. Vol. 15, № 2. P. 315.

139. Hawkins W.W., Leonard V.G. The antithrombic activity of carrageenan in human blood//Can. J. Biochem. Physiol. 1963. Vol. 41, № 1. P.1325-1327.

140. Guven K.C., Guvener В., Guler E. Pharmocological activiies of marine algae // Intr. Appl. Phycol.; Netherlands: Academic Publishong, 1990. P. 67-92.

141. Ефимов B.C., Усов А.И., Ольская T.C. Сравнительное исследование антикоагулянтной активности сульфатированных полисахаридов красных морских донных водорослей // Фармакол. Токсикол. 1983.Т. 4, № 3. С. 6167.

142. Schwartz H.J., Kellermeyer R.W. Carrageenan and delayed hypersensivity. II. Activation of Hageman factor by carrageenan and its possible significance // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1969.Vol. 132. P. 1021-1024.

143. Vargaftig B.B. Carrageenan and thrombin trigger prostaglandin synthetase-independent aggregation of rabbit platelets: inhibition by phospholipase A2 inhibitors // J. Pharm.Pharmacol. 1977.Vol. 29, № 7. P. 222-228.

144. Kindess G., Williamson F.B., Long W.F. Inhibition by antithrombin III of carrageenanand xylan SP 54-induced aggregation of human blood platelets // Biochem. Soc. Trans. 1980. Vol. 8, № 1. P. 84-85.

145. Murata K. Effects of carrageenan on serum lipids and atherosclerosis in rabbits // Nature. 1961. Vol. 191, №4. P. 189-190.

146. Ito K., Tsuchiya Y. The efect of algal polysaccharides on the depressing of plasma cholesterol levels in rats // Proc. Int. Seaweed Symp. 1972. Vol. 7. P. 558-561.

147. Treter-Callagher E., Mathieson A. Biological properties of carrageenans // Biotechnology of marine polysacharides; W.: Colwell edw., 1985. P. 413-431.

148. Carlucci, MJ. Scolaro, LA. Damonte, EB. Herpes simplex virus type 1 variants arising after selection with an antiviral carrageenan: Lack of correlation between drug susceptibility and syn phenotype // J. Med.l Virol. 2002.Vol. 29, № 5. P. 0146-6615.

149. Carlucci M.J., Scolaro L.A., Damonte E.B. Inhibitory action of natural carrageenans on herpes simplex virus infection of mouse astrocytes // Chemotherapy. 1999. Vol. 12, № 2. P .0009-3157.

150. Zacharopoulos V.R., Phillips. D.M. Vaginal formulations of carrageenan protect mice from herpes simplex virus infection // Clin. Diagn. Lab. Immun. 1997.Vol. 4. P. 465-468.

151. Hamasuna R., Eizuru Y., Shishime Y., Minamishima Y. Protective effect of carrageenan against murine cytomegalovirus infection in mice //Antiviral. Chem. Chemother. 1993. Vol. 4, № 2. P. 353-360.

152. Hamasuna R., Eizuru Y., Minamishima Y. Inhibition by iota-carrageenan of the spread of murine cytomegalovirus from the peritoneal-cavity to the blood-plasma // J. Gen. Virol. 1994. Vol. 75, № 6. P. 111-116.

153. Girond S., Crance J.M., van Cuyck-Gandre H., Renaudet J., Deloince R. Antiviral activity of carrageenan on hepatitis A virus replication in cell culture // Res .Virol. 1991. Vol. 142. P. 261-270.

154. Carlucci M.J., Scolaro L.A., Noseda M.D., Cerezo A.S., Damonte E.B. Protective effect of natural carrageenan on genital herpes simplex virus infection in mice // Antiviral. Res. 2004. Vol. 64, № 2. P. 137-141.

155. Sano Y. Antiviral activity of alginate against infection by tobacco mosaic virus // Carbohyd. Polym. 1999. Vol. 38, № 5. P. 183-186.

156. Kolender A.A., Matulevicz M.C., Cerezo A.S. Structural analysis of antiviral sulfated alpha-D-(l-3)-linked mannans // Carbohydr. Res. 1995.Vol.273. P. 179185.

157. Carlucci M. J., Ciancia M., Matulewicz M. C., Cerezo A. S., Damonte E. B. Antherpetic activity and mode of action of natural carrageenans of diverse structural types//Antiviral. Res. 1999. Vol. 43, № 1. P. 93-102.

158. Kazuhiro Fujiki, Dong-Ho Shin, Miki Nakao, Tomoki Yano. Protective effect of k-carragenan against bacterial infection in carp Cyprinus carpio // J. Fac. Agr. Kyushu Univ. 1997. Vol. 42 , № 1-2. P. 113-119.

159. Mercier L., Lafitte C., Borderies G., Briand X., Esquerre-Tugaye M.-T., Fournier J. The algal polisaccharide carragenans can act as an elicitor of plant defence // New Phytologist. 2001. Vol.149, № 4. P. 43-51.

160. Hanazawa S., Ishikawa T., Yamaura K. Comparison of the adjuvant effect of antibody response of three types of carrageenan and cellular events in the induction of the effect // Int. J. Immunopharm. 1982. Vol. 4., № 2. P. 521-527.

161. Mancino D., Minucci M. Adjuvant effects of i, k and X carrageenan on antibody production in BALB/c mice // Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. Vol. 72, № 2. P. 359-361.

162. Mitchel M.E., Guiry M.D. Carrageenan: a local habitat or a name // J. Ethnopharmacol. 1983. Vol. 9, № 5. P. 347-351.

163. Quan P.C., Kolb J.P., Lspinats G. NK activity in carrgeenan-treated mice // Immunol. 1980. Vol. 40, № 2. P. 495-503.

164. Ogata M., Matsui T., Kita T., Shigematsu A. Carrageenan primes Leukocytes to enhance lipopolysaccharide-induced tumor necrosis factor alpha production // Infect. Immun. 1999. Vol. 67, № 7. P. 3284-3289.

165. Utsunomiya I., Nagai S., Oh-ishi S. Sequential appearance of IL-1 and IL-6 activities in rabbit platelets: inhibition by phospholipase A2 inhibitors // J. Immunol. 1991. Vol. 147. P. 1803-1809.

166. Tateda K., Irifune K., Tomono K., Hirakata Y., Matsumoto T., Kaku M., Yamaguchi K. Potential activity of carrageenan to enhance antibacterial host-defense system in mice // J. Infect. Chem. 1995. Vol. 1, № 6. P. 59-63.

167. Sugawara I., Ishizaka S., Molle G. Carrageenans, highly sulphated polysaccharides and macrophage-toxic agents: Newly found human T-lymphocyte activator // Immunobiol. 1982. Vol. 163, № 2. P. 527-538.

168. Lukic M.L., Vukmanovich S., Ramie Z., Mostarica-Stojkovic M. Carrageenan induces T-cell supressor activity in mice // Periodicum Biologorum. 1983. Vol. 85, № 1. Suppl 3. P. 41-43.

169. Brenan M., Parish C.R. Modification of lymphocyte migration by sulfated polysaccharide // Eur. J. Immunol. 1985. Vol. 16, № 2. P. 423-430.

170. Kolb J.-P., Quan P.C., Poupon M.-F., Desaymard C. Carrageenan stimulates population of mouse B cell mostly nonoverlapping with those stimulated with LPS or dextran sulfats // Cell. Immunol. 1981. Vol. 57, № 2. P. 348-360.

171. Evelegh M.J., Clark D.A., McCandless E.L. Carrageenan stimulates the release of dialyzable helper factors // Immunol. Lett. Vol. 5. P. 247-252.

172. Weiner M.L. Toxicological properties of carrageenan // Agents Action. 1991. Vol. 3, № 5. P. 46-52.

173. Houck J.C., Morris R.K., Lazaro E.J. Anticoagulant, lipemia clearing and other effects of anionic polysaccharides extracted from seawed // Proc. Soc. Exp. Med. Vol. 96. P. 528-530.

174. Food and Drug Administration, GRAS (Generally Recognized As Safe) Food Ingredients: carrageenan, PB-221, 1972a, P. 206.

175. Benitz K.-F., Golberg L., Couston F. Intestinal effects of carrageenans in the rhesus monkey (Macaca mulatto) I I Food Cosmet. Toxicol. 1973. Vol. 11, № 6. P. 565-575.

176. Abraham R., Golberg L. Kupffer cell response to degraded carrageenan // Toxicol. Appl. Pharm. 1972. Vol. 22, № 5. P. 282-286.

177. Rustia M., Shubik P., Patil K. Lifespan carcinogenicity tests with native carrageenan in rats and hamsters // Cancer Lett. 1980. Vol. 11, № 3. P. 1-10.

178. Collins T.F.X., Black T.N., Prew J.H. Long-term effects of calcium carrageenan in rats. I. Effects on reproduction // Food Cosmetic. Toxicol. 1977. Vol. 15, № 1. P.533-538.

179. Marcus S.N., Marcus A.J., Marcus R., Ewen S.W.B., Watt J. The pre-ulcerative phase of carrageenan-induced colonic ulceration in the guinea-pig // Int. J. Exp. Pathol. 1992. Vol.73, № 4. P.515-526.

180. Olsen P.S., Kirkegaard P., Poulsen S.S. The effect of ileotransversostomy on carrageenan-induced colitis in guinea pig // Scand. J. Gastroenterol. 1983. Vol.18, №6. P. 407-410.

181. Kitsukawa Y., Saito H., Suzuki Y., Kasanuki J., Tamura Y., Yoshida S. Effect of ingestion of eicosapentaenoic acid ethyl ester on carrageenan-induced colitis in guinea pigs // Gastroenterology. 1992. Vol. 102, № 1. P. 1859-1866.

182. Corpet D.E. Evaluation toxicologique des carraghenanes. V. Interactions entre les carraghenanes et la microflore digestive // Sci. Alim. 1984.Vol. 4, 2. P.367-373.

183. Taché S., Peiffer G., Millet A.-S., Corpet D.E. Carrageenan gel and aberrant crypt foci in the colon of conventional and human flora-associated rats // Nutr. Cancer 2000. Vol. 37, №4. P. 75-80.

184. WHO Food Additives series № 19, Toxicological evaluation of certain food-additives contaminations. Rome, March, 1984.

185. Davidson R.L. Handbook of water soluble gums; N.Y/: McCraw-Hill eds., 1980.

186. Guist G.G. Application for hydrocolloids in prepared doos // J. Appl. Phycol. 1990. Vol. 6, №4 P. 391-400.

187. Ситун H.B., Дедюхина В.П., Ермак И.М. Использование каррагинана в пищевой промышленности // Вестник ДВГАЭУ. 2000. № 3. С. 84-91.

188. Белова А.А. О каррагианах языком экономиста // Мясная индустрия. 1998. №4. С. 23.

189. Гурова Н.В., Попелло И.А., Сучков В.В., Митяева Е.В. Методические подходы к оценке гелеобразующих свойств каррагинанов // Мясная индустрия. 2000. № 8. С. 35-37.

190. Patil R.T., Speaker T.J. Water-based microspere delivery system for protein // J. ■ Pharm. Sci. 2000. Vol. 89. P. 9-15.

191. Garcia A.M., Chaly E.S. Preliminary spherical agglomerates of water soluble drug using natural polymer and cross-linking technique // J. Control. Release.1996. Vol. 40, №6. P. 179-186.

192. Винникова Jl.Г. Физико-химические аспекты взаимодействия блков с нерастворимыми полисахаридами // Хранение и переработка сельхозсырья.1997. № 12. С. 13.

193. Погожева А.В. Пищевые волокна в лечебно-профилактическом питании // Вопросы питания. 1998. № 1. С. 39-42.

194. Lahaye М., Kaeffer В. Seaweed dietary fibres: structure, physico-chemical and biological properties relevent to intestinal physiology// Sci. Aliment, 1997. Vol. 17, №6. P. 619-637.

195. Усов А.И., Рехтер M.A., Кочетков H.K. Полисахариды водорослей. III. Выделение и предварительное изучение ^.-полисахарида из Tichocarpus crinitus (Gmel.) Rupr. // Ж. общ. химии. 1969. Т. 39, № 4. С. 905-911.

196. Усов А.И., Рехтер М.А., Кочетков Н.К. Полисахариды водорослей. III. Изучение х-полисахарида из Tichocarpus crinitus (Gmel.) Rupr. // Ж. общ. химии. 1970. Т. 40, № 12. С. 2732-2737.

197. Яроцкий С.В., Шашков А.С., Усов А.И. Применение спектроскопии 13С-Я MP для агшиза структуры полисахаридов типа а-каррагинана // Биоорг. химия. 1978. Т. 4., №6. С. 745-751.

198. Кочетков Н.К., Усов А.И., Рехтер М.А. Полисахариды водорослей.УШ. Ацетолиз ^-полисахарида из Tichocarpus crinitus (Gmel.) Rupr. // Ж. Общ. химии. 1971. Т. 41, №5. С. 1160-1165. .

199. Вистлер P. JI. Методы химии углеводов / пер. с англ. под ред. Н.К. Кочеткова. М.: Мир, 1967.-261 с.

200. Vreeland V., Kloareg В. Cell wall biology in red algae: divide and conquer // J. Phycol. 2000. Vol. 36, № 5. P. 793-797.

201. Liu Q.Y., Ross N., Lanther P., Reith M. A gametophyte cell wall protein of the red alga Porphyra purpurea (Rhodophyta) contains four apparent polysaccharide-binding domains // J. Phycol. 1996. Vol. 32, № 6. P. 995-1003.

202. Grets M., Wu Y., Vreland V., Scott J. Iota carrageenan biogenesis in the red alga Aganthiella subulata is golgi-mediared // J. Phycol. 1990. Vol. 26, № 2. P. 14.

203. Lechat H., Amat M., Mazoyer J., Gallant D., Buleon A., Lahaye M. Cell wall composition of the carrageenophyte Kappaphycus alvarezii (Gigartinales, Rhodophyta) pertitioned by wet sieving// J. Apl. Phycol. 1997. Vol. 9, № 6. P. 565-572.

204. Lechat H., Amat M., Mazoyer J., Buleon A., Lahaye M. Structure and distribution of gluomannan and sulfated glucan in the cell wall of the red alga Kappaphycus alvarezii (Gigartinales, Rhodophyta) // J. Phycol. 2000. Vol. 36, № 5. P. 891-902.

205. Zablackis E., Vreeland V., Kloareg B. Isolation of protoplasts from Kappaphycus alvarezii var. tambalang (Rhodophyta) and secretion of iota-carrageenan fragments by cultured cells // J. Exp. Bot. 1993. Vol. 44, № 262. P. 1515-1522.

206. Stancioff D.J., Stenley N.F. Infrared and chemical studies on algal polysaccharides // Proc. Int. Seaweed Sym. 1967. Vol. 6. P. 596-609

207. Reen D.W., Santos G.A., Dumont L.E., Parent C.A., Stanley N.F., Stancioff D.J., Guisely K.B. P-carrageenan: isolation and characterization // Carbohyd. Polym. 1993. Vol. 22, № 6. P. 247-252.

208. Usov A.I., Sashkov A.S. Polysaccharides of algae. 34. Detection of iota-carrageenan in Phyllophora (Turn.) J. Ag. (Rhodophyta) using 13C-NMR spectroscopy // Bot. Mar. 1985. Vol. 28. P. 367-373.

209. Incoll L.D., Long S.P., Ashmore M.R., SI units in publicaion in plant scienc // Curr. Adv. Plant Sel. 1977. Vol. 28, № 8. P. 331-343.

210. Чербаджи И.И., Варфоломеева C.B., Некрасов Д.А. Сезонные изменения первичной продукции Анфельции тобучинской в проливе Старка Японского моря // Биология Моря. 1995. Т. 21, № 5. С. 307-314.

211. Dubois М., Gilles К.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. Colorimetric method for detrmination of sugar and related substances // Anal. Chem. 1956. Vol. 28, №3. P. 350-356.

212. Lowry O.H., Rosebrough N.L., farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol regent//J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193, № 7.P. 265-275.

213. Englyst H.N., Cummings J.H. Simplified method for the measurement of total non-starch polysaccarides by liquid chromatograph of constituent sugars as alditol acetates // Analyst. 1984. Vol. 109, № 6. P. 937-942.

214. Dodgson K.S., Price R.G. A note on the determination of the ester sulfate content of sulfated polysaccharides // Biochem J. 1962. Vol: 84. P. 106-110