Влияние гидролиза на биологическую активность ЦИС-дихлородиамминплатины (II) тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.01 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ ОК®Я И НЕОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ имени Н.С. КУРНАКОВА

На правах рукописи

ФОК Екатерина Иихайловна

УДК 616-006.04-085. ,277.3:546.92

ВЛИЯНИЕ ШРОЛИЗА НА БИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ЦИС-ДИХЛОРОДШгЖНПЛАТИНЫ (п)

02.00.01 - неорганическая химия 03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертация ка соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1990

Работа выполнена ь Институте общей я неорганической тати имени Н.С.Курнакова АН СССР.

Научный руководитель - доктор биологических ааук,

профессор В.Б.ИВАНОВ

Официальные оппоненты - доктор химических наук, профессор

М.И.ГКЛЬФМАН

доктор химических наук М.Н.ВАРГАФТИК

Ведущая организация - Химфак М1У

Защита диссертации состоятся " 1990 г. в

" /0 " часов на заоедаянл специализированного совета К 002.37.01 в Институте общей и неорганической хишш имени Н.С.Куряакова АН СССР по адресу: П7907, КП-1, Москва, Ленинский проспект, дом 31.

С диссертацией можно ознакомиться в ОХН БЕН АН СССР.

Автореферат разослан Ж" 1990 г.

. Ученый секретарь специализированного совета Ц а

кандидат химических наук ОрШмХим.^ И.Ф.АЛЕНЧИКОВА

ОКЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИК РАБОТЫ

Актуальпостт. хегн. Цтс-дгсхлородаимяпш'.атякаШ) - (ДШ1) открыла собоо новый класс ДНК-тропних аятлопухолешос препаратов -комплексов платимы. ДДП икос? пяроклй спектр действия, но Сольная токспчяост*. лимитирует ее применение в клинике. Ли Сило ус-

тановлено, что с ДНК взаимодействует пе самл ДДП, а продукты ее гидролиза. В организма Д2Д попадает в разные по составу средч, и условия гидролиза оказываются разпшш: если в крова (£С1~3 «? «= 1*10"%) гидролиз сально подавлен к бистро достигается равновесие, т^ гзнутрп меток ([С1~] г« 4-10—3М) равновесие устанавливается медленнее. В дитературо имеются экспериментальные данные, на основами которых С,та рассчитаны равновесные концентрации ДЩ в продуктов се гидролиза. Однако, в связи с квиетической инертность» коглплексоп Р1(П), равновесие гидролиза при 25°-35°С устанавливается за врегдя от нескольких: часов до месяцев, Коатому для ясиения биологической актизности различных комплексов, образующихся при гидролизе ДЩ1, кроме их равновесных концентраций необходимо знать заселение этих коицеатраций во времени. Хотя кинетика гидролиза ДДП ранее изучалась экспериментально, но расчетов изменений концентраций каждого из продуктов гидролиза ДДП во времени на било.

Попытки оценить на зсиеотшк антиопуходевуа активность продуктов гидролиза, не содержащих яог.ов СГ~ во внутренней координационной сфере металла, де удались из-за наличия С1~-конов в крови. Необходима была более простые биологические тест-объект«, например корни проростков кукурузы: их могшо инкубировать в растворах ДПД с разлш! рН и содержанием С1~-ионов (вплоть до бесхлоряд-иых растзсров), влияя исходным составом раствора па состав продуктов гидролиза ДДП.

Вагшо, что хомплексн платины с антяопухолевой активность»

избирательно подавляет деление как животных, так я бактериальных и растительных клеток (цитостатическое действие), что указывает на существование общих фундаментальных основ в механизме цнтоста-тического действия ДДП.

У животных концентрация комплексов Н. (П) в органах, накапливающих их, составляет лишь 1*10~€М. Гидролиз в столь разбавленных растворах ДДП не удается изучить физико-химическими методами.Кроме того, продукты гидролиза взаимодействует между собой и сосуществуют, поэтому выделить в растворе какие-либо из сих в чистой виде невозможно. Однако можно наблюдать биологический аффект, например, на корнях кукурузы после их инкубация в таких разбавленных растворах ДДП. Таким образом, только кинетический подход к изучению биологической активности Д£Щ в сочетании с данными расчета кинетики ее гидролиза позволяет оценить их индивидуальную активность. В литературе такого подхода описано не было.

Цель работы. В связи с вышеизложенным, в. работе поставлены следующие задачи:

I. Оценить изменение во времени концентраций различных комплексов Рип), образующихся из'ДВД в ходе гидролиза, при разных значениях рН и концентрации С1~-ионов исходя из литературных данных о константах скоростей и равновесий реакций гидролиза ДЩ1 с помощью расчета на ЭВМ.

' 2. Изучить экспериментально изменение биологической активности раствора ДЩ по мере протекания гидролиза и сопоставить его с данными расчета кинетики гидролиза ДДП.

3. Изучить биологическую активность растворов специально приготовленных продуктов гидролиза ДПД по второй ступени.

4. Изучить поглощение корнями комплексов РНП) из растворов ДДП и продуктов ее гидролиза и сопоставить его с биологическим действием этих растворов.

Научная новизна. Впервые оценена кинетика гидролиза ДЩ1 в разбавленных растворах Ц*10"3№ - I-IO^ii). Рассчитаны условия, при которых продукты гвдролиза ДЦП по первой ступени будут иметь максимум во времени яля ве иметь его и при которых в равновесии будут преобладать те или иные продукты гидролиза. Показано, что биологическая активность растворов ДШ изменяется со временем в результате гидролиза ДЩ1, причем различные продукты гидролиза отличаются по разным проявлениям биологической активности. Впервые показано, что заряженные продукты гидролиза поглощаются клетками лучше,,чем нейтральные комплексы. Установлено, что продукты гвдролиза ДЦД по второй ступени обладают как токсическим, так и ци-тостатическш действием, причем биологическая активность растворов этих продуктов мало меняется со временем. Показано, что продукты гццролиза поглощаются клетками существенно лучше, чем сама ДЦП, и при этом происходит концентрирование комплексов платины из раствора.

Практическая ценность работы. Данные расчета кинетики гидролиза ДПД могут быть использованы для исследования биологических систем, где равновесие гидролиза ДЦП устанавливается я течение нескольких:-суток, а также подбора условий применения ДШ. Разработанный в работе подход для определения относительной биологической активности продуктов гидролиза - комплексов ?t(П) мохно применить для изучения других биологически активных соединенна платины, в частности тех, которые могут быть использованы как противоопухолевые препараты.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано двое тезисов докладов, 3 статьи.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на конференции молодых ученых ИОНХ АН СССР {Москва, декабрь 1387 г.),

на совещании по яейтронно-активациояному анализу (Ташкент, кап 1987 г.).

Структура к объем работы. Диссертация состоит из сведения, грех глав, заключения, выводов, двух прялокеиий и списка литератур;* ( источник ). Изложена на страницах машинописного текста, в;слэчает таблиц и рисуяк

объекты и методы исследования

Растворы ДДЛ с исходной кояцеятрацяеа 3,3-10"% и 3,3-КГ^ готовили в дистиллированной воде (рН 6,5), растворе КОН (p!í 7,8) к растворе HCI (рН 4,25, [СГ]'=1-10~4М).

Для приготовления гидролпзовакной форьы ДЩ1 34 иг ДПД (или 54,7 иг цяс-^Pt{N \1q)^¿l) растворяли в 10 мл дистиллированной вода (рН 6,5), содержащей 38,5 ur AijNOg, с последующий отделениец осадка галогеяадов серобра. Реакцию вела в темнота при 20°С, перекашивал в течение 8-14 ч. Исследуете растворы готовшш, добавляя I мл (или 10 мл) фильтрата к 3,4. л дистиллированной воды, раствора HNOg (рН 4,0) ила КОК (рН 7,8),;Тпрл этом получались раствори с концентрацией комплексов РtСП) 3,3-Ю-6^. и 3,3-I0_5f.í соответственно.

Разбавленные до рабочей концентрации раствори хранили в темноте при 25°С а через определенные промежутки времени отбирала адшквотн для инкубации лЮрней проростков кухгурузы. НепссрздстЕен-до перед и после лякубацяя язкэряли рН исследуемого раствора лз инкубационной емкости (биологический рН-метр "Type 0P-2I2", Вза-грия).

Биологическим тост-объектом слушая корни проростков кукурузы. Семена кукурузы .проращивала двое суток в тешоте, при 25°С на фильтровальной бумаге, смоченной водопроводной водой. Корни 10

двтхдяевних проростков викубировадя в 250 мя исследуемого раствора (в течение 4 ч а 3,3'10~°?Л растворах я ли 24 мин в З.З'Ю-^:! растворах), затем прокнЕоля проточной водопроводной водой я выращивали з течение 3 сут в чаятках Петри на фильтровальной бумаге, скочешюй дистиллированной водой. Измеряли прирост главного коряя 8а каадне сутки з дящу учасгскх главного корня, ашштого боковыми корнями, через 72 ч , отмечали форму и цвет проростков л конце дорЕщяванпя. Контрольные корня явкубороваля в растворах, отлнчав-отхся от опытных только отсутствием ДШ. Вычисляли среднее по 10 корня!« для приростов за каздне сутки доращивадия и для участков главного корня, занятого боковыми корнями в опыте п в контроле. Проводилась статистическая обработка результатов. Каздый опит проводила 2-3 раза.

0<?г;ее количество платины, поглощенной корнями г другими объектами из nccxesyeianc растворов, определяли методом инструментального пейтроняо-активацяонного анализа (ИАА) яа реакторных нейтронах (ВОНЦ /A3 СССР). Для приготовления образцов у живых корней после их инкубации в исследуемом растворе отрезали по 25 ■•".! от конца или на участке 25-35 ш от конца отделяла кору от стола. Подученные отрезка высушивала прп 67°С я прессовали из них таблетка (d = 4 «я), которые затеи облучала нейтродама. вдасслро-занные 96%-вш этанолом корни готовила, вцдерзиваля отрезки корней 25 !Г1 от кончгка корня в трех сменах этанола несколько дней. Перед инкубацией этанол отмывали водой. После инкубации образцы для ЕАА аз них готовили как указано выше. Фильтровальную бумагу для НАА инкубировали совкестно о гшвыкя корнями, затем высушивали п прессовали таблетки дал анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I. Кинетика гидролиза цис-диххородиамшмдлаткшШ)

В литературе описаны лпаь расчеты равновесншс концентраций продуктов гидролиза ДДП, но на процессов установления этих концентраций. Однако константы скорости некоторых стадий гидролиза в литературе приводятся. На основе этих констант и сх.1 «а рассчитала . изменение во вреизпи концентраций ДДП и продуктов ео гидролиза при следующих исходных концентрациях: I) ДДП: 3,3'10~%, 3,3-Ю"5М, З.З-Ю"4«; 2) СГ-иопов: О, З.З-Ю^М, 3,3-КГ5«!, МО-4.«, З.З-Ю-3/.!; 3) рН: 4,25; 6,5; 7,0.

. Поскольку протонное равновесие устанавливается практически мгновенно - Ю^сиоль/л)^"^),концентрации продуктов гидролиза, связанных протонным равновесием, пропорциональны друг другу, т.е. У~Ц а '¿"У«^ (см. сх.1). Учитывая литературные данные о равново-сии гидролиза комплексов Pt (П), олигоиэризацлей продуктов гидролиза (пунктир на сх.1) когшо пренебречь.

Так как константы Кд, &2 Е ^з не Р11X11 известна, ш приняла Кд = К2. где Ко известка из литературы, а ^ п пришли равными константе скорости замещения С1"-ионов в ЦЕс-^НЧШд^СШдО^.Дла 1:р Кр Ко. К4 и К5 известно по нескольку значений, различающихся в пределах'одного порядка.

Для расчетов были-цриняты следущие значения констант: ■&2=2,5-Ю"5 с"1; ^^=3,3-Ю"5 С"1; К-^З.б • К)^М;К2=1,1- КГ^Ы; Кд^-Ю^М; К^.З-Ю""8^ 1^=1-Ю"4!,!.

На ЭВМ методом Эйлера решали систему уравнений, описывающих * материальный баланс, и кинетических уравнений, и вычисляли концентрации компонентов системы (см. сх.1) через определенные промежутки времени. '

Расчет показал, что за первый час разлагается 10? ДДП,

что совпадает с литературными данными. За первые 4 ч концентрация ДДП уменьшается одинаково во всех растворах (пропорционально [Д/Ш\ох ). а дальнейший характер кднетяки гидролиза определяется нсходяычд условяяш (£ДДП.}, ГС1-}, рН).

(N4,) С1

N /

а

(щ) а х

Гидполиз цнс-днхлородмммннпмтнны (Г/)

-сг

КГ

У

(Щ) (Я;0)

У

X

(N4,) (ОН)

11

"ОН,) он)

Л

(щ)- (нго)

v

(кщ (си)

х

(«Н,) (0,4) V/

Схема I. Кислый я основной гидролиз ДДП.

К|, Кд, Кд, Кд - константы равновесия; -\Г' ^з " коястаитн скорости реакций; X. У> 2.. и., v,w - текущие концентрации соответствующих комплексов РЦП).

. Для 3,3-10~% Д1Щ (все три значения рН) и 3,3-10"% ДВД (рН 6,5 а 7,8), без добавок СГ"-еояов расчет дает хороио шразюпний мзясшум кояцеяграцяя мо.чохлорвдпих форм, приходящихся на Э ч (рис. 1а). В равновесии в этом случае преобладают бесхлоридние формы.

При некотором подавления гидролиза повышение (ДЩ].,0Х (рис, I? ), [СГ~1)исх (рис. 18 ) и уменьшение рН приводят к ува-личенга равновесных концентраций ионохлоридвых форм, которые стремятся к максимальному значенга (для бесхлорддиых - к уменьпе-

ипа, соответственно), сам максимум наступает позае (череа 12-13 ч\ а затем исчезает вовсе. При дальнейшем подавления гидролиза (рнс. Iг) в равновесия начияавт преобладать продукты гидролиза ДДП по первой ступени независимо от способа подавления.

Чей выше рН, тем глуОно идет гидролиз, причем с яовшаеииеы 10ГЗ,СХ или 1ДИОясх эта' рН-зависиздость проявляется ярче.

Одинаковая форма кинетических кргших может задаваться разным сочетанием [Д1Щ]дсх . при одинаковом значении рН.

Итак, расчет показал, что характер изменения по времени концентраций отдельных продуктов гидролиза ДДП сильно зависит от исходных условий даке в простейшх рассчитанных нами системах. Состав биояогкческях^сред еще сложнее. Однако при оценке состояния ЯШ в организме, например в цитоплазме, где кдзки концентрации ДДП и С1~-иопсв и равновесие гидролиза ДДП устанавливается чо бистро, полезло зпать кинетику гидролиза ДЩ.

2. Биологическая активность растворов ДДЦ

Организация роста корня позволяет5, цо, его реакции различить вещества - цитостатщш, оолае или менее избирательно кнгкбврую-«ке деления клеток, к соединения общетоксгческим действием.

Растущая часть корм состоит яз зояы деления, где клетка интенсивно делятся, и золи растяжения, где они быстро растут, растягиваясь до окончательного размена. Скорость роста кория определяется ростом растягивающихся клзток. Чисто-токсические вещества сразу подавляют рост корней, угнетая растяжение клеток, шзиваэт резкие изгибы и потепления, но не останавливают деления клеток. Поатоцу беловые корни образуются даже тогда, когда главный корень погибает. Чисто-цитостатики, напротив, подавляют деление клеток раньше, чем замедляется их рост. Поэтому они сразу

о

Ряс Л. Кинетика годролиэа ДШ. По оси абсцисс - логарифм времени гидролиза, вваленного в часах; по оси ординат -процент концентрация продуктов гидролиза от оС:;ей концентрации комплексов Р-НП) в раствора; р!1 4,25.

а) [Ш]!!0Х- = 3,3-Ю-6«, [СГ] = 1-Ю"4?-!.

б) [ддпбисх* = 3,3-Ю"5М, [СГ] = 1-юЛ<. з) 0Ш1]ИСХ>' = 3,3-1(Г%, [СГ] = 3,3-10" М. г) (Ш1исх! = 3.3-10_4м. [СГ] » 1-Ю*4;.!.

I - ДШ; 2 - цнс-[Шгаз)2С1Н2011+; 3 - аис-СГЧ.(МН3)2С1(Ш)1 ; 4 - цис-[РЬ(»Щ3)2(Н?0)232+; 5 - цгс-[РЬ(Шз)2Н20(СН)]+; б - цпс-[Р10Шз)2(СП)21

шшкЗируют образовала боковых корней, при закладке которых едут быстрые деления клеток, а рост корая подавляют лига на 2-3 сут., когда из-за остановка деяевкя остается шло клеток, способных к растяжении. Прв постоянной токсической воздействия скорость роста снижена, но 3 сут. остается постоянной. После снятия краткого токсического воздействия скорость роста постепенно прябляхается к.староста роста контрольных кораеЛ. После тащульсяого цитоста-твческого воздействия, яаяротав, все вдет как к пря постошшоЗ шкубацяа - рост кораей подавляется на 2-3 сут., а боковые корки яе образуются. Возксниш раствори- с совместным цптостаткческна в токсическим действие?.;.

При сравнении ¿кологаческоЛ актюшости ксследоваяншс растворов мерой юс токсичности служила степень подавления роста корней за первые суткя носяе влкубацял, степень.лг изогнутости и потешеяяя; керой'цетостатяческого действия слугкло янглбярова-нкз роста корней в третьи сутки после инкубации п подавление образования боковых корней.

Поскольку гидролиз протечет кадденио (часы, сутки), ыогао было ожидать, что удастся заметить изменение биологической активности растворов ДЩ1, недолго пакублруя корни проростков кукурузы в растворах ДДП, видеряаняых разное время после их приготовления. Нами была поставлены опытно [Д1Щ]ЕСХ> = 3,3-1£Г% а 3,3-Ю-513, с рН 6,5 (дЕстклларов. вода), рН 7,8 (КОН), рН 4,25 (НИ. [СГЗ ~ 1-Л>-*и).

Биологическая активность растворов ДЕД действительно изменялась со времзиси: свекеприготовяешше раствори обладали меньшей токсической я цятоотаткческой активностью, чеы постоявшие (рис. 2). Вероятно, это объясняется шлой активностью яегидроли-зовашюй ДЦП, что согласуется с литературными данными. Раствори

,1Щ1 ш>ла rait цптостатаческое, так а токсическое дсйстеио на корни. Это мокло объяснить присутствием в растворе одновременно раз-ш1х продуктов гидролиза ДНИ. Цптостатзческсе действие проявляется з замедления роста корней со временен дородпванся (иапргсдер.рис.Й, кривая I висе криво!! П, кривая II вине кривой И) и в сильном подавления образования бокових корней (рис.2, яяяний график).

Рис.2. Изменение биологической активности раствора ДЩ в зависимости от времени. По оси ордияат:а-приросты

корней за первые -х-—, I; вторые - • -, П и

третьи-А-, Ш' сутки дорацизяния; 2 - длина .

участка главного корня, занятого боковыми корнями -о-после 4 ч инкубации в растворе ДПЛ, выдержанном разное время*. Ось абсцисс - вре?,м задержки раствора (стада логарифмическая)

Оказалось, что есть растворы, где некоторые показатели изменяются экстремально (рис.2). Из табл. 2, где приведены данные об экстремумах по всем показателям биологического действия для наших опытных растворов, видно, что лишь для 3,3*10 М раствора ДДП о рН 7,8 экстремум есть во всех показателях, а для 3,3-Ю-®М раствора ДДП с рН 4,25 их нот нигде". Итак, только для этих двух растворов наблюдается единообразная картина. В остальных случаях экстремумы есть либо не во всех показателях, либо они выражены неясно и плохо воспроизводятся. Расчеты показывают, что из всех на-пшх опытных растворов ДДП именно в 3,340 11 растворе с рН 7,8 гидролиз вдет глубже всего и достигается наименьшая равновесная концентрация продуктов гидролиза ДДП по первой ступени (монохло-ридках комплексов), из-га этого максимум концентрации монохлорид-ных форм выражен наиболее ярко. С другой стороны, в.3,3*10"% растворах ДДП с рН 4,25, *= 1-1(Г*и гидролиз больше всего подавлен, равновесная концентрация монохлориднше комплексов максимальна, а в их концентрациях по ходу гидролиза максимума нет. Итак* "крайние точки" в расчете и в эксперименте совпадают.

Можно было бы прздоологшть, что биологическая активность обусловлена в основном действием ыонохлорвдпроизводнше ДПД. Однако у растворов специально приготовленных продуктов гидролиза ДПД по П ступени (бесхлоридных комплексов) проявляется как цитостатя-ческая, так и токсическая активность, практически не зависящая от времени выдержки раствора (рис.3). Крона того, время достижения расчетного максимума монохлоридвроизводаш; составляет 9-13 ч (рисЛ), а для экспериментально определенных экстремумов - более 24 ч. (табл.1). Эти расхождения моано было бы объяснить, например, тем, что константы скорости, взятые из литературы, не соответствуют нашим условиям: они определялись для (ДЩГ| » (1-10)-Ю-3«,

jw = 3*I0-IM (по NaCI04) и комплексы PfcOl) могли реагировать с другими ионами, использовавшимися для создания иояяой силы. Кроме того, возиокно влияние самой ионной силы на скорость некоторых реакций, а мц работали с концентрациями веществ в тысячу раз меньшим, чем при определения констант скорости реакций гидролиза. Все это могло завысить значения найденных в таких условиях констант скоростей по сравнению с имеющими место в наших условиях я расчетный максимум мог приходиться поэтому на более ранние времена по сравнении со значениями, найденными в наших опытах.

Ю

-I 20

ГаШР. -100%

[Р%Ц=3,3-1СГМ

—-Х-УВ? -и л

х X

»♦_•

• • '"У

А,

20

ЗОмин

-5г~зг

1-г

7ПТТ-Т-

ОПЫТ . лппУ КОНТР. /о

-о—о-

,2. в ib, ;у VIT7 1Г

часы сагки

-т-

■a-Q-

Рис.З. Биологическая активность специально приготовленного раствора продуктов гидролиза ДЩ по второй ступени. Обозначения осей а кривых см. в подписи под рис. 2.

а

конц. да, ш юкскчность Щ5Т0СТАТККЛ

3,3-ю-6« приросты за I су г интенсивность некрозов : изгибов число погибши корней длина приросты участка за Ш сух с бок. корняш;

рН 7,8 + + + + + +

48ч 48ч-4сут. 48ч-4сут. 48ч 24-48ч 24-43ч

рН 6,5 + 48ч + 34-484 - + 48ч + 24-48ч + 0~12ч

рН 4,25 + + + . + - -

'сг^-ю^м 48ч 48ч 48ч 48ч

3,3-

рЯ 7,0 + 34-72ч + 48-76ч + 48-76ч погибших корней кет + 6-34ч 24ч

рн б,5 ; 48-51ч + 50-76ч + 24-48ч + 24-76« + 12~76ч 12-24ч

рК 4,25 Р1>1-Ю~4К — — погибших корней нет —

Таблица I. Проявление эк.стреыуыов в показателях токсического и цатостатического воздействия на корни различных растворов ДПД..Указано время между приготовлением раствора л иакубацлей, при котором соответствующее проявление бвологкпеской активности максимально. ■ * максимум действия есть; - максимума действия нет; + кгкекаум действа! вырааен слабо.

Однако существует другой опытный факт, показывающий, что дело обстоит сложнее. Установлено (см. табл.1), что максимум цвтоота-тяческого действия всегда наступает раньае (около 24 ч), чем токсического {48 ч я более). Таням образом, на опыте наблюдается два разновременных макспаогка действия и ах нельзя объяснить одним расчетным максимумом концентрации монохлоридиих форм. (Напомним, что расчетные маховдуш концентрации протоаированных и депротонированнцх давохлорвдпроизБОдднх одновременны в сю/у прак-

тяческп 'лглосвпиого установления протопного равновесия).

Итак, еяализаруя эту сорил опытов, иояио сделать- выводи:

1) баологкческое деЯствге растворов ДЩ проявляется кат: наложение токсглескоЗ и цитоматической активности;

2) биологическая. активность .растворов ДЕД изкзяяется со временем ах выдеркки, что монет бить связано о протекала«? со времена гздроляза ДЩ. Сака негадролазованиая ДЦД неактивна;

3) изану наличием максимума бвоактявностя я результатами расчета юшетякя гидролиза ДДП есть некоторая корреляция, закяэ-- ' чащаяся в следущен: а) Для раствора с [ДЩЗ]ЦСХ ~ 3.3-Ю-®?.!,

рН 7,8, расчет дает кэлболзе глубсквЗ гядроллз, в концентрации ¿юяохяорлрояэводпше ивхсаауя /ншбоясе ярко выразея - на опито ■только в этом растворе накеялум биологического действия проявдя-ется во всех свети показателях токсичности я цятостатячеекоЗ активности (табл.1); б) В"растворе с [ДДП]пох> г. 3,3-1СГ5М, pli 4,25,

[CI"1 W I-I0"""'!A по расчету гидролиз наюелее глубок, концентрация v.f»

коиозсло^Йролзводоих монотонно увеличивается' во врзмвяи до равао-взеш - на опыте только в зтом растворе все сесть показателей бкоактивпостл (табл.1) изменяются молотопао.

Однако однозначного соответствия какого-либо продукта гидролиза определенному биологическому действию найта г.а удается. Причиной двух разновременных опытных знстретлумоз могли бы быть продукта неучтенной нани химической реакции с разной биологической активностью. Видимо, это не олягомерц, так как в опытах с более концентрированными растворами ДЕЛ, где визе скорость оля-гомерязация, ггакешлум действия не проявляется более ярко, чем в рагбавлепяих. Креме того, актявяссть растворсп б-ос-слорядных ko?,s-пяексов PtCtl) ве зависят от вреиеая яя задергай. Следовательно, скорость олягсаорягацая елвэаоа вязка и не влияет на бяоактлвяоеть раствора.

Более правдоподобно другое объяснение: различные продукты гидролизе ДЩ1 могут проявлять и токсическую, и антимитотическую активность, но в разной степени. Тогда биологическая активность раствора будет зависеть от-'суммарного действия всех продуктов гидролиза, а вклад каздого будет пропорционален его удельной активности (токсач. или цитостат.) и концентрации в растворе во время инкубации. В этом случае'токсическая я анташтотическая активности раствора могут иметь два разновременных максимума, сдвинутых б более поздние времена относитально расчетного максимума концентрации монохлоридпроизводных.

Для растворов ДДИ или босхлоридных комплексов РЬ(П) с одинаковой исходной концентрацией, но при разных значениях рН мы установили, что: I) токсичность (согласно табл.1) либо одинакова, либо имеет ыаксЕмум прй рН 6,5; 2) цитостатическая активность растворов с рН 4,25 и 6,5 одинакова и больше, чем при рН 7,6.Впрочем, эти соотнос22£я, хотя отчетливо выражены, но незначительны по ветчине. Кроме того, возможно, что указанные соотношения не связаны именно с- кислотностью раствора, а определяются, например, ионной силой, влияющей как на химические реакции, так. и на проницаемость мембран клеток коркя.

Дальнейшие опыты показали, что в растворах бесхлоридных производных ДДД, а также во шогих раЬтворах ДД11, выдержанных более , 6-10 ч .несколько большее влияние на рост корней оказывает инкубация 4 ч. 3,3-10""%, чей 24 миа. 3,3-10_5М; для подавления образования боковых корней наблюдается обратная "картина (табл.2). Явление очень хорош воспроизводится, но его причина ве ясна. Можно лишь заключить, что бесхлоредные комплексы Р-кШ), полученные осаздением хлорида ионами Ад+, и продукты самопроизвольного гидролиза ДШ имеют одинаковые свойства,наяркм^р, описанные в табл.2.

рН д врем проявления эффекта раствор ЛДП раствор продуктов гидролиза ДдЛ

ока: большее действие нвает меяьпее действие оказш больнее действие тет меньшее действие

прирост за I сут. во всех растворах З.З-НГ6« 4 ч 3,3-10~5М 24 ¡1ия 3,3-Ю^М 4 ч 3,3-Ю"5М 24 генн

прирост за II сут. рН 1,25 и 6,5 рН 7,8, после Б ч Ецдерям раствора действие 3,3-10"% 4 ч одинаковое 3,3-Ю"5М 24 кия 3,3-Ю"бИ 4 ч 3,3-ПГ5Н 24 глин

прирост за Ш сут. рН 4,25 я 6,5 рН 7,0, после 6 ч видеряжа раствора действие 2,3-10-% 4 ч одинаковое ' 3,3-Ю"5!,? 24 мая 3,3-10"% А ч 3,3-Ю"5?« 24 кия

подавление боковых корней рН 4,25 рН 6,5, после 10 ч ввдеряяа раствора, рН 7,8, всо растворы действие 3,3-КГ5М 24 мин одинаковое 3,3-10"% 4 ч 3,3-ДГЬМ 24 мал 3,3-10"% 4 ч

Таблица 2. Сравнение действия различшк яякубаддЯ в растворах ДЩ и ее бесхлорпдянх производных.

3. Биологическое действие растворов специально подготовленных продуктов гидролиза ДДД по второй ступени (бесхлорэдных форм)

Литературные давние о наличия алтдопухолевоЛ активности у бесхлоридаах продуктов гидролиза ДШ противоречива.

В крови жзвсганнг продукта гидролиза ДДП, не содержав« исков СГ* во внутренней координационной сфере металла, реагируя? с С1"-яояамя, п опухоль атакуют уге не только бесхлоряднне комплексы р^(П). В корнях реакция бесхлоридных форм с долила С1~ (концентрация которшс па 1,5-2 порядка яксе, чем а плаз(.:о крови) вдет в тех же клетках, взаимодействие с ДНК которых ведет к остановке декякя. Так как замещение Н20 на СГ"-::ояы з проязводанх ДДП вдет медленно, то в реакции с /¿Ж глзток корня будут вступать в основ-

ном бесхлоридные продукта гидролиза ДШ.

Ми нашли, что растворы бссхлоридншс продуктов гидролиза МП обладают цитостатическойтоксической активностью, что было не-возмозшо показать в опытах яа животных или на культуре тканя. Действие стих растворов, по-видимому, мало зависят от времени юс выдержки. Цитостатическая активность растворов бесхлоридных коа;-плзксов РЫП) близка к активности вцдержаяянх растворов ДДП с :рН 4,25 и 6,5, и активности растворов ДШ с рН 7,8, выдерганных в течение I сут. Растворы ДДП с рН 7,8, выдержанные более 3-4 сут., •обладает меньшей цитостатической активностью, чем растворы специально приготовленных продуктов гидролиза ДВД, и этот факт пока непонятом. Токсическое действие этих растворов всегда оказывается равно идя чуть больне активности постоявших растворов ДШ. Значение рН раствора бесхлоридных производных ДЕД в интервале от 4 до 8 мало влияет яа его биологичеыгуя активность.

4. Поглощение комплексов Гй(П) из растворов ДДП.. с различным временем выдержвздяя

Методом НАД. ш исследовала ¡шкубвцаю корней в растворах ДЕД с концентрацией 3,3-10"'%, с рН 6,5, 7,8 (КОН), 4,25 (НС1,СС1"3=

л* А

~ 1-Ю М). Было установлено, что поглощение Р£(П) живыми корнями из растворов ДДП с разным временем задерживания возрастает со временем их выдержки. Это означает, что продукты гидролиза поглощается дучие самой ДДП. Монотонный рост поглощения по ходу гидролиза сохранялся и для тех растворов, где в изменения биологической активности наблюдался максимум (ср. рас.2,4). Несоответствие наибольшего биологического действия .максимальному поглощению Рк(П) говорит об отличии биохимических свойств продуктов гидролиза ДДП. На это указывает и то, что при увеличении поглощения ил-

ю

Ц пошц:,

згз -102 (50 (СЗ

527 -К

Iа

О-кт

1

СУТКИ

Г:;о.<5. Зависимость поглощения комплексов платим из растворов ДДП (ось ординат) от времени вздержки раствора. Кривая I — • — штат корнями; 2 —х— фиксированными спиртом корнями; 3-о-корой корня; 4 —Д— стелью

корпя; 5 —□-фильтровальной.бумагой. Использован

двойной логарифмический масштаб, [МП} = 3,3•10""%, рН 7,8. 'Вре:'я инкубации - 4 ч.

вина корнями комплексов Н-Ш) от 1-КГ^г до 5-10"^г на г сухого веса корня, биологическая активность не увеличивается. Кроме того, о ходом гидролиза увеличивается поглощение РКП) фиксированными спиртом корнями и фильтровальной бумагой - объектами, лелеянный цембрая. Значит, увеличение поглощения Р1-(П) связано с разными абсорбционными ила хшическяьш свойствами продуктов гидролиза ДЩ. Корни концентрируют в 10-15 раз комплексы Г1- (П) из выдержанных растворов ДДП. В основном комплексы остаются, видимо, в коре (нарузлей частя корня) - поглощение ею ?1- с ходом.гидролиза

растет, как и поглощение г.^вши корнями (ркс.З). Однако количество комплексов, достигающих внутренней части корня (стеля), пало зависит от времени задержки раствора ДЦП (риг> 3).

Корни больше всего Р^.<11) поглощают из растворов с рИ 4,25, где существенно преобладают положительно заряженные комплексы РШ1). Значит положительний заряд не является препятствием дай проникания когашзксов Р1-СП) б клетки, а возможно и способствует ему.

Итак, продукты гидролиза ДДП отличаются по способности накапливаться в живых и мертвых корнях, внутренней и наружной частях корня п по подвижности в них. Кроме того, не вое поглощенные корием продукты гидролиза ДПЛ оказывают биологическое действие.

вывода

1. Впервые исследована биологическая активность продуктов гидролиза цкс-р-ЧЛННд^С^'З - (ДДП) путем сопоставления изме-няюцихся во времени концентраций комплексов , получающихся при гвдролазе ДЕД, с биологической активностью раствора, а такте путем изучения биологической активности растворов специально приготовленных комплексов РПП) - продуктов гидролиза ДДП, не содержащих ионов С1~ в координационной сфере металла.

2. С использованием литературных данных по кинетике и равновесию гидролиза ДДП рассчитаны кривые изменения во времени концентраций шести, комплексов Р^. СП) - ДЕД и продуктов ее гидролиза при 25°С - температуре, при которой изучалась биологическая активность.

3. Токсической и антймитотячесной активность» обладает не. сама ЩШ, а возникающие при ее гидролизе комплексы РКП), причем разные комплексы отличаются как по антааитотической активности, так и по токсичности в по способности поглощаться клетка}« я пе- •

редапгаться взучрп тканей. Биологическая активность растворов ДШ изменяется со временем посла приготовления растяора в ззвиси'гоот.ч от величиям рН, концентрация ДПД и койцентрядаа ионов 01".

4. Раствори специально пряготовлешшх продуктов гидролиза ДШ по второй ступени цлс-рЧСШз^С^О)^2*. цис-[р{.(НН3)2Н2О(ОН0 + , цас-(Н(N 113)20 обладает как токсическим, так и алтикитотн-ческям действие«, близким по силе к действию раотвороз ДПД, зм-держшных длительное время поело их приготовления. Активность специально приготовленных растворов продуктов гидролиза ДЛД по второй ступени не меняется по море стояния раствора.

5. Токсическое « аятимятотическое действие раствора ДДП в кидай но:юнт вромопи определяется совокупным действием всех находящихся в растворе комплексов РЬ(II) - продуктов гидролиза ДДП пропорционально их концентрация п растворе с удельной активности.

С. Скорость поглехцейия коряямл комплексов Р1-(П) - проазвод-янх ДДП из растворов монотонно увеличивается со временем кх выдержки, что указывает яа преимущественное поглощение гидролизо-ванн1ис форм по сравнению с самой ДШ. При этой корни концентрируют комплексы РЬ(П) из раствора. Значительная часть продуктов гидролиза ДЕЛ остается в наружной часта корня. Не наблюдается прямой пропорциональности иеззду количеством поглощенной платины и с?е-пеньа проявления токсического яда антикатоткчеслого действия.

7. Установлено, что поломтельный заряд комплекса не является препятствием для проникновения ксгяьчексоз в клетки.

8.Найденная зависимость блолсгяческой активности ДЩ от степени ее гидролиза открцваег возможность подбора условчЗ для наиболее аффективного применения препарата ДДП яа основания данных по кинетике ее гидролиза.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Фок Е.М., Иванов В.Б. Биологическая активность различных про-

и

дуктов гидролиза цис-дихлородиамминплатины(11) // UT Всесоюзное Чугаевское совещание но химии комплексных соединений: Тезисы докладов - Красноярск, 1987, часть I, С.297.

2. Иванов Б.Б., Литинская Т.К., Фок Е.М., Бровцин З.К., Михайлов Г.11. Изучение поглощения цис-дихлородиамминплатияы(П) различными клетками с помощью ÏÏAA // У Всесоюзное совещание по активациошюму анализу и другим радиоаналитическим методам: Тезисы докладов - Ташкент, 1987, часть П, С.366.

3. Фок Е.М., Иванов В.Б. Зависимость от времени биологической активности растворов цис-дихлородиамммшлатины(П) и продуктов ее гидролиза // Докл. АН СССР. - 1988. - Т.301. -S3. -

С.757-760.

4. Иванов Б.Б., Литинская Т.К., Фок Е.М., Чельцов П.А., Бровцин В.К., Михайлов Г.П. Поглощение корнями проростков кукурузы цис-дихлородиаммияплатияы(П) и продуктов ее акватации и гидролиза // Докл. АН СССР. - 1988. - Т.303. - * I. - С.252-255;

5. Фок Е.М. Расчет кинетики гидролиза цис-дихлородиамминплати-ны(П) // Координационная химия. - 1990.

Т-10710 от 31,05.90.г.Форм,изд.60X84 1/16. Объем 1,5 п.л.З'ак.99/у.Тир.Ю0.