Влияние полиэлектролитов на транспорт доксорубицина через бислойную липидную мембрану тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

На правах рукописи

КИТАЕВА Марина Викторовна

ВЛИЯНИЕ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ НА ТРАНСПОРТ ДОКСОРУБИЦИНА ЧЕРЕЗ БИСЛОЙНУЮ ЛИПИДНУЮ МЕМБРАНУ

02.00.06 - высокомолекулярные соединения по химическим наукам

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА-2006

Работа выполнена на кафедре высокомолекулярных соединений Химического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Ярославов Александр Анатольевич кандидат химических наук Мелик-Нубаров Николай Сергеевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Литманович Андрей Аркадьевич доктор химических наук, профессор Гладилин Александр Кириллович

Ведущая организация:

Институт химической физики им,Н.Н.Семенова РАН

Защита состоится ШС/ЖР 200 Ь г. в /У часов на заседании

диссертационного совета Д 501.001.60 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские Горы, МГУ, д.1, стр.3, Химический факультет, Лабораторный корпус "А", кафедра высокомолекулярных соединений, ауд.501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета

МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан "/9й' ■ЖС&Я' 2006г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.х.н.

'ОМ-О,

Долгова А.А.

/Wl

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Контролируемая доставка лекарственных препаратов в пораженные клетки является одной из ключевых проблем современной фармакологии Известно, что эффективное использование в фармакологической практике накопленного к настоящему времени арсенала лекарств в значительной мере ограничивается побочными эффектами, вызываемыми лекарствами в организме. Использование подходов контролируемой доставки позволяет снижать неблагоприятные эффекты химиотерапевтических средств и увеличивать их биодоступность, усиливая тем самым фармакологическое действие лекарств

В течение последних 30 лет появилось множество работ, посвященных использованию синтетических и природных полиэлектролитов в качестве средств, способствующих контролируемой доставке биологически активных соединений. Показано, в частности, что комплексообразование лекарств с полиэлектролитами позволяет существенно улучшить их фармакологическое действие и увеличить время их циркуляции в кровотоке

Однако, несмотря на значительные успехи в этой области, ряд принципиальных вопросов требует более детального рассмотрения или остается вовсе неисследованным. Прежде всего, это касается кинетики и механизма транспорта лекарств через биологические мембраны в присутствии полиэлектролитов Для решения этой физико-химической задачи можно наряду с клетками использовать модельные системы, среди которых широкое распространение получили бислойныс липидные везикулы (липосомы)

Цель работы заключалась в изучении состава, строения и стабильности комплексов синтетических полиэлектролитов с протиопухолевым антибиотиком доксорубицином (Доке) и липосомами, а также влияния комплексообразования на транспорт Доке через липосомальную мембрану В работе исследованы

- формирование комплексов Доке с анионным полимером (полиакриловой кислотой, ПАК);

- взаимодействие комплексов ПАК-Докс с электронейтральными и отрицательно заряженными липосомами;

- адсорбция катионного полипептида (полилизина, ПЛ) на поверхности отрицательно заряженных липосом,

- кинетика и механизм мембранного транспорта Доке в присутствии полиэлектролитов

Научная новизна. В работе впервые исследовано комплексообразование Доке с ПАК и взаимодействие полученных комплексов с электронейтральными и отрицательно заряженными липосомами Показано, что включение Доке в комплекс с полианионом уменьшает скорость

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С.-Петербург

ОЭ гоо^актУ/(

транспорта лекарства через липосомальную мембрану. Напротив, адсорбция поликатиона на поверхности отрицательно заряженных липосом способствует ускорению мембранного транспорта Доке.

Практическая значимость работы. Полученные в работе результаты имеют принципиальное значение для понимания механизма взаимодействия синтетических полиэлектролитов и биологически активных комплексов на их основе с биологическими мембранами. В работе показано, что использование полиэлектрояитов позволяет в широких пределах манипулировать скоростью транспорта Доке через липидную мембрану. Это открывает новые возможности управления кинетикой захвата антибиотика в биологических системах. Предложенный подход может рассматриваться как инструмент для направленного изменения фармакологических свойств лекарственных веществ.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Международной конференции "Polymerwerkstoffe 2000", Галле, Германия (2000); Конференции студентов и аспирантов, Пущино, Россия (2001); Украинско-российском симпозиуме по высокомолекулярным соединениям, Донецк, Украина (2001); Международной конференции «Europolymer Congress», Стокгольм, Швеция (2003); Третьей всероссийской каргинской конференции «Полимеры-2004» Москва, Россия (2004); Пятом международном симпозиуме "Molecular mobility and order in polymer systems", Санкт-Петербург, Россия (2005).

Публикаиии. IIo материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Объем и структура диссертапии. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы из 186 ссылок и приложения. Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста, содержит 41 рисунок.

Во введения дано обоснование актуальности диссертационной работы и указаны ее цели и задачи.

Обзор литературы состоит из трех частей. В первой проанализированы имеющиеся в литературе данные об использовании полимеров в качестве компонентов лекарственных препаратов Во второй описан механизм взаимодействия полиэлектролитов с противоположно заряженными поверхностно активными веществами и красителями. Наконец, в третьей части обсуждены данные о влиянии полимеров на структуру и проницаемость биологических мембран

В экспериментальной части описаны объекты и методы исследования.

В работе были использованы ПАК с М„=5000 и ПЛ с М„=15700. Концентрации полиэлектролитов приведены в молях мономерных звеньев на литр раствора

Моноламеллярные липосомы получали из яичного лецитина (фосфатидилхолина, ФХ) или его смеси с кардиолипином ("КЛ) ультразвуковой обработкой водной суспензии липидов (малые липосомы диаметром около 100 нм) либо с использованием метода обращенных фаз (большие липосомы с диаметром около 600 нм) Для смены внешнего буфера (приготовления рН-градиентных липосом) использовали гель-проникаюшую хроматографию на сефарозе

1. Влияние полианионов на скорость транспорта доксорубицина через липидную мембрану

1.1. Комплексообразование полиакриловой кислоты с доксорубицином

Характеристическое значение рК карбоксильных групп ПАК равно 4.8; Доке (его структурная формула представлена на рис. 1) содержит первичную аминогруппу с рК=8.6 Формирование комплексов в системе ПАК-Докс было изучено при рН 7, когда молекулы лекарства и полимера несли противоположные по знаку заряды Добавление ПАК к раствору Доке сопровождалось уменьшением интенсивности флуоресценции Доке (рис 2) и сдвигом максимума в спектре поглощения Доке в красную область на 10 нм. Такие изменения указывали на формирование ассоциатов Доке на полимерной матрице за счет стэкинг-взаимодействий между молекулами антибиотика.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

5 1,ог

Н2М

Рис. 1 Структурная формула доксорубицина.

Рис 2 Зависимость интенсивности флуоресценции Доке от соотношения [ПАК]/[Докс]. [ЕЮХ]=50 цМ, буфер: 20 мМ НЕРЬв + 5 мМ ТРИС, рН 7; 25° С

Добавление низкомолекулярного электролита (ТМаСЛ) к раствору комплекса приводило к увеличению флуоресценции Доке, что свидетельствовало о появлении в системе свободного (не

ООО 005 010 0 15 020 0 25 030 035 0,40 [№С1], М

Рис. 3 Зависимость интенсивности флуоресценции Доке в смеси с полианионом от концентрации ШС1. ПАК (1), 11АК-6/6 (2), ПАК-12/6 (3) и ПАК-18/6 (4). [ Полианион]/[Докс]=3; буфер. 20 мМ НЕРЕЭ + 5 мМ ТРИС, рН 7; 25° С.

связанного с ПАК) антибиотика. Полная диссоциация комплекса достигалась при концентрации ЫаС1 равной 0,4 М (рис 3, кривая 1). Стабильность комплексов существенно зависела от

величины рН водного раствора. Максимальная устойчивость достигалась в интервале рН от 6 до 7. За пределами этого интервала начиналась диссоциация комплекса. Его полная диссоциация наблюдалась при рН<4 и рН>9. Наконец, разрушение сформированного комплекса можно было инициировать добавлением этанола.

Таким образом, стабилизация комплексов ПАК-Докс обеспечивалась электростатическими взаимодействиями катионных групп Доке с анионными группами ПАК, а также гидрофобными и стэкинг взаимодействиями между включенными в комплекс молекулами антибиотика.

По данным квазиупругого светорассеяния комплексообразование сопровождалось появлением частиц, размер которых мог достигать нескольких сотен нанометров. Так, при соотношении [ПАК]/[Докс] = 03-5 размер частиц составлял 600-900 нм.

Состав комплексов был определен с помощью метода ультрафильтрации. Растворы, содержащие ПАК и Доке в разных соотношениях, пропускали через фильтры с диаметром пор 5 нм Молекулы ПАК и Доке свободно проходили через такие фильтры, в то время как крупные

частицы комплекса фильтрами

удерживались Зависимости концентраций Доке и ПАК в прошедших через фильтры растворах от соотношения (р=[ЛАК]/[Докс] представлены на рис. 4. Видно, что по мере возрастания величины <р концентрация Доке в фильтратах линейно убывала и затем достигала своего предельно низкого значения (кривая 1). Связывание Доке в комплекс с ПАК завершалось при (р = ч>о. Параллельные измерения концентрации ПАК в фильтратах показали, что не связанная с Доке поликислота обнаруживается лишь при (р > сро (кривая 2). Из этих наблюдений следовало, что в избытке Доке с ним связывалась вся добавленная ПАК. При этом только часть

Рис 4. Зависимость концентрации не связанных в комплекс Доке (1) и ПАК (2) от соотношения [ПАКУ[Доке]. [Докс]=40 цМ; буфер 20 мМ НЕРЕЭ + 5 мМ ТРИС, рН 7,25° С.

молекул Доке связывалась с полианионом, формируя комплекс характеристического состава <ро с максимальным количеством ионных контактов. Очевидно, комплексообразование сопровождалось нейтрализацией зарядов макромолекул ПАК, что в свою очередь приводило к потере стабильности и агрегации частиц комплекса. Значение <ро для комплекса характеристического состава, определенное из данных рис.4, оказалось равным 1,6.

Выше отмечалось, что комплекс ПАК-Докс полностью диссоциировал на исходные компоненты при концентрации КаС1 равной 0,4 М. При физиологической концентрации соли ([ЫаС1]=0, 15 М) доля включенного в комплекс Доке составляла около 20% (рис. 4, кривая 1). Для повышения стабильности комплексов в водно-солевых растворах макромолекулы ПАК были химически модифицированы боковыми гидрофобными фрагментами- гексильными (ПАК-6/6), додецильными (ПАК-12/6) и октадецильными (ПАК-18/6). По данным ЯМР-спектроскопии степень модификации ПАК составила 6% для всех образцов полимеров. Гидрофобная модификация ПАК существенно увеличила устойчивость ее комплексов с Доке. Так, в растворах с физиологической ионной силой доля Доке, связанного с ПАК-6/6, ПАК-12/6 и ПАК-18/6, составила 29, 38 и 73%, соответственно (рис. 4, кривые 2-4).

1.2. Взаимодействие комплексов ПАК-Докс с малыми электронейтральными липосомами

Ранее бьио показано, что свободный Доке встраивается в липосомальную мембрану таким образом, что его часть, представленная системой конденсированных ароматических колец, погружается в гидрофобную часть яипидного бислоя, а первичная аминогруппа экспонирована в водный (водпо-солевой) раствор (С Неууга!^ е1 а1., 1998, Вюркуя. 7 75, 2368). Можно было ожидать, что если Доке, изначально включенный в комплекс с ПАК, будет встраиваться в липосомальную мембрану, то он будет располагаться в ней аналогичным способом Такое перераспределение, очевидно, должно сопровождаться нарушением стэкинг-взаимодействий между молекулами Доке и увеличением интенсивности флуоресценции раствора.

Типичная кинетическая кривая, описывающая изменение интенсивности флуоресценции Доке при добавлении комплексов ПАК-Докс к суспензии малых электронейтральных ФХ липосом, представлена на рис 5а Сразу после смешения компонентов интенсивность флуоресценции начинала возрастать и через несколько минут достигала своего максимального значения Конечные уровни флуоресценции, полученные после добавления к комплексу разных количеств липосом, представлены на рис 56 Возрастание концентрации липосом в системе приводило к заметному увеличению доли перешедшего в липосомальную мембрану Доке

Рис 5а. Кинетика возгорания флуоресценции Доке после добавления комплексов ПАК-Докс к суспензии ФХ липосом. Конц. ФХ = 4 мг/мл, [Докс]=50 цМ; [ПАК]=150цМ; буфер 20 мМ НЕРНв + 5 мМ ТРИС, рН 7; 25° С.

Рис. 56. Конечные уровни флуоресценции, достигнутый после добавления ФХ липосом к комплексу ПАК-Докс [Докс]=50 рМ, [ПАК]=150цМ; буфер: 20 мМ НЕРЕБ + 5 мМ ТРИС, рН 7; 25° С.

Что происходит с ПАК после перераспределения Доке: остается ли она связанной с Доке или высвобождается во внешний раствор? Ответ на этот вопрос был получен в ходе следующего эксперимента. Были приготовлены образцы с одной и той же концентрацией ПАК-Докс, но возрастающими концентрациями ФХ липосом. После достижения равновесия образцы были подвергнуты фильтрации через фильтры с диаметром пор 5 нм. Такие фильтры пропускали ПАК и Доке, но удерживали липосомы и частицы комплекса. Оказалось, что оба компонента комплекса -ПАК и Доке отсутствовали в фильтратах, то есть диссоциации комплексов при контакте с липосомальной мембраной не происходило Комбинацией методов квазиупругого светорассеяния и ультрафпльтрации было показано, что средний размер частиц в системе после добавления липосом к раствору комплекса ПАК-Докс уменьшался с 800 до 200 нм.

Таким образом, частицы комплекса ПАК-Докс при контакте с липосомами претерпевали существенные структурные перестройки. Молекулы Доке встраивались в липосомальную мембрану, сохраняя при этом ионные контакты с макромолекулами ПАК. Образующийся в результате тройной комплекс ПАК-Докс-липосома был стабилизирован гидрофобными взаимодействиями Доке с липидной мембраной и электростатическими взаимодействиями ПАК и Доке (рис 6)

Формирование тройного ПАК-Докс-липосома комплекса размер 100 нм

комплекс размер 600-900 мм

Рис. 6. Схема образования комплексов ПАК-Докс и их взаимодействия с липосомами

1.3. Взаимодействие комплексов ПАК-Докс с электронейтральными рН-градиентными лнносомами

Основной движущей силой внутриклеточного накопления Доке является его высокое

сродство к двуспиральной молекуле ДНК. В настоящей работе для моделирования мембранного транспорта Доке была использована система, в которой градиент химического потенциала между внутренним объемом липосом и внешней средой создавался за счет разницы в значениях рН внутреннего и внешнего растворов.

Доке является слабым основанием: рКа его аминогруппы равно 8.6. При рН=7 около 2,5 % молекул Доке находятся в депротонированной (незаряженной) форме Такие молекулы могут встраиваться во вешний монослой липосомальной мембраны за счет гидрофобных взаимодействий и затем переходить (диффундировать) на ее внутреннюю сторону. Накопление Доке внутри липосом приводит к смещению равновесия

Доке + Н* 15 ДоксН*

в сторону его незаряженной формы, обеспечивая тем самым проникновение большей части антибиотика через липосомальную мембрану. Внутренний объем липосом приблизительно в 1000 раз меньше общего объема системы Концентрирование молекул Доке внутри липосом сопровождается тушением его флуоресценции; кинетика этого процесса отражает кинетику мембранного транспорта антибиотика. Такая система моделирует ключевые стадии пассивного транспорта низкомолекулярных соединений через липидную мембрану по механизму растворения-диффузии.

Кинетика изменения интенсивности флуоресценции Доке после его добавления к суспензии

рН-градиентных ФХ липосом с буфером рН 4 внутри и рН 7 снаружи представлена на рис. 7 (кривая 1) Интенсивность флуоресценции

начинала уменьшаться практически сразу после смешения компонентов Плато на кинетической кривой соответствовало переходу внутрь липосом примерно 95% добавленного в систему антибиотика. При добавлении к липосомам комплекса ПАК-Докс характеристического состава Фо=1,6 форма кинетической кривой существенно изменялась (кривая 2). Начальный уровень флуоресценции был заметно ниже, чем для свободного Доке (ср кривые 1 и 2), что объяснялось тушением его флуоресценции при связывании с ПАК (подробно об этом говорилось выше) Помимо этого кинетика изменения интенсивности флуоресценции Доке, а значит и кинетика его мембранного транспорта, становилась двухфазной На первом этапе наблюдался рост флуоресценции, отражающий встраивание Доке в липосомальную мембрану и разрушение стэкинг-взаимодействий. На втором флуоресценция уменьшалась вследствие накопления Доке и концентрационного самотушения его флуоресценции внутри липосом.

Можно было ожидать, что мембранный транспорт Доке будет сопровождаться высвобождением поликислоты во внешний раствор Для проверки этого предположения были приготовлены образцы, содержащие рН-градиентные ФХ липосомы и комплекс ПАК-Докс с Фо=1,6. После завершения мембранного транспорта Доке образцы были подвергнуты фильтрованию через фильтры с диаметром пор 5 нм. В полученных фильтратах отсутствовал Доке, но было обнаружено около 70% ПАК, изначально связанной в комплекс с Доке. Оставшаяся ПАК (около 30% от исходной) задерживалась на фильтре, очевидно, будучи связанной в тройной комплекс ПАК-Докс-липосома. После завершения транспорта Доке средний размер частиц в системе был близок размеру исходных липосом.

Увеличение соотношения ф=[ПАК]/[Докс] до 3 и 10 сопровождалось возрастанием конечного уровня флуоресценции Доке, что свидетельствовало об уменьшении количества антибиотика, проникшего в липосомы (рис. 7, кривые 3 и 4). При этом двухфазная кинетика

ЦоксН* --" Н+ + Доке

0 0-|-•-1-.-1-.-1-■-1-■-1-■-1-■—г-

0 2 4 6 8 10 12 14

Рис 7 Кинетика изменения интенсивности флуоресценции

Доке после добавления рН-градиентных ФХ липосом к раствору Доке (1) и смеси ПАК/Докс (2-5). [Докс]=50 цМ, [ПАК]/[Докс]=1 6 (2), 3 (3), 10 (4) и 50 (5) Буфер- 20 мМ НЕРЕв + 5 мМ ТРИС, 0.3 М сахароза, рН 7, 25°С.

транспорта Доке сохранялась. Однако при <р=50 кинетика возвращалась к однофазной: в этих наблюдалось лишь монотонное возрастание флуоресценции Доке (кривая 5).

Для оценки доли проникшего в липосомы Доке были использованы следующие соображения Конечный уровень флуоресценции на кривой 1 (рис. 7), отражающей мембранный транспорт свободного Доке, равен 0,32 (в относительных единицах). Ранее было показано, что концентрирование Доке внутри липосом сопровождается полным тушением его флуоресценции (P.R Harrigan et al., 1993, Biochim Biophys Acta 1149, 329). В таком случае зарегистрированный в наших экспериментах конечный уровень флуоресценции логично было приписать Доке, оставшемуся во внешнем растворе. Его концентрацию мы определили, используя калибровочную зависимость интенсивности флуоресценции Доке от его концентрации в растворе. Такая оценка показала, что после завершения нашего эксперимента концентрация Доке во внешнем растворе составляла 4,5 цМ. Это означало, что в отсутствие ПАК доля проникшего в липосомы Доке была равна 9=45,5 цМ/50 цМ = 0,91.

Конечный уровень флуоресценции на кривой 2 (рис 7), описывающей мембранный транспорт Доке, включенного в комплекс с ПАК характеристического состава, равен 0,4 (o.e.). Выше отмечалось, что при этом около 70% ПАК переходило из комплекса в окружающий раствор. Очевидно, что при диссоциации комплекса должно было высвободится эквивалентное количество Доке, которое затем проникало через мембрану внутрь липосом Иными словами, в случае комплекса характеристического состава значение 0 было равно 0,7. Остаточная флуоресценция (0,4 о е.) могла быть приписана молекулам Доке, встроенным в мембрану и сохраняющим ионные контакты с карбоксильными группами ПАК.

Принимая во внимание нулевую интенсивность флуоресценции Доке, проникшего внутрь липосом, и полагая, что остаточная интенсивность флуоресценции линейно связана с долей Доке, «заякоренного» в липидной мембране благодаря взаимодействию с ПАК, легко определить чему равно значение 0 для разных соотношений [ПАК]/[Докс] Для расчетов значений 0 мы использовали данные, приведенные на рис 7. Результаты наших расчетов представлены на рис 8

Видно, что с увеличением соотношения [ПАК]/[Докс] с 0 до 50 значение 9 уменьшалось с 0,91 до 0,62. Следовательно, значительная часть Доке проникала через мембрану даже при больших избытках ПАК. В целом процесс можно было рассматривать как конкуренцию за взаимодействие с Доке между полиакрилат-анионами и кислым буферным раствором, разделенными

полупроницаемой липидной мембраной. Слабое влияние концентрации ПАК на количество проникшего в липомы Доке указывало на большее сродство антибиотика Доке к кислому содержимому липосом по сравнению с полиакрилат-анионом.

В то же время скорость проникновения Доке через липидную мембрану существенно зависела от соотношения [ПАК]/[Докс]. Двухстадийный характер кинетики и недостаток информации об элементарных стадиях затрудняли построение аналитической теории, описывающей транспорт Доке в присутствии полианиона. Поэтому для количественной оценки эффекта замедления транспорта Доке при его связывании с ПАК мы использовали соотношение пак/доксАдоке, где Тпдк/Докс и тдокс - времена, которые требуются для завершения транспорта Доке в присутствии и в отсутствии ПАК. Из зависимости, представленной на рис. 9, видно, что с ростом соотношения [ПАК]/[Докс] величина тпак/док/тдмю увеличивалась, то есть скорость мембранного транспорта Доке падала. Таким образом, изменяя концентрацию ПАК в системе можно было манипулировать скоростью проникновения Доке через липосомальную мембрану, при этом количество проникшего антибиотика практически не зависело от исходной концентрации ПАК в системе.

1 00-,

0,25

0 10 20 30 40 50

[ПАК]/[Докс]

Рис. 8. Зависимость доли Доке, проникшего через мембрану рН-градиентных ФХ липосом, от соотношения [ЛАК)/[Докс]. Условия см. в подписи к рис. 7.

Процессы, развивающиеся в системе после добавления частиц комплекса ПАК-Докс к рН-градиентным липосомам, могут быть описаны в такой последовательности. На первом этапе происходит встраивание Доке во внешний монослой липосомальной мембраны. Это приводит к реструктуризации частиц комплекса и уменьшению их размеров. На втором этапе часть молекул Доке мигрирует на внутреннюю сторону мембраны и затем распределяется в водном объеме липосомы. Оставшиеся на внешней части бислоя молекулы Доке удерживают на поверхности липосом некоторое количество цепей ПАК. Другая часть ПАК, утратившая ионный контакт с Доке, высвобождается в раствор События, происходящие в системе ПАК - Доке - рН-градиентные липосомы, схематически представлены на рис. 10.

Рис 10 Схематическое представление событий, происходящих в системе ПАК - Доке - рН-градиентные липосомы.

Известно, что мембрана живых клеток заряжена отрицательно. В наших экспериментах заряд на мембране рН-градиентных липосом создавался путем встраивания в ФХ бислой 5 мол.% анионного липида КЛ Оказалось, что после такой модификации двухстадийный характер кинетики мембранного транспорта Доке сохранялся. Вместе с тем для отрицательно заряженных липосом увеличивалось время накопления как свободного Доке, так и Доке, связанного в комплекс с ПАК. По-видимому, это было результатом взаимодействия катионных молекул Доке с анионными молекулами КЛ на внешней стороне мембраны, затруднявшего переход Доке на ее внутреннюю сторону.

[ПАК]/[Докс]

Рис. 9. Зависимость величины Тпак/доюЛдокс от соотношения [Г1АК]/[Докс]. Условия см в подписи к рис. 7.

1.4. Взаимодействие комплексов ПАК-Доке с рН-градиентными липосомами при физиологической концентрации соли и в присутствии белка

В этом разделе описаны результаты кинетических экспериментов по транспорту Доке через

мембрану рН-градиентных липосом в системе, моделирующей состав биологических жидкостей. 20 мМ НЕРЕЭ + 5 мМ ТРИС + 0.15 М N801 + 8мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), рН 7 Однако перед тем, как анализировать поведение Доке и его комплексов с ПАК в белково-солевом растворе, мы отдельно исследовали влияние соли и белка на мембранный транспорт Доке.

Выше отмечалось, что при физиологической концентрации соли ([МаС1]=0,15 М) доля Доке, включенного в комплекс с ПАК, составляла около 20%. Заметная диссоциация комплекса в этих условиях приводила к тому, что скорость захвата Доке рН-градиентными липосомами и количество проникшего в липосомы Доке приближались к соответствующим показателям для свободного антибиотика.

Возможное связывание БСА с ПАК и ее комплексами с Доке было исследовано с помощью метода нативного электрофореза Оказалось, что электрофоретическая подвижность белка не менялась после добавления в раствор ПАК и комплексов ПАК-Докс, то есть ни ПАК ни ее комплексы не проявляли сродства к БСА.

Как и следовало ожидать, в системе, содержащей оба компонента - №С1 и БСА, скорость транспорта и эффективность захвата Доке определялись присутствием в ней низкомолекулярной соли. Белок оказывал слабое влияние на проникновение Доке внутрь липосом

Стабильность комплексов ПАК-Докс в водно-солевых средах заметно повышалась при гидрофобной модификации полианиона (рис.3). Естественно было ожидать, что повышение стабильности комплексов будет отражаться и на кинетике мембранного транспорта Доке

причем наибольший (четырехкратный) эеффект достигался для комплексов Доке с ПАК-12/6 В то же время модификация ПАК октадецильными радикалами оказывала более слабый эффект на транспорт Доке. Возможно, причиной этого являлось большее сродство ПАК-18/6 к липидному бислою, чем к Доке, ослаблявшее пролонгирующее действие полианиона.

Рис. 11. Время завершения транспорта Доке

через мембрану рН-градиентных ФХ липосом. Доке (I), ПАК-Докс (2), (ПАК-6/6)-Докс (3), (ПАК-12/б)-Докс (4), (ПАК-18/6)-Докс (5). [Полианион]/[Докс]=3

1 2 3 4 5

На рис. 11 приведены значения •спак/Докс Для транспорта Доке, включенного в состав комплексов с гидрофобизованными производными ПАК, через мембрану рН-градиентных ФХ чиггосом В качестве контролей на том же рисунке приведены данные по скорости транспорта свободного Доке и Доке, связанного в комплекс с ПАК (столбцы 1 и 2) Видно, что введение боковых гидрофобных фрагментов в молекулу полианиона способствовало пролонгированию захвата антибиотика липосомами,

*

Скорое гь мембранного транспорта Доке, включенного в комплексы с гидрофобизованными производными ПАК, оказалась несколько ниже, чем скорость транспорта антибиотика, связанного в комплекс с ^модифицированной ПАК. Однако количество Доке, высвободившегося из комплексов и захваченного липосомами, было одинаковым для всех случаев. Таким образом, включение Доке в комплекс с гидрофобизованными ПАК позволило пролонгировагь захват антибиотика липосомами и при этом сохранить количес!во проникшею через мембрану лекарства.

2. Влияние поликатионов на скорость транспорта доксорубицина через липидную мембрану

Ранее было показано, что адсорбция катионного полипептида ПЛ на поверхности малых отрицательно заряженных липосом с диаметром около 100 нм ускоряет рН-индуцированный мембранный транспорт Доке (см., например, NOKozlova et al 2001, Biochim Biophys Acta 1514, 139). В настоящей работе мы поставили цель выяснить зависит ли кинетика мембранного транспорта Доке в присутствии поликагионов от размера липосом. Этот вопрос имеет первостепенное значение для понимания эффектов, вызываемых поликатионами в клеточных мембранах.

Большие отрицательно заряженные рН-градиентные липосомы с диаметром около 600 нм были получены из смеси ФХ и КЛ, взятых в соотношении 70/30 (мот/моль). Добавление к ним возрастающих количеств ПЛ сопровождалось резким увеличением размера частиц в системе, в конечном итоге это приводило к фазовому расслоению и выпадению осадка.

Агрегация липосом и тем более появление осадка осложняли проведение кинетических экспериментов и интерпретацию полученных результатов. Это заставило нас отказаться oi традиционных двухкомпонентных липосом и проанализировать возможные способы стабилизации их комплексов с поликатионами.

Из литературы известно, что повысить агрегативную устойчивость липосом можно путем встраивания в мембрану липидных молекул, полярные головки которых ковалентно модифицированы гидрофильными полимерами (олигомерами), такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ) или декстран. Опираясь на эти данные, мы приготовили большие липосомы (диаметром около 600 нм), содержащие - помимо фосфатидилхолина и кардиолипина в мольном соотношении 70/25 - 5 мол % фосфатидилэтаноамина, модифицированного ПЭГ (ФЭА-ПЭГ). Оказалось, что введение ФЭА-ПЭГ в состав липидной мембраны резко ослабило агрегацию больших липосом в присутствии ПЛ. Это позволило использовать стерически стабилизированные рН-традиентные ФХ/КЛ/ФЭА-ПЭГ липосомы для исследования кинетики мембранного транспорта Доке в присутствии полилизина

0,0 05 1.0 1 5 2.0 25 2±

3.5 4 0 4.5

Рис. 12 Относительное ускорение транспорта

Доке через мембрану ФХ/КЛ/ФЭА-ПЭГ =70/25/5 больших (1) и малых (2) липосом в присутствии ПЛ.

Добавление полилизина к таким липосомам вызывало заметное увеличение скорости мембранного транспорта Доке. Эффект ускорения, выраженный в виде отношения констант скоростей транспорта в присутствии и отсутствии ГШ (к/ко), зависел от соотношения зарядов, привносимых поликатионом и создаваемых в мембране включенным нее анионным КЛ Как следует из данных рис 12, максимальное (трехкратное) ускорение достигалось при 7.±~0,5 и затем не менялось вплоть до г±=4 (кривая 1). Для сравнения на том же рисунке представлена зависимость скорости транспорта Доке через мембрану малых липосом диаметром 100 нм того

же мольного состава: ФХ/КЛ/ФЭА-ПЭГ=70/25/5 (кривая 2). В этом случае также наблюдался эффект ускорения транспорта Доке с выходом на плато при 2±=0,5. Однако прирост скорости составлял всего 30% против 200% в случае больших липосом (ср. кривые 1 и 2).

Для объяснения возможных причин различного влияния ПЛ на проницаемость малых и больших липосом, мы воспользовались ранее опубликованными данными по адсорбции ПЛ на поверхности отрицательно заряженных липосом разного размера (О Е Кученкова и др 1999, Доклады Акад Наук 369, 778-780) Взаимодействие ПЛ с малыми липосомами бьио обратимо поликатион полностью удалялся с липосомальной мембраны при повышении концентрации соли или добавлении избытка полианиона Напротив, ни соль ни полианион не могли удалить ПЛ с поверхности больших липосом. Более того, образование комплекса ПЛ большими липосомами вызывало резкое повышение проницаемости липосомальной мембраны по отношению к низкомолекулярным солям По мнению авторов цитируемой статьи увеличение размера липосом приводило к повышению податливости (эластичности) мембраны, в результате чего становилось возможным встраивание фрагментов ПЛ внутрь липидного бислоя.

Аналогичные соображения можно высказать и в отношении поведения ПЛ на поверхности малых и больших стерически стабилизированных липосом. Связывание ПЛ с большими рН-градиентными ФХ/КЛ/ФЭА-ПЭГ липосомами также могло сопровождаться встраиванием более или менее протяженных фрагментов поликатиона в липосомальную мембрану и появлением дефектов в ней, способствующих дополнительному ускорению мембранного транспорта Доке. В обоих случаях - для малых и больших липосом - максимум скорости транспорта достигался при 2±=0,5. Этот результат, по-видимому, означал что (1) и в малых и в больших ФХ/КЛ/ФЭА-ПЭГ липосомах молекулы КЛ равномерно распределялись между обеими сторонами липосомальной

мембраны и С2) максимум скорости транспорт наблюдался при нейтрализации зарядов всех КЛ молекул, расположенных на внешней стороне мембраны (половины от общего количества).

Другое важное наблюдение состояло в следующем. Мы обнаружили, что скорость транспорта Доке через мембрану стерически стабилизированных ФХ/КЛ/ФЭА-ПЭГ (70/25/5) липосом почти втрое ниже скорости его проникновения через мембрану ФХ/КЛ (70/30) (A A.Yaroslavov et.al 2003, Biochim Biophys Acta 1611, 44). Заметное увеличение проницаемости липидной мембраны в комплексе с поликатионами обычно связывают с развитием индуцированной поликатионами латеральной сегрегации и формированием кластеров отрицательно заряженных липидов во внешнем слое мембраны. В таком случае полученный нами результат может указыват ь на блокирование или существенное торможение процесса латеральной сегрегации в мембране, содержащей липиды с объемными гидрофильными заместителями в области полярных головок.

выводы

1. Связывание Доке с макромолекулами ПАК приводит в образованию комплекса характеристического состава [ПАК]:[Докс]=1,6. Размер частиц комплекса достигает нескольких сотен нанометров Стабилизация комплексов обеспечивается электростатическими взаимодействиями катионных групп Доке с анионными группами ПАК, а также гидрофобными и стэкинг-взаимодействиями между включенными в комплекс молекулами Доке.

2 Взаимодействие комплекса ПАК-Докс с малыми электронейтральными ФХ липосомами (диаметр около 100 нм) сопровождается разрушением межмолекулярных контактов Докс-Докс и встраиванием высвободившегося Доке во внешний слой липосомальной мембраны. При этом ионные контакты молекул Доке со звеньями ПАК сохраняются В результате этих структурных перестроек в системе формируются тройные комплексы ПАК-Доке-липосома.

3. При добавлении комплекса ПАК-Докс к суспензии электронейтральных рН-градиентных липосом (с буфером рН 4 внутри и рН 7 снаружи) наблюдается проникновение молекул Доке через липосомальную мембрану Скорость мембранного транспорта Доке уменьшается по мере увеличения концентрации ПАК в системе

4. Модификация молекул ПАК боковыми гидрофобными радикалами повышает стабильность ее комплексов с Доке в водно-солевых средах и приводит к дополнительному замедлению скорости мембранного транспорта Доке. Включенный в такие комплексы Доке способен проникать через липосомальную мембрану при физиологической ионной силе раствора и в присутствии значительных избытков белка.

5 Скорость транспорта Доке через отрицательно заряженную мембрану увеличивается при адсорбции на ней катионного полипептида ПЛ и достигает максимума в области полной нейтрализации зарядов мембраны адсорбированным поликатионом Эффект ускорения становится более выраженным при переходе от малых липосом к большим с диаметром около 600 нм

6. Таким образом, использование полиэлектролитов позволяет в широких пределах манипулировать скоростью транспорта Доке через липидную мембрану. Это открывает новые возможности управления кинетикой захвата антибиотика в биологических системах. Предложенный подход может рассматриваться как инструмент для направленного изменения фармакологических свойств лекарственных веществ.

Основные результаты диссертационной работы М.В.Китаевой изложены в следующих публикациях:

1 N S Mehk-Nubarov OOKrylova, N О Kozlova, IВ Okuneva, TVDemma, MV Kitaeva. A A Yaroslavov and F M Menger "Effect of water-soluble synthetic polymers on the permeability of liposome membranes", International Conference "Polymerwerkstoffe 2000", Halle/Saale, Germany, September, 2000, Tagungsband, p, 508.

2. Kumaeea MB «Комплексы доксорубицина с полиакриловой кислотой и их влияние на проникновение доксорубицина через липидный бислой» Тезисы конференции студентов и аспирантов, г Пущино, июнь 2001, стр. 25

3 MB Китаева, Ю К Валеева «Комплексообразование доксорубицина с полиалионами и ei о влияние на проникновение антибиотика через липидную мембрану» Тезисы докладов Украинско-Российского Симпозиума по высокомолекулярным соединениям Донецк, октябрь 2001, стр 93.

4 F М Menger, VA Seredyuk, MV Kitaeva, A A Yaroslavov, and N S Mehk-Nubarov "Migration of Poly-L-lysine through a Lipid Bilayer", J Am. Chem. Soc. 2003, 125, 2846-2847.

5 M V Kitaeva. N S Melik-Nuharov, A A Yaroslavov "Formation of electrostatic complex of anticancer antibiotic doxorubicin with polyacrylic acid and its interaction with lipid membrane" Europolymer Congress, Stockholm, Sweden, June 2003, Abstracts

6 MB Kumaeea, HС Мелик-Нубаров, А А Ярославов «Поведение комплексов доксорубицина и полиакриловой кислоты в присутствии модельных липидных мембран» Тезисы Третьей Всероссийской Каргипской Конференции «Полимеры-2004» Москва, январь 2004, стр 289

7 М V Kitaeva. N S Mehk-Nubarov, F М Menger, and A A Yaroslavov "Doxorubicin-Poly(acrylic acid) Complexes. Interaction with Liposomes", Langmuir 2004, 20,6575-6579.

8 M V Kitaeva. N S Melik-Nubarov, F M Menger, and A A Yaroslavov "Membrane Transport of a Polyacid-Ticd Doxorubicin", Langmuir 2004, 20, 6796-6799

9 MB Kumaeea, HС Мелик-Нубаров, А А Ярославов «Мембранный транспорт доксорубицина, включенного в состав комплексов с гидрофобизованными полианионами», Биологические мембраны, 2005, том 22, №2, с. 123-130.

10. М V Kitaeva. F М Menger, VA Seredyuk, A A Yaroslavov, and N S Melik-Nubarov "Migration of Poly-L-lysine through a Lipid Bilayer" 5th International Symposium "Molecular Mobility and Order in Polymer Systems" Saint Petersburg, June 2005, p.148

Дюб/? /Ш!

1 2 0 2 1

Принято к исполнению 12/05/2006 Заказ №341

Исполнено 15/05/2006 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 (495) 747-64-70 www.autoreferat.ru

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Использование полимеров в качестве компонентов лекарственных препаратов.

2.1.1. Синтетические полимеры как наполнители и материалы для создания препаратов пролонгированного действия.

2.1.1.1. Иммобилизация лекарств на полимерных носителях.

2.1.1.2. Получение полиэлектролитных нанокапсул.

2.1.1.3. Полимерные липосомы.

2.1.2. Полимеры в конструкциях для направленной доставки лекарств.

2.1.3. Полимерные конструкции для направленной доставки доксорубицина.

2.1.4. Избирательность, достигаемая введением между лекарством и носителем лабильной развязки, чувствительной к действию определенных протеаз.

2.1.5. Полимеры как биологически активные вещества. Влияние полимеров на клеточные функции.

2.1.5.1. Противоопухолевая активность сополимеров на основе малеинового ангидрида.

2.1.5.2. Блок-сополимеры алкиленоксидов как вещества, влияющие на проницаемость биологических мембран.

2.2. Взаимодействие полиэлектролитов с противоположно заряженными соединениями.

2.2.1. Комплексы полиэлектролит-ПАВ.

2.2.1.1. Движущие силы комплексообразования полиэлектролитов и ПАВ.

2.2.1.2. Растворимость комплексов полиэлектролит-ПАВ.

2.2.1.3. Ассоциация молекул ПАВ на полимерной матрице.

2.2.1.4. Образование комплексов полиэлектролит-ПАВ в присутствии низкомолекулярного электролита.

2.2.1.5. Влияние гидрофобности полимера на устойчивость комплексов полиэлектролит-ПАВ.

2.2.2. Комплексы полиэлектролитов с противоположно заряженными красителями.

2.3. Влияние полимеров на структуру и проницаемость мембран.

2.3.1. Проницаемость биологических мембран.

2.3.2. Факторы, влияющие па проницаемость липидного бислоя.

2.3.3. Взаимодействие полианионов с липосомальными мембранами.

2.3.4. Взаимодействие поликатионов с отрицательно заряженными липосомами.

2.3.4.1. Изменение температуры фазового перехода.

2.3.4.2. Встраивание поликатионов в липидный бислой.

2.3.4.3. Изменение проницаемости липидного бислоя.

2.3.4.4. Латеральная сегрегация в липидном бислое.

2.3.4.5. Индуцированный поликатионом флип-флоп.

2.3.4.6. Агрегация липосом.

2.3.4.7. Слияние липосом.

2.3.4.8. Разрушение липосом.

3. ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ.

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

• МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4.1. Материалы.

4.2. Методы.

4.2.1. Спектральные методы.

4.2.2. Определение концентрации Доке в растворе.

4.2.3. Определение концентрации ПАК в растворе.

4.2.4. Определение степени ионизации ПАК в зависимости отрН.

4.2.5. Изучение комплексообразования Доке и ПАК методом центрифугирования.

4.2.6. Комплексообразование Доке с полиакриловой кислотой в присутствии низкомолекулярной соли.

4.2.7. Определение количества связанного с ПАК Доке в зависимости от рН раствора.

4.2.8. Определение количества несвязанных компонентов комплекса ПАК-Докс методом ультрафильтрации.

4.2.9. Получение малых моноламеллярных липосом.

4.2.9.1. Получение малых безградиентных липосом.

4.2.9.2. Получение малых градиентных липосом.

4.2.10. Метод резонансного переноса энергии.

4.2.11. Изучение взаимодействия комплексов ПАК-Докс с липосомальной мембраной методом ультрафильтрации.

4.2.12. Исследование кинетики проникновения доксорубицина через липосомальную мембрану. ф 4.2.13. Модификация полиакриловой кислоты алифатическими спиртами.

4.2.14. Определение критической концентрации мицеллообразования растворов этерифицированных полиакриловых кислот.

4.2.15. Определение степени модификации ПАК алифатическими спиртами.

4.2.16. Электрофорез в полиакриламидном геле.

4.2.17. Получение больших моноламеллярных липосом.

5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

5.1. Влияние полианионов на скорость транспорта доксорубицина через липидную мембрану.

5.1.1. Комплексообразование полиакриловой кислоты с доксорубицином.

5.1.1.1. Условия формирования комплексов.

5.1.1.2. Определение состава комплекса.

5.1.1.3. Устойчивость комплексов ПАК-Докс.

5.1.1.4. Модификация полиакриловой кислоты алифатическими спиртами.

5.1.2. Взаимодействие комплексов ПАК-Докс с малыми электронейтралы 1ыми липосомами.

5.1.2.1. Образование тройных комплексов «ПАК-Докс-Мембрана».

5.1.2.2. Изменение структуры комплексов при их взаимодействии с мембранами малых липосом.

5.1.2.3. Влияние комплексов на проницаемость липосомальных мембран по отношению к малым ионам.

5.1.2.4. Изменение состава комплексов ПАК-Докс при их взаимодействии с рН-градиентными липосомами.

5.1.2.5. Исследование скорости мембранного транспорта доксорубицииа, включенного в состав комплексов с гидрофобиыми полианионами.

5.1.2.6. Комплексообразоваиия ПАК-Докс в присутствии БСА.

5.1.2.7. Взаимодействие комплексов ПАК-Докс с отрицательно заряженными рН-градиентными липосомами при физиологической ионной силе и в присутствии белка ф 5.2. Влияние поликатионов на проникновение доксорубицина через липидный бислой.

5.2.1. Влияние полилизина на проницаемость мембран больших отрицательно заряженных липосом.

6. ВЫВОДЫ.

Контролируемая доставка лекарственных препаратов в пораженные клетки является одной из ключевых проблем современной фармакологии. Известно, что эффективное использование в фармакологической практике накопленного к настоящему времени арсенала лекарственных соединений в значительной мере ограничивается побочными эффектами, вызываемыми лекарственными соединениями в организме [1-2]. Использование подходов контролируемой доставки позволяет снижать неблагоприятные эффекты химиотерапевтических средств и увеличивать их биодоступность, благодаря чему усиливается фармакологическое действие лекарств [3].

В течение последних 30 лет появилось множество работ, посвященных использованию синтетических и природных полиэлектролитов в качестве средств, способствующих контролируемой доставке биологически активных соединений. Показано, что комплексообразование лекарств с полиэлектролитами позволяет существенно улучшать их фармакологическое действие и увеличить время их циркуляции в кровотоке.

Доксорубицин (синоним - адриамицин) является одним из наиболее широко используемым противоопухолевым антибиотиком, относящимся к классу антрациклинов [4]. Его противоопухолевый эффект обусловлен встраиванием в двойную спираль ДНК, что приводит к образованию двухцепочечных разрывов в молекулах ДНК и гибели клетки. Доксорубицин представляет собой катионную молекулу, которая, помимо ДНК, способна взаимодействовать с другими компонентами клетки. Поэтому изменение проницаемости липидной мембраны по отношению к доксорубицину представляет собой важную с практической точки зрения задачу. Для решения этой задачи предложено использовать синтетические полимеры, способные возмущать биологические мембраны, увеличивая их проницаемость по отношению к доксорубицину [4-5].

С другой стороны, доксорубицин способен накапливаться не только в пораженных клетках, но и в других клетках организма, поэтому значительные усилия направлены на разработку подходов, позволяющих увеличить избирательность действия антибиотика и увеличить время его циркуляции в кровотоке (биодоступность). Один из таких подходов состоит в получении электростатических комплексов доксорубицина с полианионами. [6]

Несмотря на значительные успехи в этой области, ряд вопросов остается неисследованным. В частности неизвестно, способны ли комплексы полианионов с доксорубицином взаимодействовать с липидными мембранами? Неисследованным также остается вопрос о влиянии размеров липидных везикул на характер их взаимодествия с полиэлектролитами.

В настоящей работе мы исследовали влияние полиэлектролитов на способность доксорубицина проникать через мембраны липидных бислойных везикул (липосом). В первой части работы было исследовано влияние полианионов на скорость проникновения доксорубицина через липосомальные мембраны, и изучены перестройки в составе комплексов, происходящие при их взаимодействии с липосомами. Во второй части работы было исследовано влияние катионного полипептида полилизина на проникновение доксорубицина через липосомальные мембраны.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

выводы

Связывание Доке с макромолекулами ПАК приводит в образованию комплекса характеристического состава [ПАК]:[Докс]=1,6. Размер частиц комплекса достигает нескольких сотен нанометров. Стабилизация комплексов обеспечивается электростатическими взаимодействиями катионных групп Доке с анионными группами ПАК, а также гидрофобными и стэкинг-взаимодействиями между включенными в комплекс молекулами Доке.

Взаимодействие комплекса ПАК-Докс с малыми электронейтральными ФХ липосомами (диаметр около 100 нм) сопровождается разрушением межмолекулярных контактов Докс-Докс и встраиванием высвободившегося Доке во внешний слой липосомальной мембраны. При этом ионные контакты молекул Доке со звеньями ПАК сохраняются. В результате этих структурных перестроек в системе формируются тройные комплексы ПАК-Докс-липосома. При добавлении комплекса ПАК-Докс к суспензии электронейтральных рН-градиентных липосом (с буфером рН 4 внутри и рН 7 снаружи) наблюдается проникновение молекул Доке через липосомальную мембрану. Скорость мембранного транспорта Доке уменьшается по мере увеличения концентрации ПАК в системе.

Модификация молекул ПАК боковыми гидрофобными радикалами повышает стабильность ее комплексов с Доке в водно-солевых средах и приводит к дополнительному замедлению скорости мембранного транспорта Доке. Включенный в такие комплексы Доке способен проникать через липосомальную мембрану при физиологической ионной силе раствора и в присутствии значительных избытков белка.

Скорость транспорта Доке через отрицательно заряженную мембрану увеличивается при адсорбции на ней катионного полипептида ПЛ и достигает максимума в области полной нейтрализации зарядов мембраны адсорбированным поликатионом Эффект ускорения становится более выраженным при переходе от малых липосом к большим с диаметром около 600 нм.

Таким образом, использование полиэлектролитов позволяет в широких пределах манипулировать скоростью транспорта Доке через липидную мембрану. Это открывает новые возможности управления кинетикой захвата антибиотика в биологических системах. Предложенный подход может рассматриваться как инструмент для направленного изменения фармакологических свойств лекарственных веществ.

1. Suzuki Н., Nakai D., Seita Т. and Sugiyama Y. (1996) Design of a drug delivery system for targeting based on pharmacokinetic consideration., Adv. Drug Del. Rev. 19(3), 335357.

2. Kabanov A.V., Okano T. (2003) Challenges in polymer therapeutics: state of the art and prospects of polymer drugs., Adv. Exp. Med. Biol. 519,1-27.

3. Torchilin V.P. (2001) Structure and design of polymeric surfactant-based drug delivery systems. J. Control. Release 73(2-3), 137-172.

4. Melik-Nubarov N.S., Krylova O.O. (2005) The control of membrane properties by synthetic polymers., Advances in Planar В (layers and Liposomes 2(5), 122-166.

5. Kozlova N.O., Bruskovskaya I.B., Okuneva I.B., Melik-Nubarov N.S., Yaroslavov A.A., Kabanov V.A., Menger F.M. (2001) Interaction of a cationic polymer with negatively charged proteoliposomes., Biochim. Biophys. Acta 1514 (1), 139-151.

6. Bromberg L, Alakhov V. (2003) Effects of polyether-modified poly(acrylic acid) microgels on doxorubicin transport in human intestinal epithelial Caco-2 cell layers., J. Control. Release. 88(1), 11-22.

7. Торчилин В.П., Клибанов A.Jl. (1987) Липосомы как средства направленного транспорта лекарств. Журнал Всесоюзного химического общества им. Д. И. Менделеева т. XXXII №5, 502-514.

8. Konar N., Kim С., J. (1999) Drug release from drug-polyanion complex tablets: poly(acrylamido-2-methyl-l-propanesulfonate sodium -co- methyl methacrylate)., J. Control. Release 57,141-150

9. Zhu G., Oto E., Vaage J., Quinn Y., Newman M., Engbers C., Uster P. (1996) The effect of vincristine-polyanion complexes in STEALTH liposomes on pharmacokinetics, toxicity and anti tumor activity., Cancer Chemother. Pharmacol. 39, 138-142.

10. Gibaud S., Weingarten C., Andreux J.P., Couvreur P. (1999) Targeting bone marrow with the help of polyalkylcyanoacrylate nanoparticles., Ann. Pharm. Fr. 57,324-331.

11. Oda Т., Sato F., Maeda H. (1987) Facilitated internalization of neocarzinostatin and its lipophilic polymer conjugate, SMANCS, into cytosol in acidic pH. J. Natl. Cancer Inst. 79,1205-1211.

12. Gerweck L.E., Seetharaman K. (1996) Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer., Cancer Res. 15, 1194-1198.

13. Yokoyama M., Kwon G.S., Okano Т., Sakurai Y., Seto Т., Kataoka K. (1992) Preparation of micelle-forming polymer-drug conjugates., Bioconjug. Chem. 3,295-301.

14. Kwon G.S., Yokoyama M., Okano Т., Sakurai Y., Kataoka K. (1993) Biodistribution of micelle-forming polymer-drug conjugates., Pharm. Res. 10, 970-974.

15. Yamamoto H., Miki Т., Oda Т., Hirano Т., Sera Y., Akagi M., Maeda H. (1990) Reduced bone marrow toxicity of neocarzinostatin by conjugation with divinyl ether-maleic acid copolymer., Eur. J. Cancer 26, 253-260.

16. Zunino F., Pratesi G., Pezzoni G. (1987) Increased therapeutic efficacy and reduced toxicity of doxorubicin linked to pyran copolymer via the side chain of the drug., Cancer Treat. Rep. 71, Ъ61-Ъ1Ъ.

17. Hirano Т., Ohashi S., Todoroki Т., Ihaba M., Tsukagoshi S. (1990) Antitumor activity of polyanion and its application for drug delivery system of antitumor drugs. Gan To KagakiRyoho 17, 542-547.

18. Thu В., Bruheim P., Espevik Т., Smidsrod O. (1996) Alginate polycation microcapsules. II. Some functional properties., Biomaterials 17, 1069-1079.

19. Baumler H., Artmann G., Voigt A., Mitlohner R., Neu В., Kiesewetter H. (2000) Plastic behaviour of polyelectrolyte microcapsules derived from colloid templates. J. Microencapsul. 17, 651-655.

20. Lvov Yu.M., Sukhorukov G.B. (1997) Protein architecture: assembly of ordered films by means of alternated adsorption of oppositely charged macromolecules., Membr. Cell Biol. 77,277-303.

21. Shu X.Z., Zhu K.J. (2000) A novel approach to prepare tripolyphosphate/chitosan complex beads for controlled release drug delivery., Int. J. Pharm. 15,51-58.

22. Elcin A.E., Elcin Y.M. (2000) Polycation-coated polyanion microspheres of urease for urea hydrolysis., Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 28, 95-111.

23. Trubetskoy V.S., Loomis A., Hagstrom J.E., Budker V.G., Wolff J.A. (1999) Layer-by-layer deposition of oppositely charged polyelectrolytes on the surface of condensed DNA particles., Nucleic Acids Res. 27, 3090-3095.

24. Lacik I., Brissova M., Anilkumar A.V., Powers A.C., Wang T. (1998) New capsule with tailored properties for the encapsulation of living cells., J. Biomed. Mater. Res. 39, 52-60.

25. New R.R.C. Liposomes, New York: IRL Press (1990), p. 221-251.

26. Allen T.M., Hansen C. (1991) Pharmacokinetics of stealth versus conventional liposomes: effect of dose. Biochim. Biophys. Acta 1068(2), 133-141.

27. Торчилин В.П., Трубецкой B.C. (1994) Можно ли предсказать транспортные свойства полимеров, исходя из химического строения цепей (Обзор)., ВМС 36 № 11, 1880-1893.

28. Torchilin V.P., Trubetskoy V.S., Whiteman K.R., Caliceti P., Ferruti P., Veronese F.M. (1995) New synthetic amphiphilic polymers for steric protection of liposomes in vivo., J. Pharm. Sci. 84,1049-1053.

29. Srinath P., Chary M.G., Vyas S.P., Diwan P.V. (2000) Long-circulating liposomes of indomethacin in arthritic rats-a biodisposition study., Pharm. Acta Helv. 74, 399-404.

30. Bader H. (1985) Membrane-spanning symmetric and asymmetric diyne amphiphiles., Polym. Sci. 64,1-9.

31. Kunitake Т., Okahata Y. (1977) Bilayer Membranes Prepared from Modified Dialkylammonium Salts and Methyldialkylsulfonium Salts., Chem. Lett., 1337-1343.

32. Okahata Y., Kunitake T. (1979) Formation of Stable Monolayer Membranes and Related Structures in Dilute Aqueous. Solution from Two-headed Ammonium Amphiphiles., J. Amer. Chem. Soc.102, 5231-5237.

33. Рингсдорф Г., Шмидт Б. (1987) Системы полимерных носителей лекарств. Журнал Всесоюзного химического общества им. Д.И. Менделеева т. XXXII №5,487-501.

34. Anikin A.V., Chupin V.V., Anikin M.V., Serebrennikova G.A., Evstigneeva R.P. (1991) Highly stable polymeric liposomes based on a diene-containing phosphatidylcholine., Dokl. Akad. Nauk SSSR 321(5), 1103-1105.

35. Freeman F.J., Hayward J.A., Chapman D. (1987) Permeability studies on liposomes formed from polymerizable diacetylenic phospholipids and their potential applications as drug delivery systems., Biochim. Biophys. Acta 924 (2), 341-351.

36. Hayward J.A., Johnston D.S., Chapman D. (1985) Polymeric phospholipids as new biomaterials., Ann. N.Y. Acad. Sci. 446, 267-281.

37. Wagner N. (1983) Incorporation of ATP synthetase into long-term stable liposomes of a polymerizable synthetic sulfolipid., FEBS Lett. 132,313-317.

38. Elbert R., Folda Т., Ringsdorf H. (1984) Liposomes from polymerizable phospholipids., J. Amer. Chem. Soc. 106, 7687-7693.

39. Regen S.L., Singh M., Samuel N.K. (1984) Funetionalized polymeric liposomes. Efficient immobilization of alpha chymotrypsin., Biochem. Biophys. Res. Commun. 119 (2), 646-651.

40. Regen S.L. (1985) Polymerized phosphatidylcholine vesicles as drug carriers., Ann. N.Y. Acad. Sci. 446,296-307.

41. Gaub H., Buachl R., Ringsdorf H. (1984) Lateral diffusion and phase separation in two-dimensional solutions of polymerized butadiene lipid in dimyristoylphosphatidylcholine bilayers. A photobleaching and freeze fracture study., Biophys. J. 45, 725-734.

42. Choi M.J., Han H.S., Kim H. (1992) pH-sensitive liposomes containing polymerized phosphatidylethanolamine and fatty acid., J. Biochem. 112(5), 694-699.

43. Геннис P. Биомембраны. Молекулярная структура и функции. Москва: Мир (1997), 289-331.

44. Reiner R., Antibiotics., Basle, Switzerland: "Roche" (1982), 31-32.

45. Neidle S., Sanderson M.R., Molecular Aspects of Anti-cancer Drug Action., New York: Neidle & Waring, Plenum Press (1983), p. 35-36.

46. Trail P.A., Willner D., Lasch S.J., Henderson A.J., Hofstead S., Casazza A.M., Firestone R.A., Hellstrom I., Hellstrom K.E. (1993) Cure of xenografted human carcinomas by BR96-doxorubicin immunoconjugates., Science 261, 212-215.

47. Shih L.B., Goldenberg D.M., Xuan H., Lu H., Sharkey R.M., Hall T.C. (1991) Anthracycline immunoconjugates prepared by a site-specific linkage via an amino-dextran intermediate carrier., Cancer Research 51, 4192-4198.

48. Shih L.B., Goldenberg D.M., Xuan H., Lu H. W.-Z., Mattes M.J., Hall T.C. (1994) Internalization of an intact doxorubicin immunoconjugate., Cancer Immunology Immunotherapy 38, 92-98.

49. Lavie E., Hirschberg D.L., Schreiber G., Thor K., Hill L., Hellstorm I., Hellstorm K.-E. (1991) Monoclonal antibody L6-daunomycin conjugates constructed to release free drug at the lower pH of tumor tissue., Cancer Immunology Immunotherapy 33, 223-230.

50. Subr V., Kopecek J., Pohl J., Baudys M., Kostka V. (1988) Daunomycin- and adriamycin-N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide copolymer conjugates; toxicity reduction by improved drug-delivery., J. Control. Release 8, 133-140.

51. Duncan R., Kopecek J., Lloyd J.B. (1984) Drug targeting to lysosomes., Biochemical Society Transactions, 608th meeting, Keele 12, 913-915.

52. Subr V., Duncan R, Kopecek J. (1990) Release of macromolecules and daunomycin from hydrophilic gels containing enzymatically degradable bonds., J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 1№4, 261-278.

53. Suda Y., Kusumoto S. (1994) Therapeutic efficacy of 5-fluorouracil prodrugs using endogenous serum proteins as drug carriers: a new strategy in drug delivery system., Macromol. Rep. A31, 1077-1083.

54. Stolfi R.L., Martin D.S. (1978) Therapeutic activity of maleic anhydride-vinyl ether copolymers against spontaneous, autochthonous murine mammary tumors., Cancer Treat. Rep. 62 (11), 1791-1796.

55. Schmolka I.R. (1977) Artificial blood emulsifiers., J. American Oil Society, 110-116.

56. Elworthy P.H., Ireon J.F. In: Nonionic Surfactants, ed. Shick M.J., 3-rd ed., NY., 1971, p.9317.

57. Alexandridis P., Holzwarth J.F., Hatton T.A. (1994) Micellization of Polyethylene oxide)-Poly(propylene oxide)-Poly(ethylene oxide) Triblock Copolymers in Aqueous Solutions. Thermodynamics of Copolymer Association. Macromolecules 27,2414-2120.

58. Mortensen K., Brown W. (1993) Poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide)-poly(ethylene oxide) triblock copolymers in aqueous solution. The influence of relative block size., Macromolecules 26,4128-4131.

59. Wanka, G., Hoffinannn H., Ulbricht W. (1990) Structural studies of aqueous solutions of PEO PPO - PEO triblock copolymers, their micellar aggregates and mesophases; a small-angle neutron scattering study., Colloid. Polym. Sci. 268, 101-107.

60. Mortensen K., Pedersen J.S. (1993) Structural study on the micelle formation of poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide)-poly(ethylene oxide) triblock copolymer in aqueous solution., Macromolecules 26, 805-812.

61. Alexandridis, P., Athanassiou, V., Fukuda, S., Hatton, T.A. (1994) Dynamics of Micro-and Macrophase Separation of Amphiphilic Block-Copolymers in Aqueous Solution., Macromolecules 27, 2604-2610.

62. Bentley P.K., Davis S.S., Johnson O.L., Lowe K.C., Washington C. (1989) Purification of pluronic F-68 for perfluorochemical emulsification., J. Pharm. Pharmacol. 41, 661663.

63. Иваницкий Г.Р., Белоярцев Ф.Ф., Медико-биологические аспекты применения эмульсий перфторированных углеводородов., Пущино (1983), с.9.

64. Forman М.В., Ingram D.A., Murray J.J. (1992) Role of perfluorochemical emulsions in the treatment of myocardial reperfusion injury., Amer. Heart J. 124,1347-1357.

65. Hurter P.N., Scheutjens J.M., Hatton, T.A. (1993) Molecular modeling of micelle formation and solubilization in block copolymer micelles. 2. Lattice theory for monomers with internal degrees of freedom., Macromolecules 26, 5030-5036.

66. Justicz A.G., Famsworth W.V., Soberman M.S., Tuvlin M.B., Bonner G.D., Hunter R.L., Martino-Saltzman D., Sink, J.D., Austin G.E. (1991) Reduction of myocardial infarct size by poloxamer 188 and mannitol in a canine model., Amer. Heart J. 122, 671-676.

67. Howell J.M., Stair Т.О., Howell A.W., Mundt D.J., Falcone A., Peters S.R. (1993) The effect of scrubbing and irrigation with normal saline, povidone iodine, and cefazolin on wound bacterial counts in a guinea pig model., Am .J. Emerg. Med. 11, 134-120.

68. Fults K.A., Johnston T.P. (1990) Sustained-release of urease from a poloxamer gel matrix., J. Parenteral Science & Technology 44, 58-64.

69. Miyazaki S., Ohkawa Y., Takada M., Attwood D. (1992) Antitumor effect of pluronic F-127 gel containing mitomycin С on sarcoma-180 ascites tumor in mice., С hem. Pharm. Bull. 40, 2224-2230.

70. Carter K.C., Gallagher G., Baillie A.J., Alexander J. (1989) The induction of protective immunity to Leishmania major in the BALB/c mouse by interleukin 4 treatment., Eur. J. Immunol. 19, 779-786.

71. Nutting D.F., Tso P. (1989) Hypolipidemic effect of intravenous pluronic L-81 in fasted rats treated with Triton WR-1339: possible inhibition of hepatic lipoprotein secretion., Hormone & Metabolic Research 21,113-118.

72. Chi S.C., Jun H.W. (1991) Release rates of ketoprofen from poloxamer gels in a membraneless diffusion cell., J. Pharm. Sci. 80,280-289.

73. Chi S.C., Jun H.W. (1990) Anti-inflammatory activity of ketoprofen gel on carrageenan-induced paw edema in rats., J. Pharm. Sci. 79,974-981.

74. Durand-Cavagna G., Duprat P. (1989) Molon-Noblot S., Delort P., Rozier A., Corneal endothelial changes with azone, a penetration enhancer., Lens & Eye Tox. Res. 6, 109113.

75. Кабанов В.A. (1994) Физико-химические основы и перспективы использования растворимых интерполиэлектролитных комплексов., ВМС 36 №2,183-197.

76. Goddard E.D., Ananthapadmanabhan К.Р. Interactions of Surfactants with Polymers and Proteins. CRC Press (1993), 205-238.

77. Thalberg K., Lindman B. (1989) Interaction between hyaluronan and cationic surfactants., J. Phys. Chem. 93,1478-1484.

78. Binana-Limbele W., Zana R. (1987) Fluorescence probing of microdomains in aqueous solutions of polysoaps. 1. Use of pyrene to study the conformational state of polysoaps and their comicellization with cationic surfactants., Macromolecules 20,1331-1339.

79. Hayakava K, Santerre J.P., Kwak J.C.T. (1983) Study of surfactant-polyelectrolyte interactions. Binding of dodecyl- and tetradecyltrimethylammonium bromide by some carboxylic polyelectrolytes., Macromolecules 16, 1642-1645.

80. Keifer J.J., Somasundaran P., Ananthapadmanabhan K.P. (1993) Interaction of tetradecyltrimethylammonium bromide with poly(acrylic acid) and poly(methacrylic acid). Effect of charge density., Langmuir 9,1187-1192.

81. Chandar P., Somasundaran P., Turro N.J. (1988) Fluorescence probe investigation of anionic polymer-cationic surfactant interactions., Macromolecules 21, 950-953.

82. Satake I., Takahashi Т., Hayakava K., Maeda Т., Aoyagi M. (1990) The conformational change of poly(L-ornithine) with organic counterions in aqueous sodium 1-dodecanesulfonate solution., Bull. Chem. Soc. Jpn. 63,926-932.

83. Thalberg K., van Stam J., Lindblad C., Almgren M., Lindman B. (1991) Time-resolved fluorescence and self-diffusion studies in systems of a cationic surfactant and an anionic polyelectrolyte., J. Phys. Chem. 95, 8975-8983.

84. Iliopoulos I., Wang Т.К., Audebert R. (1991)Viscometric evidence of interactions between hydrophobically modified poly(sodium acrylate) and sodium dodecyl sulfate., Langmuir 7, 617-623.

85. Colby R.H., Plucktaveesak N., Bromberg L. (2001) Critical Incorporation Concentration of Surfactants Added to Micellar Solutions of Hydrophobically Modified Polyelectrolytes of the Same Charge., Langmuir ASAP article, p. B-E.

86. Касаикин B.A. (1988) Диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук, Москва, МГУ.

87. Michaelis L., Granick. S. (1945) Metachromasy of Basic Dyestuffs., J. Amer. Chem. Soc. 67 №7,1212-1219.

88. Haugen G.R., Hardwick E.R. (1963) Ionic Association in Aqueous Solutions of Thionine., J.Phys.Chem. 67, 725-731.

89. Mukeijee P., Ghosh A.K. (1970) Thermodynamic aspects of the self-association and hydrophobic bonding of methylene blue. Model system for stacking interactions., J. Amer. Chem. Soc. 92, 6419-6424.

90. Ortona O., Vitagliano V., Sartorio R., Costantino L. (1984) Spectrophotometry study of the interaction of poly(styrenesulfonic acid) with a metachromatic die in methanol., J. Phys, Chem. 88,3244-3248.

91. Pal M.K., Schubert M. (1961) Ultracentrifugal Separation of the Metachromatic Compound of Methylene Blue and Chondriotin Sulfate., J. Phys. Chem. 65, 872-877.

92. Vitagliano V., Costantino L., Zagari A. (1973) Interaction between Acridine Orange and poly(styrenesulfonic acid)., J. Phys. Chem. 77, 204-210.

93. Block M.C., van Deenen L.M.M., de Gier J. (1976) Effect of the gel to liquid crystalline phase transition on the osmotic behaviour of phosphatidylcholine liposomes., Biochim. Biophys. Acta 433,1-12.

94. Xiang T.-X., Anderson B.D. (1988) Transport methods for probing the barrier domain of lipid bilayer membranes., Biochim. Biophys. Acta 1370, 64-76.

95. Frezard G., Garnier-Suillerot Т. M. (1998) Permeability of lipid bilayer to anthracycline derivatives. Role of the bilayer composition and of the temperature., Biochim. Biophys. Acta 1389(1), 13-22.

96. Aldwincle T.J., Ahkong Q.F., Bangham A. D., Fisher D., Lucy J.A. (1982) Effects of poly(ethylene glycol) on liposomes and erythrocytes. Permeability changes and membrane fusion., Biochim. Biophys. Acta 689, 548-560.

97. Удалых О.Ю. (1999) Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. Москва, МГУ.

98. Mitrakos P., Macdonald P.M. (1996) DNA-induced lateral segregation of cationic amphiphiles in lipid bilayer membranes as detected via 2H NMR., Biochemistry 35, 16714-16722.

99. Mitrakos P., Macdonald P.M. (2000) Nucleotide chain length and the morphology of complexes with cationic amphiphiles: 31P-NMR observations., Biochim. Biophys. Acta 1463,355-373.

100. Мальцева E.A., Антоненко Ю.Н., Мелик-Нубаров H.C., Ягужинский Jl.С. (2002) Влияние синтетических амфифильных полианионов на транспорт ионов черезф плоскую бислойную липидную мембрану., Биологические мембраны 19, 347-350.

101. Thomas J., Devlin В.Р., Tirrell D.A. (1996) Kinetics of membrane micellization by the hydrophobic polyelectrolyte poly-(2-ethylacrylic acid)., Biochim. Biophys. Acta 1278, 73-78. ;

102. Thomas J.L., Tirrell D.A. (2000) Polymer-induced leakage of cations from dioleoylphosphatidylcholine and phosphatidylglycerol liposome., J. Control. Release 67, 203-209.

103. Chung J. C., Gross D. J., Thomas, J. L., Tirrell D. A., Opsahl-Ong L. R. (1996) pH

104. Sensitive, Cation-Selective Channels Formed by a Simple Synthetic Polyelectrolyte in

105. Artificial Bilayer Membranes., Macromolecules 29(13), 4636-4641.

106. Carrier D., Pezolet M. (1984) Study of the effect of poly(L-lysine) on phosphatidic acid and phosphatidylcholine/phosphatidic acid bilayers by raman spectroscopy., BiophysJ., 46, 497-506.

107. Carrier D., Dufourcq J., Faucon J.-F., Pezolet M. (1985) A Fluorescence Investigation of the Effects of Polylysine on Dipalmitoylphosphatidylglycerol Bilayers.,

108. Ф Biochim.Biophys.Acta 820, 131-139.

109. Carrier D., Pezolet M. (1986) Investigation of polylysine-dipalmitoylphosphatidylglycerol Interactions in model membranes., Biochemistry 25, 4167-4174.

110. Takahashi H., Matuoka S., Kato S., Ohki K., Hatta I. (1992) Electrostatic interaction of poly(L-lysine) wilh dipalmitoylphosphatidic acid studied by x-ray diffraction., Biochim.Biophys.Acta 1110,29-36.

111. Hartmann W., Galla H.-J. (1978) Binding of polylysine to charged bilayer membranes: molecular organization of a lipid/peptide complex., Biochim.Biophys.Acta 509,474-490.

112. Laroche G., Carrier D., Pezolet M. (1988) Study of the effect of poly(L-lysine) on phosphatidic acid and phosphatidylcholine/phosphatidic acid bilayers by Raman spectroscopy., Biochemistry 27, 6220-6228.

113. Laroche G., Pezolet M., Dufourcq J., Dufourc E.J. (1989) Modifications of the structure and dynamics of dimyristoylphosphatidic acid model membranes by calcium ions and poly-L-lysines., Progr.Colloid Polym.Sci. 79, 38-42.

114. Galla H.-J., Sackmann E. (1975) Chemically induced lipid phase separation in model membranes containing charged lipids: a spin label study., Biochim.Biophys.Acta 401, 509-529.

115. Papahadjopoulos D., Moscarello M., Eylar E.H., Isac T. (1975) Effects of proteins on thermotropic phase transitions of phospholipid membranes., Biochim.Biophys.Acta 401, 317-335.

116. Cevc G., Marsh D., Phospholipid bilayers, NY: Willey (1987).

117. Takahashi H., Matuoka S., Kato S., Ohki K., Hatta I., (1991) Electrostatic interaction of poly(L-lysine) wilh dipalmitoylphosphatidic acid studied by x-ray diffraction., Biochim.Biophys.Acta 1069, 229-234.

118. Cornell D.G., Dluhy R.A. (1989) Conformations and orientations of a signal peptide interacting with phospholipid monolayers., Biochemistry 28, 2789-2797.

119. Ringsdorf H., Sackmann E., Simon J., Winnik F.M. (1993) Interactions of liposomes and hydrophobically-modified poly-(N-isopropylacrylamides): an attempt to model the cytoskeleton., Biochim. Biophys.Acta 1153, 335-344.

120. Mittler-Neher S., Knoll W. (1989) Phase Separation in Bimolecular Mixed Lipid Membranes Induced by Polylysine., Biochem.Biophys.Res.Commun 162,124-129.

121. Huschilt J.C., Millman B.M., Davis J.H. (1989) Orientation of-helical peptides in A lipid bilayer., Biochim.Biophys.Acta 979, 139-141.

122. Ohno H., Maeda Y., Tsushida E. (1981) 1H-NMR study of the effect of synthetic polymers on the fluidity, transition temperature and fusion of dipalmitoyl phosphatidylcholine small vesicles., Biochim.Biophys.Acta 642, 27-36.

123. Ikeda Т., Lee В., Yamaguchi H., Tazuke S. (1990) Phase separation in phospholipid bilayers induced by biologically active polycations., Biochim.Biophys. Acta 1021, 56-62.

124. Ringsdorf H., Simon J., Winnik F.M. (1993) Colloid-Polymer Interactions: Particulate, Amphiphilic, and Biological Surfaces., Washigton: ACS, p.216.

125. Oku N., Shibamoto S., Ito F., Gondo H., Nango M. (1987) Low pH induced membrane fusion of lipid vesicles containing proton-sensitive polymer., Biochemistry 26, 81458150.

126. Yaroslavov A.A., Kul'kov V.Ye., Efimova A.A., Ignatiev M.O. (1995) Synthetic polycations on the surface of negatively charged liposomes., Thin Solid Films 265, 66-70.

127. Torchilin V.P., Shtilman M.I., Trubetskoy V.S., Whiteman K., Milstein A.M. (1994) Targeted polymeric micelles for delivery of poorly soluble drugs., Biochim.Biophys.Acta 1195,181-184.

128. Yaroslavov A.A., Sukhishvili S.A., Obolsky O.L., Yaroslavova E.G., Kabanov A.V., Kabanov V.A. (1996) DNA Affinity to Biological Membranes is Enhanced Due to Complexation with Hydrophobized Polycation., FEBS Lett. 384,177-180.

129. Kabanov V.A., Yaroslavov A.A., Sukhishvili S.A. (1996) Interaction of Polyions with Cell-Mimetic Species: Physico-Chemical and Biomedical Aspects., J.Control. Rel. 39, 173-189.

130. Сухишвили C.A., Обольский O.JL, Астафьева И.В., Кабанов А.В., Ярославов А.А. (1993) Интерполиэлектролитные комплексы ДНК: Взаимодействие с липосомами., ВМС 35,1895-1899.

131. Ikeda Т., Ledwith A., Bamford C.N., Hann R.A. (1984) Interaction of a polymeric biguanide biocide with phospholipid membranes., Biochim.Biophys.Acta 769, 57-66.

132. Hammes G.G., Schullery S.E. (1970) Structure of macromolecular aggregates. II. Construction of model membranes from phospholipids and polypeptides., Biochemistry 9, 2555-2563.

133. Oku N. Yamaguchi N., Yamaguchi N. Shibamoto S., Ito F., Nango M. (1986) The Fusogenic Effect of Synthetic Polycations on Negatively Charged Lipid Bilayers., J.Biochem. 100, 935-944.

134. Yaroslavov A.A., Kul'kov V.Ye., Polinsky A.S., Baibakov B.A., Kabanov V.A. (1994) A polycation causes migration of negatively charged phopholipids from the inner to outer leaflet of the liposomal membrane., FEBS Lett. 340, 121-123.

135. Yantvin M.B., Kreutz W., Horwitz B.A., Shinitzky N. (1980) X-ray and neutron scattering density profiles of the intact human red blood cell membrane., Science 210, 253-257.

136. Petrukhina O.O., Ivanov N.N., Feldshtein M.N., Vasilev A.E., Plate N.A., Torchilin V.P. (1986) Micelles from polyethylene glycol/phosphatidylethanolamine conjugates for tumor drug delivery., J.Control. Rel. 3, 137-143.

137. Ярославов А.А., Ефимова А.А., Лобышев В.И., Ермаков Ю.А., Кабанов В.А. (1996) Обратимость изменения структуры липидных мембран, индуцированных адсорбцией поликатиона., Биологические мембраны 13,628-633.

138. Kubesch P., Boggs J., Luciano L., Maass G., Tummler B. (1987) Interaction of polymyxin В nonapeptide with anionic phospholipids., Biochemistry 26, 2139-2149.

139. Ikeda Т., Yamaguchi H., Tazuke S. (1990) Phase separation in phospholipid bilayers induced by biologically active polycations., Biochim.Biophys.Acta 1026,105-112.

140. Raudino A., Castelli F. (1997) Polyelectrolyte-Multicomponent Lipid Bilayer Interactions. Unusual Effects on Going from the Dilute to the Semidilute Regime., Macromolecules 30, 2495-2502.

141. Ярославов A.A., Киселева E.A., Удалых О.Ю., Кабанов В.А. (1996) Композиционный предел стабильности жидких отрицательно заряженных липосом при контакте с поликатионом., Докл.Акад.наук 349, 67-69.

142. Ярославов А.А., Ефимова А.А., Кульков В.Е., Кабанов В.А. (1994) Адсорбция поликатиона на поверхности отрицательно заряженных липосом. Влияние фазового состояния липидного бислоя на строение комплекса поликатион-липосома., ВМС 36,264-270.

143. Uster P.S., Deamer D.W. (1985) pH-Dependent fusion of liposomes using titratable polycations., Biochemistry 24, 1-8.

144. Suenaga M., Lee S., Park N.G., Aoyagi H., Kato Т., Umeda A., Amako K. (1989) Basic amphipathic helical peptides induce destabilization and fusion of acidic and neutral liposomes., Biochim.Biophys.Acta 981,143-150.

145. Gad A.E., Silver B.L., Eytan G.D. (1982)Polycation-induced fusion of negatively-charged vesicles., Biochim.Biophys.Acta 373, 124-132.

146. Gad A.E., Elyashiv G., Rosenberg N. (1986) Changes in the integrity of large unilamellar vesicles due to their interaction with tobacco cell suspensions., Biochim.Biophys.Acta 860,314-324.

147. Марголис JI.Б., Бергельсон JI.Д. Липосомы и их взаимодействие с клетками., Москва:Наука (1986).

148. Gad А.Е. (1983) Cationic polypeptide-induced fusion of acidic liposomes., Biochim.Biophys.Acta 728, 377-382.

149. Gad A.E., Eytan G.D. (1983) Calcium-induced fusion of proteoliposomes and protein-free liposomes. Effect of their phosphatidylethanolamine content on the structure of fused vesicles., Biochim.Biophys.Acta 727, 170-176.

150. Петров P.B., Хаитов P.M. Искусственные антигены и вакцины. Москва: Медицина (1988).

151. Soderlund Т., Jutila A., Kinnunen Р. К., Walter А. (1985) Continuous mixing experiments allow to determine the size of binding sites for anthracyclines complexed to DNA., Biomed Biochim Acta. 44(9), 1321-1327.

152. Harrigan P.R., Wong K.F., Redelmeier Т.Е., Wheeler J.J., Cullis P.R. (1993) Accumulation of doxorubicin and other lipophilic amines into large unilamellar vesicles in response to transmembrane pH gradients., Biochim. Biophys. Acta 1149, 329-338.

153. McLellan Т. (1982)Electrophoresis buffers for polyacrylamide gels at various pH., Analytical Biochemistry 126, 94-99.

154. Van Holde K.E., Physical Biochemistry, Prentice Hall 2nd. Edition (1971), 168-181

155. Menozzi M., Valentini L., Vannini E., Arcamone F. (1984) Self-association of doxorubicin and related compounds in aqueous solution., J. Pharm.Sci. 73, 766-770.

156. Wang C., Tam K.C. (2004) Interaction between Polyelectrolyte and Oppositely Charged Surfactant: Effect of Charge Density., J. Phys. Chem. В 108(26), 8976-8982

157. Tribet C. (1998) Hydrophobically driven attachments of synthetic polymers onto surfaces of biological interest: lipid bilayers and globular proteins., Biochimie 80 (5-6), 461-73

158. Lee N.K., Abrams C.F. (2004) Kinetics of a polysoap collapse., J Chem Phys. 121(15), 7484-7493.

159. Uchegbu I.F., Sadiq L., Arastoo M., Gray A.I., Wang W., Waigh R.D., Schatzlein A.G. (2001) Quaternary ammonium palmitoyl glycol chitosan~a new polysoap for drug delivery., Int JPharm. 224(1-2), 185-199.

160. Griffin E. A., Vanderkooi J. M., Maniara G., Erecinska M. (1986) Anthracycline binding to synthetic and natural membranes. A study using resonance energy transfer., Biochemistry 25, 7875-7880.

161. Dupou-Cezanne L., Sautereau A. M., Tocanne J. F. (1989) Localization of adriamycin in model and natural membranes. Influence of lipid molecular packing., Eur. J.Biochem. 181, 695-702.

162. Heywang С., Chazalet M. S.-P., Masson M. C., Bolard J. (1998) Orientation of anthraeyelines in lipid monolayers and planar asymmetrical bilayers: a surface-enhanced resonance Raman scattering study., Biophys. J. 75,2368-2381.

163. Yaroslavov A.A., Efimova A.A., Lobyshev V.I. Kabanov V.A. (2002) Reversibility of structural rearrangements in the negative vesicular membrane upon electrostatic adsorption/desorption of the polycation., Biochim.Biophys.Acta 1560, 14-15.

164. Hartmann W., Galla H.J. (1978) Binding of polylysine to charged bilayer membranes: molecular organization of a lipid.peptide complex., Biochim.Biophys.Acta 509,474-490.

165. Fukushima K., Sakamoto Т., Tsuji J., Kondo K., Shimozawa R. (1994) The transition of alpha-helix to beta-structure of poly(L-lysine) induced by phosphatidic acid vesicles and its kinetics at alkaline pH., Biochim. Biophys.Acta 1191, 133-135.

166. Шульц Г.Е., Ширмер P.X. Принципы структурной организации белков. Москва: Мир (1982).

167. Кантор Ч., Шиммел П. Основы биофизической химии. Т.2. Москва: Мир (1984).

168. Rudek M.A., Sparreboom A., Garrett-Mayer E.S., Armstrong D.K., Wolff A.C., Verweij J., Baker S.D. (2004) Factors affecting pharmacokinetic variability following doxorubicin and docetaxel-based therapy., Eur. J. Cancer 40(8), 1170-1178.

169. Kozlova N.O., Bruskovskaya I.B., Okuneva I.B., Melik-Nubarov N.S., Yaroslavov A.A., Kabanov V.A., Menger F.M. (2001) Interaction of a cationic polymer with negatively charged proteoliposomes., Biochim Biophys Acta 1514(1), 139-151.

170. Mouritsen O.G., Jorgensen К. (1998) A new Look at Lipid-Membrane Structure in Realtion to Drug Research., Pharmaceutical Research 15, 10-25.

171. Yaroslavov A.A., Sukhishvili S.A., Obolsky O.L., Yaroslavova E.G., Kabanov A.V., Kabanov V.A. (1996) DNA affinity to biological membranes is enhanced due to complexation with hydrophobized polycation., FEBSLett. 384(2), 177-180.

172. Ferdous A.J., Ishida Т., Shinohara M., Harashima H., Kiwada H. (1996) Size-dependent release of carboxyfluorescein from cetylmannoside-modified liposomes in human plasma., Biopharm Drug Dispos. 17(2), 145-154.

173. Thoren P.E., Persson D., Lincoln P., Norden B. (2005) Membrane destabilizing properties of cell-penetrating peptides., Biophys Chem. 114(2-3), 169-179.