Высокоэффективная жидкостная хроматография оптически активных азотсодержащих соединений

Ананьева, Ирина Алексеевна

Высокоэффективная жидкостная хроматография оптически активных азотсодержащих соединений тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

Ананьева, Ирина Алексеевна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2001 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.02 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Высокоэффективная жидкостная хроматография оптически активных азотсодержащих соединений»

Автореферат диссертации на тему "Высокоэффективная жидкостная хроматография оптически активных азотсодержащих соединений"

РГБ ОД

2 5 ДЕН 2001

На правах рукописи

Ананьева Ирина Алексеевна

ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ ОПТИЧЕСКИ АКТИВНЫХ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ СОЕДИНЕНИЙ

02.00.02 - Аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2001

Работа выполнена в лаборатории хроматографических методов анализа кафедры аналитической химии Химического факультета МГУ им, М.В. Ломоносова

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Шпигун O.A. кандидат химических наук, доцент Шаповалова E.H.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Яшин Я.И. кандидат химических наук Боганов A.M.

Ведущая организация:

Институт физической химии РАН

Защита состоится 26 декабря 2001 года в 16 ч. 10 мин. в аудитории 344 на заседании диссертационного совета Д.053.05.60 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М В. Ломоносова по адресу:

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им М.В. Ломоносова.

Отзывы и замечания просьба отправлять по адресу:

119899, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра аналитической химии, ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат химических наук /с'^' Торочешникова И.И.

119899, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет

Автореферат разослан 26 ноября 2001 года.

Актуальность темы. Оптически активные соединения играют исключительно важную роль во многих биохимических процессах, их определение имеет принципиальное значение для аналитической химии, теоретической органической химии, медицины, фармакологии. Контроль оптической чистоты производимых лекарственных средств в настоящее время введен во всех промышленно развитых странах. Именно высокоэффективная жидкостная хроматография позволяет решить сложнейшие проблемы анализа • энантиомерного состава хиральных соединений, препаративного получения оптически чистых изомеров различных классов соединений. Хроматографическое разделение энантиомеров принципиально возможно только в системах, содержащих хиральный селектор, призванный распознавать пространственную конфигурацию двух идентичных по всем своим физическим и химическим свойствам изомеров. В связи с этим все сильней возрастает интерес к разработке новых хиральных селекторов.

Вследствие сложности явления хирального распознавания «универсального» сорбента, который бы позволил решить все проблемы разделения оптических изомеров, не существует, каждый сорбент имеет свои преимущества, свою область применения, свои недостатки. Для создания эффективных хроматографических методов разделения энантиомеров необходимо более углубленное изучение процессов хирального распознавания энантиомеров. Весьма перспективны для создания хиральных неподвижных фаз полисахариды и, в частности, Р-циклодекстрин и его производные. Важным достижением в создании новых хиральных селекторов было открытие макроциклических антибиотиков, которые предоставляют широкие возможности для разделения различных классов энантиомеров благодаря сложному механизму хирального распознавания на хиральной поверхности.

Для рационального выбора хирального селектора и условий энантиоразделения необходимо четкое понимание процессов, происходящих во время хроматографического разделения, и влияние на эти процессы различных факторов. Поэтому важно изучение закономерностей удерживания и разделения энантиомеров и возможности предсказания классов соединений, к которым будет проявлять энантиоселективность тот или иной селектор.

Актуальна проблема разделения энантиомеров аминокислот, играющих важную роль в процессах питания и входящих в состав белков в организме человека. Определение и разделение биогенных аминов, аминоспиртов и их энантиомеров, которые участвуют в метаболических процессах в организме и используются как лекарственные препараты,

является одной из наиболее важных задач в биохимии. В ряде случаев оптические изомеры не могут быть разделены прямым путем и их переводят в форму производных.

Необходимость разделения энантиомеров фармацевтических препаратов, таких как р-блокаторы, обусловлена их различным фармакологическим действием в биологических системах.

- изучена возможность хирального распознавания различных классов энантиомеров на новом хиралыюм селекторе - аминированном Р-циклодекстрине в обращенно-фазовом и полярно-органическом режимах жидкостной хроматографии;

- изучены особенности хроматографического удерживания и энантиоразделения производных аминокислот на циклодекстриновых и антибиотиковых неподвижных фазах;

- установлена корреляция хроматографических параметров с параметром гидрофобности производных аминокислот на циклодекстриновых и антибиотиковых неподвижных фазах;

- исследованы особенности хроматографического поведения аминокислот на циклодекстриновых и антибиотиковых неподвижных фазах;

- изучены особенности разделения Ы-гидроксипропиламинов, биологически активных аминов и аминоспиртов;

- выбраны условия использования различных хиральных селекторов для определения оптической чистоты коммерчески доступных лекарственных форм и химических препаратов аминокислот.

Научная новизна. Изучены закономерности удерживания и энантиоразделения производных аминокислот на циклодекстриновых и антибиотиковых неподвижных фазах как функции гидрофобности сорбатов.

Предложен новый хиральный селектор - аминированный р-циклодекстрин. Показано, что аминированный Р-циклодекстрин в отличие от немодифицированного р-циклодекстрина проявляет селективность к энантиомерам И^еп-бутоксикарбонил-производным (БОК) аминокислот.

Сопоставлена распознавательная способность хиральных сорбентов на основе лакроциклических антибиотиков. Исследовано влияние различия в структурах тикопланина 1 тикопланина аглихона на энантиоселективность неподвижной фазы.

Найдены условия хроматографического разделения энантиомеров некоторых Зиогенных аминов и аминоспиртов, а также их смесей.

Практическая значимость работы. Получены данные по разделению энантиомеров 1роизводных аминокислот и самих аминокислот на колонках с немодифицированным Р-шклодекстрином, аминированным Р-циклодекстрином и макроцикличсскими шт'ибиотиками. ' ' •1 : '

Результаты изучения энантиоразделения аминокислот на макроциклических штибиотиках позволили выбрать условия разделения энантиомеров аминокислот и зпределения оптической чистоты коммерчески доступных реактивов. Найдены условия хроматографического определения и разделения лекарственного препарата адреналина, р-элокатора атенолола, химических препаратов аминокислот и их оптической чистоты.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Данные по изучению хроматографического поведения энантиомеров производных аминокислот на циклодекстриновых неподвижных фазах в обращенно-фазовом и полярно-органическом режимах жидкостной хроматографии. Результаты сопоставления разделения энантиомеров производных аминокислот на немодифицированном p-циклодекстрине и аминированном р-циклодекстрине.

2. Выводы о закономерностях удерживания и энантиоразделения производных аминокислот как функции гидрофобности сорбатов.

3. Закономерности энантиоразделения аминокислот на антибиотиковых хиральных неподвижных фазах.

4. Сравнение закономерностей энантиораспознавания на циклодекстриновых и антибиотиковых хиральных неподвижных фазах.

5. Выбор условий разделения энатиомеров p-блокаторов, биогенных аминов, аминоспиртов и их смесей.

6. Условия определения оптической чистоты некоторых соединений.

Апробация работы. Основное содержание работы изложено в 16 публикациях.

Результаты исследований докладывались на «Всероссийском симпозиуме по химии поверхности, адсорбции и хроматографии (Москва, 1999 г.), Всероссийской конференции «Химический анализ веществ и материалов» (Москва, 2000 г.), «10lh Russian-Japan Joint

Symposium on Analytical Chemistry» (Moscow - St.Petersburg., 2000), IX Международно конференции по теоретическим вопросам адсорбции и адсорбционной хроматографи «Современное состояние и перспективы развития теории адсорбции» (Москва, 2001 г.), II1 Международной научно-технической конференции «Высокие технологии в промышленност. России» (Москва, 2001 г.), В"1 International Symposium "Chirality 2001" (Orlando, Florida USA, 2001), International Congress on Analytical Sciences (Tokyo, Japan, 2001), 1 lth Internationa Symposium "Advanced and Application of Chromatography in Industry" (Bratislava, Slova] Republic, 2001), 2"d International Symposium "Separation in BioSciences" (Praha, Czech republic 2001), VIII Всероссийском симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии i капиллярному электрофорезу (Москва, 2001 г.), VI Международной конференции «Новьи достижения в исследовании хитина и хитозана» (Москва, 2001 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 4 статьи и 12 тезисо1 докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора 5 глав экспериментальной части, общих выводов, приложения и списка цитируемо! литературы. Материал диссертации изложен на 188 страницах машинописного текста содержит 84 рисунка и 52 таблицы, в списке цитируемой литературы 105 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы

Обсуждены особенности теории хирального распознавания, рассмотрены основные типы взаимодействий, возможных в процессах энантиоселективного распознавания.

Проанализированы особенности строения хиральных неподвижных фаз на основе полисахаридов, их производных и макроциклических антибиотиков, рассмотрены возможности их применения в различных режимах жидкостной хроматографии для разделения оптически активных соединений.

Экспериментальная часть

В работе использовали отечественный жидкостной микроколоночный хроматограф «Мийихром», оснащенный спектрофотометрическим детектором «ОМБ» (190-360 нм) и стальными колонками (64x2 мм), жидкостной хроматограф фирмы «Элсико» со спектрофотометрическим детектором (190-360 нм) и стальные колонки (150x3 мм), жидкостной хроматограф фирмы «Shimadzu» SLC-10A со спектрофотометрическим

ктектором фирмы «Shimadzu» SPD-10AV, насосом LC-10AT и интегратором «Shimadzu» DR601 и стальные колонки (250x4.6 мм), жидкостной хроматограф фирмы "Яуза" с шперометрическим детектором и стальные колонки (250x4.6 мм). Объемы вводимой пробы i объемные скорости" потока элюента составили соответственно: для хроматографа <Милихром» - 10 мкл и 100 мкл/мин, для хроматографа фирмы «Элсико» - 20 мкл и 0.5 лл/мин, для хроматографа фирмы «Shimadzu» - 20 мкл и 1.0 мл/мин, для хроматографа |шрмы «Яуза» - 20 мкл и 1 мл/мин.

В качестве неподвижных фаз применяли сорбенты: Silasorb С18 (10 мкм) фирмы <Lachema» (Чехия); силикагель Silasorb 600 фирмы «Lachema» (Чехия), модифицированный штозаном, фенилизотиоцианатом хитозана и аминированным Р-циклодекстрином, предоставленные центром «Биоинженерия РАН»; "Cyclobond 2000", "Chirobiotic Т", 'Chirobiotic V" и "Chirobiotic Tag" фирмы «Advanced Separation Technology» (США).

В качестве подвижных фаз использовали смеси ацетонитрила, метанола, этанола, циоксана, тетрагидрофурана и различными буферными растворами или водой; ацетошприл и метанол с добавкой уксусной кислоты и триэтиламина; смеси ацетонитрила, метанола или изопропанола с добавкой уксусной кислоты и триэтиламина; смеси гексана и изопропанола.

рН водных растворов контролировали на иономере ЭВ-74 со стеклянным и хлорид :еребряным электродами.

Разделение оптических изомеров производных аминокислот Р-циклодекстриновые хнральные неподвижные фазы позволяют разделять широкий круг соединений, главным условием энантиоселективности является определенный размер молекулы сорбата. Оптические изомеры аминокислот не могут быть разделены на Р-циклодекстринах прямым путем, так как размер молекул слишком мал, чтобы образовывать комплекс включения с Р-циклодекстрином. Для того чтобы решить эту задачу аминокислоты переводят в форму производных. Расширение возможностей циклодекстриновых хиральных фаз обусловлено их модификацией. В качестве нового хирального селектора предложен аминированный p-циклодекстрин. На примере энантиомеров производных аминокислот с различными модифицирующими группами, структуры которых приведены в табл. 1, было проведено сравнение хиральной способности немодифицированного ("Cyclobond 2000") и аминированного р-циклодекстринов.

Таблица 1. Модифицирующие агенты аминокислот

Структурная формула Обозначение

^(СНз)г 0 <л л—Б—1МН-R \\ // м л— О Дансил

сн2о-с—ын—я О ФМОК

О-мн— н ОгМ ДНФ

ОгЫч (О)——Р у—N Ог\Г ДНП

О Фталил

^—С Нг-О-С—N Н-И КБЗ

ЭСНгСНгОН .Об- ОФА

©Мг-™—к 4—' о Бензоил

СНз СН3—С—О—С—N14—Я 1 1' СН3 О БОК

Л - остаток аминокислоты

Удерживание и селективность разделения оптических изомеров в значительной степени зависит от подвижной фазы: природы и содержания органического компонента, рН, состава буферного раст'вора. Разделение производных аминокислот проводили в обращенно-фазовом и полярно-органическом (при содержании полярного органического растворителя > 90 %) режимах жидкостной хроматографии.

Оптимальным значением рН подвижной фазы для элюирования большинства производных аминокислот является область около 4.0, за исключением производных с о-фталевым альдегидом, которые неустойчивы при рН<7.0. Их разделяли при элюировании подвижной фазой содержащей буферный раствор с рН 7.0.

Установлено, что из четырех исследованных растворителей (диоксан, тетрагидрофуран, ацетонитрил, метанол) максимальные значения селективности были достигнуты при использовании метанола. Удовлетворительные результаты были получены и при использовании ацетошприла.

В работе было исследовано влияние соотношения метанола и буферного раствора ацетата триэтиламина (ТЕАА, 1%, рН 4.1) в подвижной фазе на коэффициент удерживания и разрешение для КБЗ-производных аминокислот и БОК-производных аминокислот на аминированном Р-циклодекстрине. Полученные зависимости для КЕЗ-БЬ-аланина и БОК-ОЬ-аланина показаны на рис. 1. Аналогичное поведение проявляли и другие изученные КБЗ-производные и БОК-производные. Такой характер зависимости связан с изменением механизма удерживания сорбатов при высоком содержании полярного органического растворителя в подвижной фазе.

А В

Рис. 1. Влияние процентного содержания метанола в подвижной фазе на удерживание (к')(») и разрешение ({*,)(■) А - КБЗФЬ-аланина; В - БОК-ИЬ-аланина. Колонка аминированный р-цикподекстрин, 250x4.6 мм. Подвижная фаза содержала определенный процент метанола и ТЕАА 1% (рН 4.1). Скорость потока 1 мл/мин, л=254нм.

При работе с подвижными фазами, содержащими от 90 до 100% ацетонитрила или метанола, реализуется, так называемый, полярно-органический вариант жидкостной хроматографии. При высокой концентрации органического компонента в подвижной фазе он занимает полости Р-циклодекстрина, делая их недоступными для образования комплекса включения с хиральным соединением. Разделение происходит за счет образования водородных связей, диполь-дипольных и стерических взаимодействий.

Значения коэффициентов емкости и энантиоразрешения, полученные на новой неподвижной фазе - аминированном Р-циклодекстрине, показывают возможность использования больших концентраций метанола для успешного разделения изомеров производных аминокислот.

На рис. 2 представлены зависимости логарифмов коэффициентов емкости ОФА-Ш.-тирозина, ОФА-ОЬ-фенилаланина, ОФА-ОЬ-лсйцина на аминированном Р-циклодекстрине и ОФА-БЬ-тирозина, ОФА-БЬ-фенилаланина, ОФА-метил-БЬ-триптофана на немодифицированном Р-циклодекстрине при содержании метанола в подвижной фазе 1020%. Видно, что с увеличением концентрации метанола удерживание всех производных уменьшается.

!пК'

0-1-1-,---г-

8 12 16 20 24 С(СН,ОН). 06.%

8 12 16 20 24 С(СН.ОН), об.%

А В

Рис. 2. Влияние концентрации метанола на удерживание А - ОФА-БЬ-тирозина (Ж), ОФА-ВЬ-фснилаланина (м), ОФА-ОЬ-лейцина (♦) на аминированном Р-циклодекстрине (250x4.6 мм); В - ОФА-БЬ-тирозина (А), ОФА-БЬ-фенилаланина (■), ОФА-метил-ОЬ-триптофана (♦) на Р-циклодекстрине (250x4.6 мм). Подвижная фаза метанол - ТЕАА 1% (рН 7.1).

Удерживание ОФА-ИЬ-тирозина на аминированном р-циклодекстрине заметно отличается от удерживания других ОФА-производных аминокислот, что обусловлено увеличением числа групп, способных к образованию водородных связей с аминогруппами на поверхности р-циклодекстрина. Следует отметить, что для обеих хиральных неподвижных фаз в изученном интервале концентраций метанола зависимость 1$>к' от концентрации

метанола линейна (коэффициент корреляции составляет 0.9994-0.9999). Линейность полученных зависимостей подтверждает обращенно-фазовый механизм удерживания на Р-циклодекстринах при элюированйи Сорбатов водно-органическими смесями.

В связи с тем, что гидрофобные взаимодействия играют определяющую роль в удерживании и хиральном распознавании на циклодекстриновых неподвижных фазах и важны при разделении энантиомеров на макроциклических антибиотиках, необходимо учитывать гидрофобность сорбатов при изучении закономерностей удерживания и механизмов энантиораспознавания.

Гидрофобность веществ принято оценивать при помощи параметров Ханша, представляющих логарифм константы распределения вещества в водно-органической системе. Константу распределения вещества, связанную со свободной энергией (A G) межфазного распределения, можно представить в виде суммы инкрементов «чистой гидрофобности» и «силы образования Н-связи»:

2,3 КТ

где m - число инертных фрагментов, не способных к образованию Н-связей, в молекуле тестируемого вещества, у - число фрагментов, образующих межмолекулярные Н-связи, , цн - химические потенциалы межфазного распределения соответствующих инертных и специфически взаимодействующих фрагментов.

В настоящей работе в качестве меры гидрофобности использовали значения коэффициентов распределения различных хиральных молекул между водой и н-октанолом (lgD) в зависимости от рН. Чем выше значение D, тем больше сродство молекулы к гидрофобному сорбенту. В действительности параметр lgP дает величину распределения нейтральной формы в системе октанол-вода, поэтому в ряде случаев lgP и максимальная величина lgD совпадать не будут, так как в lgD учитывается в какой форме при заданном рН находится соединение. Зависимость параметра -гидрофобности lgD от рН для некоторых соединений на рис. 3 и в табл. 2.

Для расчета lgD использована программа "© Advanced Chemistry Development Inc., 2001 г.".

_I __

А В

Рис. 3. Зависимость коэффициента распределения в системе октанол-вода от рН для А - рН КБЗ-БЬ-валина и В - ОФА-ВЬ-валина.

Таблица 2. Значения коэффициентов распределения различных производных ВЬ-валина в системе октанол-вода_

Вещество 12Р*

ДНП-ОЬ-валин 1.5210.39 1.51

Бензоил-ВЬ-валин 1.54±0.54 1.53

БОК-ВЬ-валин 2.20±0.52 -0.16

Фталил-ВЬ-валин 2.42±0.32 2.42

ДНФ-ВЬ-валин 2.56±0.38 2.50

КБЗ-ВЬ-валин 2.59±0.55 2.59

ОФА-ВЬ-валин 2.60±0.53 0.42

Дансил-ВЬ-валин 3.52±0.41 2.70

ФМОК-ВЬ-валин 4.4210.41 4.42

* - значение гидрофобности для нейтрального соединения;

** - максимальное значение гидрофобности в изученной области рН.

Полученные хроматографические данные показывают, что удерживание на ^модифицированном р-циклодекстрине растет с увеличением числа циклов в структуре сорбата и при наличии групп усиливающих п-к взаимодействия, в ряду (в скобках указаны значения ^Р):

ОФА-ВЬ-валин (2.60) < бензоил-ОЬ-валин (1.54) < фталил-ВЬ-валин (2.42) < ДНФ-ВЬ-валин (1.52) < ДНП-ВЬ-валин (2.56) < КБЗ-ВЬ-валин (2.59) < дансил-ВЬ-валин (3.52) < ФМОК-БЬ-валин (4.42)

Данный ряд подтверждает, что удерживание сорбатов зависит от гидрофобности модифицирующего агента, но в тоже время становится заметен вклад других взаимодействий - образование водородных связей, диполь-дипольпых и ионных взаимодействий. В связи с этим ряд гидрофобности не полностью соответствует порядку элюирования соединений. Присутствие электроноакцепторных групп в структуре модификатора увеличивает

удерживание сорбата, о чем свидетельствует сравнительно большое значение удерживания для ДНФ-ОЬ-валина. Небольшое удерживание ОФА-ОЬ-валина объясняется тем, что теоретическая величина шдрофобности равна 2.60, а практически максимальное значение составляет только 0.42.

Сравнивая удерживающую способность немодифицированного p-циклодекстрина и аминированного Р-циклодекстрина на примере дансил-, ДНП(ДНФ)-, ОФА-производных аминокислот, можно сказать, что она сопоставима. Изменение удерживания зависит от свойств модификатора: для дансил, КБЗ-производных оно несколько уменьшается, а для ДНП и ОФА - увеличивается. Вероятно, в удерживание сорбатов на аминированном Р-циклодекстрине, кроме вышеописанных гидрофобных взаимодействий, значительный вклад вносят электростатические взаимодействия ионизированных сорбатов и протонированных аминогрупп Р-циклодекстрина. Порядок элюирования производных аминокислот сохраняется. Удерживание изученных производных аминокислот на аминированном р-циклодекстрине растет в ряду (в скобках указаны значения lgP):

BOK-DL-валин (2.20) < ОФА-ОЬ-валин (2.60) < бензоил-БЬ-валин (1.54) < фталил-ОЬ-валин (2.42) < ДНФ-ОЬ-валин (1.52) < ДНП-БЬ-валин (2.56) < КБЗ-Ш,-валин (2.59) < дансил-DL-валин (3.52) < ФМОК-ОЬ-валин (4.42)

Небольшое удерживание EOK-DL-валина, так же как и ОФА-ПЬ-валина, показывает, что реальная величина гидрофобности в несколько раз отличается от рассчитанной для нейтральной молекулы (табл. 2).

В табл. 3 представлены хроматографические параметры для тех из изученных производных аминокислот, оптические изомеры которых удалось разделить на аминированном Р-циклодекстрине. На рис. 4 представлены хроматограммы разделения энантиомеров ДШ~№Ь-норлейцина на немодифицированном Р-циклодекстрине и искусственной смеси ОФА-ОЬ-тирозина на аминированном р-циклодекстрине.

Интересным результатом является разделение БОК-производных аминокислот на аминированном Р-циклодекстрине, что ранее было возможно только на гидроксипропильных производных p-циклодекстрина. Можно предположить, что такая особенность хиралыюй поверхности связана с появлением аминогруппы, взаимодействие сорбатов с которой вносит вклад в хиральное распознавание. На рис. 4 (С) показана хроматограмма энантиоразделения Б0К-Г\'-метил-01,-аланина.

Таблица 3. Хроматографические параметры разделения энантиоселективных производных аминокислот на аминированном р-циклодекстрине

Вещество Коэффициент емкости1 Коэффициент 1 Разрешение селективности | Эффективность2

Подвижная фаза: метанол/ТЕАА* (10/90)

КЕЗ-БЬ-аланин 5.67 1.13 1.01 4570

КБЗ-ВЬ-метионин 8.38 1.16 0.90 2260

КБЗ-ОЬ-норлейцин 6.88 1.16 0.98 2410

КБЗФЬ-лейцин 9.25 1.22 1.03 2700

КБЗ-ОЬ-валин 6.23 1.17 1.08 4550

Подвижная фаза: метанол/ТЕАА* (20/80)

КБЗ-ОЬ-фенилаланин 6.22 . 1.12 1.01 3020

КБЗ-ОЬ-тирозин 7.46 1.10 0.84 2880

КЕЗ-РЬ-триптофан 10.0 1.17 1.15 3240

Подвижная фаза: метанол/ТЕАА* (10/90)

Бензоил-ОЬ-валин 3.90 1.13 0.80 4710

Бензоил-ОЬ-фенилапанин 7.42 1.07 0.60 4310

Дансил-ОЬ-норлейцин 12.77 1.25 0.97 1400

Подвижная фаза: метанол/ТЕАА* (30/70)

Дансил-БЬ-лейцин 12.18 1.65 1.2 1000

Дансил-ОЬ-норвалин 6.29 1.12 0.7 2000

Дансил-ОЬ-валин 8.78 1.27 1.25 1820

Дансил-ОЬ-фенилаланин - 14.89 1.09 0.4 1520

ФМОК-ОЬ-валин 5.15 1.18 1.25 2660

ФМОК-ОЬ-лейцин 5.4 1.09 0.40 1780

Подвижная фаза: метанол/ТЕАА* *( 10/90)

ОФА-ОЬ-лейцин 5.78 , 1.16 0.95 2690

ОФА-БЬ-изолсйцин 8.11 1.32 1.50 2010

ОФА-ОЬ-норлейцин 4.87 1.08 0.60 4540

ОФА-ИЬ-треонин 1.91 1.19 1.30 4460

ОФА-БЬ- аспарагиновая кислота 7.63 1.20 0.70 2450

ОФА-ОЬ глутаминовая кислота 8.38 1.18 0.62 4160

Подвижная фаза: метанол/ТЕАА** (20/80)

ОФА-БЬ- фенилаланин 4.21 1.37 1.57 2320

ОФА-ОЬ-тирозин 6.99 1.50 2.41 3100

Продолжение табл. 3

Вещество Коэффициент емкости1 Коэффициент Разрешение Эффективность2

селективности

Подвижная фаза: метанол/ТЕДА* (20/80)

Фталил-ЭЬ-валин 5.85 1.13 0.60 720

ДНФ-БЬ-норвалин 8.97 1.08 0.71 2800

ДИФ-БЬ-метионин 10.17 1.07 0.69 2710

ДИФ-БЬ-этионин 12.12 1.08 0.67 2820

ДНФ-БЬ-норлейцин 9.63 1.08 0.82 3340

ДИФ-РЬ-цитрулин 6.86 1.08 0.79 1830

ДНП-Ш.-лейцин - 4.74 1.16 1.31 3120

Подвижная фаза: метанол/ТЕАА* (5/95)

БОК-БЬ-триптофан 9.47 1.12 0.50 780

БОК-ЭЬ- 6.18 1.24 0.95 1190

фенилаланин -

БОК-метилФЬ- 4.65 1.18 0.60 1520

фенилаланин

БОК-ОЬ-валин 3.69 1.19 0.75 1400

БОК-ВЬ-аланин 4.22 1.24 0.9 1280

БОК-метил-БЬ- 3.01 1.37 0.92 1310

аланин

Б0К-фенил-01> : 5.99 1.22 0.9 1390

алапин

1 - коэффициент емкости для первого элюируемого энантиомера;

2 - число теоретических тарелок на метр; * - 1% ацетат триэтиламина, рН 4.1;

** - 1% ацетат триэтиламина, рН 7.0.

Анализ экспериментальных данных показывает, что в отличие от немодифицированного Р-циклодекстрина коэффициенты емкости и разрешение на аминированном Р-циклодекстрине зависят от структуры аминокислоты, кроме гидрофобных и я-я взаимодействий значительный вклад в удерживание вносят электростатические взаимодействия ионизированных сорбатов и протонированных аминогрупп Р-циклодекстрина.

Следует отметить, что аминированном Р-циклодекстрине спектр разделяемых соединений по сравнению с немодифицированным р-циклодекстрином значительно расширяется. Полученные результаты, позволяют сделать вывод, что предложенный в качестве новой хиральной неподвижной фазы аминированный Р-циклодекстрин является селективным для разделения энантиомеров производных аминокислот.

]к),0С2 А

]о,В2А

20 ! р,мин

Рис. 4. Хроматограмма энантиоразделепия А - ДНП-ОЬ-норлейцина, колонка "Сус1оЬогк1 2000" (250x4.6 мм), подвижная фаза метанол/ТЕАА 1% (рН 4.1) (20/80) (Я,=254 нм); В - искусственной смеси ОФА-П-тирозина и ОФА-Ь-тирозина, колонка аминированный р-циклодекстрип (250x4.6 мм), подвижная фаза метанол/ТЕАА 1% (рН 7.1) (20/80) (>.=254 нм); С - БОК-метил-ОЬ-аланина. Колонка аминированный р-циклодекстрин (250x4.6 мм). Подвижная фаза метанол/ТЕАА 1% (рН 4.1) (5/95) (Х=230 нм). Скорость потока 1 мл/мин.

В работе изучены хиральные неподвижные фазы на основе макроциклических антибиотиков тикопланин ("Chirobiotic Т", "Chirobiotic Tag") и ванкомицин ("Chirobiotic V") для разделения оптических изомеров производных аминокислот с различными модификаторами (табл. 1) и выбраны условия разделения.

Анализ полученных данных показывает, что удерживание сорбатов растет с увеличением числа циклов и при наличии акцепторных заместителей в структуре модификатора аминокислоты для колонок "Chirobiotic Т", "Chirobiotic Tag", "Chirobiotic V" в ряду (в скобках указаны значения lgP):

бензоил-ОЬвалин (1.54) < ОФА-БЬ-валин (2.60) < фталил-ОЬвалин (2.42) < КБЗТЭЬвалин (2.59) < ДНФ-ОЬ-валин (1.52) < ДНП-БЬ-валин (2.56) < дансил-БЬ-валин (3.52) < ФМОК-DL-валин (4.42)

Как видно из полученных рядов, удерживание не так строго коррелируется с гидрофобностью производных аминокислот, но тем не менее гидрофобность сорбатов играет одну из первостепенных ролей в удерживании дансил- и ФМОК-производных. Множество потенциальных центров на поверхности макроциклического антибиотика способны взаимодействовать с молекулой сорбата по различным механизмам, определяя удерживание и энантиоразделение.

На колонке "Chirobiotic Г' удалось успешно разделить 39 производных аминокислот, из них 32 с Rs>1.5, колонка "Chirobiotic Tag" оказалась селективна к 18 энантиомерам производным аминокислот, 16 из них были разделены с Rs>1.5, колонка "Chirobiotic V" проявила хиральную селективность к 20 производным, и разделение в большинстве случаев неполное (Rs<1.5). Полученные результаты хроматографического разделения позволяют сделать вывод, что предложенные антибиотиковые хиральные неподвижный фазы "Chirobiotic Т", "Chirobiotic Tag" и "Chirobiotic V" энантиоселективны по отношению к производным аминокислотам. Примеры хроматограмм приведены на рис. 5.

Показано, что наиболее успешными хиральными селекторами для разделения производных аминокислот являются "Chirobiotic Т" и аминированный p-циклодекстрин, по количеству разделений, но эффективность разделения на аминированном р-циклодекстрине меньше и в ряде случаев не достаточна, чтобы разделение изомеров было полным.

0.002 А

J0.02A

J 0.002 А

1,,«ин

20 tR.MHH

0 • 20 tp.MHH С

Рис. 5. Хроматограмма энаитиоразделения А - КВЗ-ПЬ-триптофана, колонка "Chirobiotic Т" (250x4.6 мм), подвижная фаза: метанол -ТЕАА 1% (рН 4.1) (20/80); В - бснзоил-Ш.-аланина, колонка "Chirobiotic Tag" (250x4.6 мм), подвижная фаза метанол/ТЕАА 1% (рН 4.1) (20/80); С - КБЗ-ОЬ-аЛанина, колонка "Chirobiotic V" (250x4.6 мм), подвижная фаза ацетонитршт/ТЕАА 1% (рН 4.1) (5/95). Скорость потока 1 мл/мин, Х=254 нм.

Разделение оптических изомеров аминокислот

Проведенные исследования на аминированном р-циклодекстрине показали, что соэффициенты емкости аминокислот практически равны нулю и говорить о хиральной :елективности данной неподвижной фазы затруднительно.

На ^модифицированном Р-циклодекстрине ("Сус1оЪопс1 2000") было изучено сдерживание и энантиоразделение двенадцати аминокислот. Из исследованных аминокислот 'далось разделить оптические изомеры лишь четырех: треонина, серина, аспарагиновой и 'лутаминовой кислот. Примеры хроматограмм показаны на рис. б.

О 01 А

0 02 А

. МИН

6 1н , мин

'ис. 6. Хроматограмма энантиоразделения А - глутаминовой кислоты, В - треонина. Солонка "Сус1оЬопс1 2000" (250x4.6 мм). Подвижная фаза: ацетонитрил/ТЕАА 0.1% (рН 4.5) 10:90). Скорость потока 1 мл/мин, >.=230 нм.

Одним из неоспоримых достоинств макроциклических антибиотиков является озможность разделения аминокислот без предварительной дериватизации. В связи со ложной структурой поверхности можно предположить, что различия в энергиях заимодействия между Б- и Ь-формами аминокислот и хиральной поверхностью :еподвижной фазы настолько велики, что изменение ионной силы, рН и концентрации рганического растворителя в подвижной фазе слабо влияют на хиральную селективность орбента.

В работе было изучено удерживание и разделение оптических изомеров аминокислот а хиральных неподвижных фазах с антибиотиком тикопланин ("СЫгоЫоПс Т", "СЫгоЫоНс а£") и антибиотиком ванкомицин ("СЫгоЫоис V") при использовании в качестве одвижных фаз смесей ацетонитрила, метанола, этанола, изопропанола и буферного аствора ацетата триэтиламина или воды.

Оказалось, что колонка "СЫгоЫойс V" не селективна к Б-, Ь-изомерач аминокислот. Сравнение экспериментальных хроматографических данных, полученных на "СЫгоЫоис Т"

при использовании подвижных фаз с различным содержанием ацетонитрила показывает, чт уменьшение содержания органического компонента в интервале от 2 до 20 % приводит ; небольшому увеличению времен удерживания и практически не влияет на селективност: разделения и эффективность колонки. Хроматограммы на рис. 7 демонстрируют даннук зависимость. Подвижная фаза с содержанием ацетонитрила 5% является оптимальной Хроматографические параметры разделения энантиомеров представлены в табл. 4.

0,1 А

-J

10 tR , мин

a t„. мин

А В

Рис. 7. Хроматограмма энантиоразделения триптофана. Колонка "СЫгоЫоПс Т" (250x4.6 мм). Подвижная фаза: ацетонитрилЯЕАА 0.1% (рН 4.5) А - (10:90) В - (5:95). Скорость потока 1 мл/мин, Я.=230 нм.

Разница в структурах макроциклических антибиотиков "Chirobiotic Т" и "Chirobiotic

Tag" может значительно сказываться на хиральной способности колонок. С точки зрения

хирального распознавания, остатки Сахаров молекулы тикопланина могут влиять на процесс

хирального распознавания по меньшей мере тремя путями: (1) создавая стерические помехи,

в этом случае остатки Сахаров занимают центры хирального распознавания, что лимитирует j 1 ■ ■ . . ■ ■ ■ доступ других молекул; (2) блокируя возможные центры взаимодействия агликона, т.к. два

остатка сахара связаны посредством фенольных гидроксильных групп и третий через остаток

спирта; (3) являясь альтернативными центрами взаимодействия, в связи с тем, что три

остатка Сахаров сами являются хиральными и имеют собственные гидроксильные, эфирные

и амидо функциональные группы. Это можно продемонстрировать на примере разделения

ДОФА на "Chirobiotic Т" и "Chirobiotic Tag" (рис. 8). Было достоверно определено, что

гидроксильные группы ароматического кольца ДОФА взаимодействуют с гидроксильной

группой агликона тикопланина, которая прежде была занята остатком сахара в молекуле

тикопланина. Это взаимодействие улучшает энантиораспознавание ДОФА.

"аблица 4. Хроматографические параметры разделения изомеров аминокислот на ¡акроциклическом антибиотике "СЫгоЫойс Т". Подвижная фаза: ацетонитрил/ТЕАА* (5/95)

Вещество Коэффициент емкости1 Коэффициент селективности Разрешение Эффективность2

>енилаланин 0.78 1.09 0.69 26300

(алин 0.42 1.10 0.40 20050

[ОФА 0.57 1.29 1.57 22300

'риптофан 1.26 1.17 1.47 24210

[орвалин 0.44 1.34 1.40 13350

фГИНИН 0.35 1.11 0.45 18300

[золейцин 0.51 1.20 1.16 22860

[зосерин 0.34 1.19 0.63 11560

[ейцин 0.52 1.29 1.45 22620

1етионин 0.54 1.28 1.80 29130

ьчанин 0.35 1.16 0.93 32300

ирозин 0.61 1.10 0.54 15300

хпарагин 0.35 1.11 0.52 16480

.спарагиновая '.ислота 0.40 4.85 8.70 12850

[изин 0.44 3.10 5.83 8760

лутаминовая 'ислота 0.36 3.04 7.30 18500

- 0.1% ацетат триэтиламина, рН 4.5;

- коэффициент емкости для первого элюируемого энантиомера;

- число теоретических тарелок на метр.

J0.01A

40 t.h

J0.01A

10 t, НИН

А В

ис. 8. Хроматограмма энантиоразделения ДОФА. А - колонка "Chirobiotic Tag" ¡50x4.6 мм), подвижная фаза: метанол/ТЕАА 0.1% (рН 4.5) (20/80); В - колонка Chirobiotic Г' (250x4.6 мм), подвижная фаза: этанол/вода (50/50). Скорость потока 1 л/мин, Х=230нм.

Разделение изомеров N-гидроксипропиламинов

В работе было изучено удерживание и разделение p-блокаторов на "колонках с антибиотиковыми хиральными неподвижными фазами "Chirobiotic Т", "Chirobiotic Tag" и "Chirobiotic V": пропранолола, метопролола, атенолола, алпренолола, окспренолола, адебутолола, пиндолола, лабеталола, надолола при использовании подвижных фаз метанола с добавкой уксусной кислоты/триэтиламина и ацетонитрила с добавкой изопропанола и уксусной кислоты/триэтиламина. Наиболее селективными по отношению к р-блокаторам оказались колонки "Chirobiotic Т" и "Chirobiotic V". Примеры хроматограмм разделения р-блокаторов показаны на рис. 9.

Jo,01А i=

tp.NUH

t niмин

Рис. 9. Хроматограмма энантиоразделения А - метопролола, колонка "СЫгоЫоис Т" (250x4.6 мм), подвижная фаза метанол/уксусная кислота/триэтиламин (100/0.3/0.2); В -пропранолола, колонка "СЫгоЫоис V" (250x4.6 мм), подвижная фаза метанол/уксусная кислота/триэтиламин (100/0.1/0.1). Скорость подвижной фазы 1.0 мл/мин, Х=254 нм.

Разделение биогенных аминов и аминоспиртов

Биогенные амины и аминоспирты играют большую роль в метаболических процессах в организме, имеют широкое применение в медицине и фармакологии и являются одним из важнейших классов хиральных соединений.

В работе было изучено энантиоразделение биогенных аминов и аминоспиртов: адреналина, норадреналина, эфедрина, амфетамина, серотонина, креатинина, гистамина, а-фенилэтиламина на колонках "СЫгоЫо1к V" и "СЫгоЫоПс Т". Колонки "СЫгоЫоис V" и

"СЫгоЫойс Т" проявляют энантиоселективность к различным соединениям. Для разделения адреналина и эфедрина эффективнее использовать колонку "СЫгоЫойс Т", а для разделения амфетамина и а-фенилэтиламина - "СЫгоЫоПс V". Примеры хроматограмм разделения представлены на рис.10.

Рис. 10. Хроматограмма рацемической смеси А - эфедрина, колонка "Chirobiotic Т" (250x4.6 мм), подвижная фаза: ацетонитрил/ТЕАА 0.1% (рН 4.1) (95:5), В - адреналина, колонка :<Chirobiotic Т» (250x4.6 мм), подвижная фаза: этанол/вода (50/50). Скорость потока 1мл/мин, \.=254 нм.

Определение оптической чистоты соединений

Были исследованы коммерчески доступные препараты D- и L-метионина, D-гриптофана, рацемической смеси тирозина и D-тирозина. Хроматограммы D-триптофана и D-летионина показаны на рис. 11. По хроматограммам рассчитано относительное процентное удержание изомеров. Полученные данные приведены в табл. 5.

'ие. И. Хроматограмма А - 1)-триптофана, В - О-метионина. Колонка "СЫгоЫойс Т" 250x4.6 мм). Подвижная фаза: ацетонитрил/ТЕАА 0.1% (рН 4.1) (10: 90). Скорость потока . мл/мин, детектор - амперометрический, потенциал рабочего электрода 1300 мВ.

Таблица 5. Определение содержание примеси оптических изомеров в коммерческих препаратах некоторых аминокислот. (п=3, Р=0.95)__

Анализируемая аминокислота Время удерживания, мин Содержание примеси, %

П-триптофан 10.8 0.45±0.05

Б-ме-тонин 6.9 <0.05

Ь-метионин 5.8 0.15±0.04

Б-тирозин 10.5 7.77±0.08

Было проведено хроматографическое разделение оптических изомеров атенолола фирм «Скопинфарм» (Россия) и «Нортон» (Великобритания), которое составило (81±3) % и (65 ±3) %; соответственно. Было определено содержание атенолола в препаратах. Хроматограммы представлены на рис. 12. Содержание ^-изомера в препарате фирмы «Скопинфарм» (Россия) составляет (48 ± 2) %, Л-изомера (52 ± 2) %\ фирмы «Нортон» (Великобритания): 5-изомер - (48 ± 2) %,;й-изомер - (52.3 ± 0.3) %.

Как видно из полученных данных, соотношение цена/качество двух протестированных препаратов оказалось в пользу российской фирмы «Скопинфарм».

А В

Рис. 12. Хроматограмма разделения атенолола препарата А - фирмы «Скопинфарм», В -фирмы «Нортон». Колонка "СЫгоЫоис Г' (250x4.6 мм). Подвижная фаза: метанол/уксусная кислота/триэтиламин (100/0.2/0.3). Скорость потока 0.5 мл/мин, >.=270 нм.

ВЫВОДЫ

1. Показана возможность хирального распознавания энантиомеров 39 производных аминокислот на новом хиральном селекторе - аминированном р-цикло'декстрине.

2. Построены зависимости коэффициента распределения производных аминокислот в системе октанол-вода от рН. Показано, что удерживание и энантиоселективность

производных аминокислот на циклодекстриновых неподвижных фазах зависит от параметра гидрофобности изученных соединений и природы остатка аминокислоты.

!. Сопоставлены энантиоселективность и эффективность хроматографического разделения производных аминокислот в обращенно-фазовом и полярно-органическом режимах жидкостной хроматографии на циклодекстриновых неподвижных фазах. Показано, что эффективность разделения выше в полярно-органическом режиме.

L Показана возможность энаитиоразделения треонина, серина, аспарагиновой и глутаминовой кислот на колонке с ^модифицированным циклодестрином "Cyclobond 2000". Установлено, что разделение происходит благодаря наличию полярных групп в структуре аминокислот, которые обладают способностью к образованию водородных связей с гидроксильными группами поверхности ß-циклодекстрина.

'<. Исследовано хроматографическое поведение оптических изомеров производных аминокислот и недериватизированных аминокислот на махроциклических антибиотиках. Установлено, что удерживание и энантиоселективность определяется гидрофобными, я-л взаимодействиями и образованием водородных связей. Показано, что колонка на основе тикопланина наиболее селективна по отношению к производным аминокислотам, а колонка на основе тикопланина агликона - к недериватизированным аминокислотам.

. Выбраны условия разделения N-гидроксипропиламинов на циклодекстриновых и антибиотиковых неподвижных фазах в полярно-органическом режиме: пропранолола, метопролола, атенолола, алпренолола, окспренолола, ацебутолола, пиндолола, лабеталола, надолола.

. Определены условия разделения смесей биогенных аминов и аминоспиртов на колонках с различными неподвижными фазами и некоторых их энантиомеров на колонках с макроциклическими антибиотиками.

. Проведена апробация методики определения оптической чистоты и энантиомерного состава коммерчески доступных лекарственных форм и химических препаратов аминокислот.

Автор выражает искреннюю благодарность д.х.н., проф. В.А. Даванкову за научные консультации, к.х.н. E.H. Мышак за помощь в проведении экспериментальных расчетов

параметра гидрофобности, сотрудникам Центра «Биоинженерия» РАН д.х.н., проф. В.П. Варламову и к.х.н. С.А. Лопатину за предоставленный сорбент - аминированный ß-

циклодекстрин.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Ананьева И.А., Шаповалова E.H., Иванов A.A., Шпигун O.A., Армстронг Д.В. VII Использование хроматографических методов для определения и разделения биогенных аминов. / Материалы Международной научно-технической конференции «Высокие технологии в промышленности России». Москва. 2001. С. 158-162.

2. Ананьева И.А., Шаповалова E.H., Лопатин С.А., Шпигун O.A., Варламов В.П., Даванков

B.А. Разделение производных энантиомеров аминокислот на .шинированном ß-циклодекстрине методом высокоэффективной жидкостной хроматопифии. // Вестник МГУ. Сер. 2. Химия. 2001. Т. 42 . №4. С. 273-277.

3. Ананьева И.А., Шаповалова E.H., Шпигун O.A., Армстронг Д.В. Разделение оптически активных аминокислот и изомеров их производных на макроциклическом антибиотике «Тикопланин». // Вестник МГУ. Сер. 2. Химия. 2001. Т. 42 . №4. С. 278-280.

4. Лопатин С.А., Папков В.А., Ананьева И.А., Шаповалова E.H., Варламов В.П., Шпигун O.A., Даванков В.А. Перацетиламино- и пераминоциклодекстрины как циклические аналоги хитина и хитозана. / Материалы VI Международной конференции «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана». Москва - Щелково. 2001. 22-24 октября.

C. 300-303.

5. В.А.Ананьева И.А., Пешкова Е.А., Шаповалова E.H., Лопатин С.А., Шпигун O.A., Варламов В.П., Даванков В.А. Изучение адсорбции хитозана на поверхности силикагеля и сверхсшитого полистирола. / Всероссийский симпозиум по химии поверхности, адсорбции и хроматографии. Москва. 1999. Апрель. С. 72.

6. Ананьева И.А., Буданова Н.Ю., Шаповалова E.H., Лопатин С.А., Шпигун O.A., Варламов В.П., Даванков В.А. Оценка хроматографических свойств силикагеля, модифицированного хитозаном и его производными. / Всероссийская конференция «Химический анализ веществ и материалов». Москва. 2000. Апрель. С. 378-379.

7. Shapovalova E.N, Ananieva I.A., Chernobrovkin M.G., Budanova N.Yu., Shpigun O.A. Chitosan-coated silica as a support for the separation of amines and aminoacids. / 10th Russian-Japan Joint Symposium on Analytical Chemistry». Moscow - St.Petersburg. 2000. August. P. 132.

8. Ананьева И.А., Шаповалова E.H., Лопатин С.А., Шпигун O.A., Варламов В.П., Даванков В.А. Разделение энантиомеров производных аминокислот на аминированном ß-циклодекстрине. / IX Международная конференция по теоретическим вопросам адсорбции и адсорбционной хроматографии «Современное состояние и перспективы развития теории адсорбции». Москва. 2001. 24-28 апреля. С. 180.

i. Ананьева И.А., Шаповалова Е.Н., Шпигун О.А., Армстронг Д.В. Изучение разделения отнчески активных веществ на Р-циклодекстрине. / IX Международная конференция по теоретическим вопросам адсорбции и адсорбционной хроматографии «Современное состояние и перспективы развития теории адсорбции». Москва. 2001. 24-28 апреля. С. 181.

0. Ananieva I.A., Davankov V.A., Armstrong D.W. Study of the enantioresolution of native amino acids and derivatized amino acids on macrocyclic antibiotics. / 13lh International Symposium "Chirality 2001". Orlando. Florida. USA. 2001. July 15-18. P. 72.

1. Shpigun O.A., Spivakov B.Ya., Davankov V.A., Shapovalova E.N., Ananieva I.A., Budanova N.Yu.. Armstrong D.W. Separation of some biologically active amines and acids by HPLC and CE. / International Congress on Analytical Sciences. 2001. August 6-10. P. 198.

2. Ananieva I.A.. Shapovalova E.N., Lopatin S.A., Shpigun O.A.. Varlamov V.P., Davankov V.A., Armstrong D.W. Study of the separation of amino acid derivative enantiomers on amino-p-cyclodextrin. / International Congress on Analytical Sciences. 2001. August 6-10. P. 308.

3. Ananieva I.A., Shapovalova E.N., Shpigun O.A., Davankov V.A., Armstrong D.W. Determination of biogenic amines by high-performance liquid chromatography/ / lllb International Symposium '"Advanced and Application of Chromatography in Industry" . Bratislava. Slovak Republic. 2001. August 27-31. B02.

4. Ananieva I.A., Shapovalova E.N., Shpigun O.A., Davankov V.A., Armstrong D.W. Study of enantiomers resolution on macrocyclic antibiotics. / 2nd International Symposium "Separation in Biosciences". Prague. Czech Republic. 2001. September 17-20. P. 48.

5. Ананьева И.А.. Шаповалова E.H., Шпигун O.A., Даванков В.А., Армстронг Д.В. Изучение разделения энантио.черов аминокислот и их производных на макроциклических антибиотиках. / VIII Всероссийский симпозиум по молекулярной хроматографии и капиллярному электрофорезу. Москва. 2001. 15-19 октября. С. 13.

6. Ананьева И.А., Савченкова J1.B., Шаповалова Е.Н., Шпигун О.А. Разделение биогенных аминов на макроциклических антибиотиках. / VIII Всероссийский симпозиум по молекулярной хроматографии и капиллярному электрофорезу. Москва. 2001. 15-19 октября. С. 62.

Отпечатано на ризографе в ОНТИГЕОХИРАН Тираж 100 экз.

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Ананьева, Ирина Алексеевна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Теория хирального хроматографического разделения оптических изомеров

1.1. Координационные комплексы с переходными металлами

1.2. Комплексы с переносом заряда

1.3. Ком плексы включения

1.4. Хиральные неподвижные фазы на основе полисахаридов и их производных

1.4.1. Оптимизация условий разделения оптических изомеров на циклодекстриновых фазах

1.4.1.1. Разделение в обращенно-фазовом варианте жидкостной хроматографии

1.4.1.2. Разделение в нормально-фазовом варианте жидкостной хроматографии

1.4.1.3. Разделение в полярно-органическом варианте жидкостной хроматографии

1.4.2. Целлюлоза и ее производные

1.4.3. Хитозан и его производные

1.5. Антибиотики как новый класс хиральных селекторов

1.5.1. Механизмы удерживания и разделения

1.5.2. Выбор подвижной фазы

1.5.3. Разделение в обращенно-фазовом варианте жидкостной хроматографии

1.5.4. Разделение в полярно-органическом варианте жидкостной хроматографии

1.5.5. Разделение в нормально-фазовом варианте жидкостной хроматографии

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. Исходные вещества, аппаратура, методика эксперимента

2.1. Исходные реактивы и растворы

2.2. Получение производных аминокислот с о-фталевым альдегидом

2.3. Аппаратура, сорбенты и подвижные фазы

2.4. Методика хроматографического эксперимента

Глава 3. Разделение оптических изомеров производных аминокислот

3.1. Разделение на Р-циклодекстринах

3.1.1. Выбор условий разделения

3.1.2. Влияние фактора гидрофобности на удерживание и энантиоразделение на циклодекстриновых хиральных неподвижных фазах

3.1.3. Влияние природы модификатора аминокислоты на удерживание и селективность разделения

3.1.4. Влияние природы аминокислоты на удерживание и селективность

разделения

3.2. Разделение на макроциклических антибиотиках

Глава 4. Разделение оптических изомеров аминокислот

4.1. Разделение на (3-циклодекстринах

4.2. Разделение на макроциклических антибиотиках

4.3. Определение оптической чистоты аминокислот

Глава 5. Разделение изомеров ароматических N-гидроксипропиламинов

5.1. Разделение на Р-цикло декстринах

5.2. Разделение на макроциклических антибиотиках

5.3. Определение энантиомерного состава препаратов атенолола

Глава 6. Разделение биогенных аминов и аминоспиртов

6.1. Методы разделения биогенных аминов

6.2. Достижения в разделении оптических изомеров биогенных аминов

6.3. Разделение биогенных аминов

6.4. Разделение оптических изомеров биогенных аминов

Введение диссертация по химии, на тему "Высокоэффективная жидкостная хроматография оптически активных азотсодержащих соединений"

Актуальность темы. Оптически активные соединения играют исключительно важную роль во многих биохимических процессах, их определение имеет принципиальное значение для аналитической химии, теоретической органической химии, медицины, фармакологии. Контроль оптической чистоты производимых лекарственных средств в настоящее время введен во всех промышленно развитых странах. Именно высокоэффективная жидкостная хроматография позволяет решить сложнейшие проблемы анализа энантиомерного состава хиральных соединений, препаративного получения оптически чистых изомеров различных классов соединений. Хроматографическое разделение энантиомеров принципиально возможно только в системах, содержащих хиральный селектор, призванный распознавать пространственную конфигурацию двух идентичных по всем своим физическим и химическим свойствам изомеров. В связи с этим все сильней возрастает интерес к разработке новых хиральных селекторов.

Вследствие сложности явления хирального распознавания «универсального» сорбента, который бы позволил решить все проблемы разделения оптических изомеров не существует, каждый сорбент имеет свои преимущества, свою область применения, свои недостатки. Для создания эффективных хромагографических методов разделения энантиомеров необходимо более углубленное изучение процессов хирального распознавания энантиомеров. Весьма перспективны для создания хиральных неподвижных фаз полисахариды и, в частности, Р-циклодекстрин и его производные. Важным достижением в создании новых хиральных селекторов было открытие макроциклических антибиотиков, которые предоставляют широкие возможности для разделения различных классов энантиомеров благодаря сложному механизму хирального распознавания на хиральной поверхности.

Актуальна проблема разделения энантиомеров аминокислот, играющих важную роль в процессах питания и входящих в состав белков в организме человека.

Определение и разделение биогенных аминов, аминоспиртов и их энантиомеров, которые участвуют в метаболических процессах в организме и используются как лекарственные препараты, является одной из наиболее важных задач в биохимии. В ряде случаев оптические изомеры не могут быть разделены прямым путем и их переводят в форму производных.

Важность разделения энантиомеров фармацевтических препаратов, таких как р-блокаторы, связана с тем, что они обладают различным фармакологическим действием в биологических системах.

Цель работы: изучение закономерностей хроматографического поведения и выбор условий разделения энантиомеров аминокислот с предварительной дериватизацией и без нее, биогенных аминов, аминоспиртов и 14-гидроксипропиламинов на хиральных неподвижных фазах и разделение биогенных аминов и аминоспиртов на различных неподвижных фазах. Для достижения этой цели были решены следующие задачи: изучена возможность хирального распознавания различных классов энантиомеров на новом хиральном селекторе - аминированном р-циклодекстрине в обращенно-фазовом и полярно-органическом режимах жидкостной хроматографии; изучены особенности хроматографического удерживания и энантиоразделения производных аминокислот на циклодекстриновых и антибиотиковых неподвижных фазах; установлена корреляция хроматографических параметров с параметром гидрофобности производных аминокислот на циклодекстриновых и антибиотиковых неподвижных фазах;

- изучены особенности разделения 1М-гидроксипропиламинов, биологически активных аминов и аминоспиртов; выбраны условия использования различных хиральных селекторов для определения оптической чистоты коммерчески доступных лекарственных форм и химических препаратов аминокислот.

Предложен новый хиральный селектор - аминированный р-цикл о декстрин.

Показано, что аминированный р-цикл о декстрин в отличие от немодифицированного Р

• / циклодекстрина проявляет селективность к энантиомерам Ы4е.й-бутокси- карбонил- ^ производным (БОК) аминокислот.

Сопоставлена распознавательная способность хиральных сорбентов на основе макроциклических антибиотиков. Исследовано влияние различия в структурах тикопланина и тикопланина агликона на энантиоселективность неподвижной фазы.

Найдены условия хроматографического разделения энантиомеров некоторых биогенных аминов и аминоспиртов, а также их смесей.

Практическая значимость работы. Получены данные по разделению энантиомеров производных аминокислот и самих аминокислот на колонках с немодифицированным Р-циклодекстрином, аминированным р-циклодекстрином и макроциклическими антибиотиками.

Результаты изучения энантиоразделения аминокислот на макроциклических антибиотиках позволили выбрать условия разделения энантиомеров аминокислот и определения оптической чистоты продажных реактивов. Найдены условия хроматографического определения и разделения лекарственного препарата адреналина. Р-блокатора атенолола, химических препаратов аминокислот и их оптической чистоты.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Данные по изучению хроматографического поведения энантиомеров производных аминокислот на циклодекстриновых неподвижных фазах в обращенно-фазовом и полярно-органическом режимах жидкостной хроматографии. Результаты сопоставления разделения энантиомеров производных аминокислот на немодифицированном Р-циклодекстрине и аминированном Р-циклодекстрине.

3. Закономерности энантиоразделения аминокислот на антибиотиковых хиральных неподвижных фазах.

5. Выбор условий разделения энатиомеров Р-блокаторов, биогенных аминов, аминоспиртов и их смесей.

6. Условия определения оптической чистоты некоторых соединений.

Апробация работы. Основное содержание работы изложено в 16 публикациях. Результаты исследований докладывались на «Всероссийском симпозиуме по химии поверхности, адсорбции и хроматографии (Москва, 1999 г.), Всероссийской конференции «Химический анализ веществ и материалов» (Москва. 2000 г.), «10th Russian-Japan Joint Symposium on Analytical Chemistry» (Moscow - St.Petersburg., 2000), IX Международной конференции по теоретическим вопросам адсорбции и адсорбционной хроматографии «Современное состояние и перспективы развития теории адсорбции» (Москва, 2001 г.), IIV Международной научно-технической конференции «Высокие технологии в промышленности России» (Москва, 2001 г.), 13th International Symposium "Chirality 2001" (Orlando, Florida, USA, 2001), International Congress on Analytical Sciences (Tokyo, Japan, 2001), 11th International Symposium "Advanced and Application of Chromatography in Industry" (Bratislava, Slovak Republic, 2001), 2nd International Symposium "Separation in Biosciences" (Praha, Czech republic, 2001), VIII Всероссийском симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии и капиллярному электрофорезу (Москва, 2001 г.), VI Международной конференции «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана» (Москва, 2001 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 4 статьи и 12 тезисов докладов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме "Аналитическая химия"

выводы

1. Показана возможность хнрального распознавания энантиомеров 39 производных аминокислот на новом хиральном селекторе - аминированном Р-цикл о декстрине.

2. Построены зависимости коэффициента распределения производных аминокислот в системе октанол-вода от рН. Показано, что удерживание и энантиоселективность производных аминокислот на циклодекстриновых неподвижных фазах зависит от параметра гидрофобности изученных соединений и природы остатка аминокислоты.

3. Сопоставлены энантиоселективность и эффективность хроматографического разделения производных аминокислот в обращенно-фазовом и полярно-органическом режимах жидкостной хроматографии на циклодекстриновых неподвижных фазах. Показано, что эффективность разделения выше в полярно-органическом режиме.

4. Показана возможность энантиоразделения треонина, серина, аспарагиновой и глутаминовой кислот на колонке с немодифицированным циклодестрином "Сус1оЬопс1 2000". Установлено, что разделение происходит благодаря наличию полярных групп в структуре аминокислот, которые обладают способностью к образованию водородных связей с гидроксильными группами поверхности [}-циклодекстрина.

5. Исследовано хроматографическое поведение оптических изомеров производных аминокислот и недериватизированных аминокислот на макроциклических антибиотиках. Установлено, что удерживание и энантиоселективность определяется гидрофобными, п-п взаимодействиями и образованием водородных связей. Показано, что колонка на основе тикопланина наиболее селективна по отношению к производным аминокислотам, а колонка на основе тикопланина агликона - к недериватизированн ым аминокислотам.

6. Выбраны условия разделения >1-гидроксипропиламинов на циклодекстриновых и антибиотиковых неподвижных фазах в полярно-органическом режиме: пропранолола, метопролола, атенолола, алпренолола, окспренолола, ацебутолола, пиндолола, лабеталола, надолола.

7. Определены условия разделения смесей биогенных аминов и аминоспиртов на колонках с различными неподвижными фазами и некоторых их энантиомеров на колонках с макроциклическими антибиотиками.

8. Проведена апробация методики определения оптической чистоты и энантиомерного состава коммерчески доступных лекарственных форм и химических препаратов аминокислот.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Ананьева, Ирина Алексеевна, Москва

1. Даванков В.А. Хиральные органоминеральные сорбенты в хроматографии энантиомеров и в асимметрическом катализе.// Журн. ВХО им. Менделеева. Т. 34. №3. С. 377-385.

2. Davankov V.A. The nature of chiral recognition: is it a three-point interaction?// Chirality. 1997. V. 9. P. 99-102.

3. Booth T.D., Wahnon D., Wainer I.W. Is chiral recognition a three point process.// Chirality. 1997. V. 9. P. 96-98.

4. Алленмарк С. Хроматографическое разделение энантиомеров. М.: Мир, 1991. 268 с.

5. Armstrong D.W. Optical isomer separation by liquid chromatography.// Anal. Chem. 1987. V. 59. №3. P. 84-91.

6. Armstrong D.W. The evolution of chiral stationary phases for liquid chromatography.// LC-GC current issues in HPLC technology. 1997. May. P. 20-28.

7. Fornstedt Т., Sajonz P., Guiochon G. A closer study of chiral retention mechanisms.// Chirality. 1998. V. 10. P. 375-381.

8. Hesse G., Hegel R. Eine vollstandigle racemattrennung durch elution-chromatographie an cellulose triacetate.// Chromatographia. 1973. V. 6. №6. P. 277-280.

9. Francotte E., Wolf R.M., Lohman D.J. Chromatographic resolution of racemates on chiral stationary phases; Influence of the supramolecular structure of cellulose triacetate.// J. Chromatogr. 1985. V. 347. №1. P. 25-37.

10. Armstrong D.W., Berthod A., Chang S. Empirical procedure that uses molecular structure to predict enantioselectivity of chiral stationary phases.// Anal. Chem. 1992. V. 64. P. 395-404.

11. Cyclobond Handbook. Advanced Separation Technologies Inc. Whippany New Jersey, 1999. 52 p.

12. Armstrong D.W., Stalcup A.M., Duncan J.D., Faulkner J.R., Chang S.C. Derivatized cyclodextrins for normal-phase liquid chromatographic separation of enantiomers.// Anal. Chem. 1990. V. 62. P. 1610-1615.

13. Chang S.C., Reid G.L., Chen S., Chang C.D., Armstrong D.W. Evaluation of a new polar-organic high-performance liquid chromatographic mobile phase for cyclodextrin-bonded chiral stationary phases.// Trend. Anal. Chem. 1993. V. 12. № 4. P. 143-153.

14. Zukovski J., Pawlowska M., Nagatkina M„ Armstrong D.W. High-performance liquid chromatographic enantioseparation of glycyl di- and tripeptides on native cyclodextrin phases, mechanistic considerations.// J. Chromatogr. 1993. V. 629. P. 169-179.

15. Armstrong D.W., Li W. Optimization of liquid chromatographic separations on cyclodextrin-bonded phases.// J. Chromatogr. 1987. V. 412. P. 43-48.

16. Han S.M., Han Y.I., Armstrong D.W. Structural factors affecting chiral recognition and separation on p-cyclodextrin bonded phases.// J. Chromatogr. 1988. V. 441. P. 376-381.

17. Armstrong D.W., Han Y.I., Han S.M. Liquid chromatographic resolution of enantiomers containing single aromatic rings with p-cyclodextrin-bonded phases.// Anal. Chim. Acta. 1988. V. 208. P. 275-281.

18. Nah T.H., Cho E.H., Jang M.D., Lee Y.K., Park J.H. Binding forces contributing to reversed-phase liquid chromatographic retention on a |3-cyclodextrin bonded phase.// J. Chromatogr. A. 1996. V. 722. P. 41-46.

19. Li S., Purdy W.C. Liquid chromatographic separation of the enantiomers of dinitrophenyl amino acids using a P-cyclodextrin-bonded stationary phase. // J. Chromatogr. 1991. V. 543. P. 105-112.

20. Anderson J.T., Kaiser G. Elution order in liquid chromatography on cyclodextrin phases.// Fresenius Z. Anal. Chem. 1989. P. 749-751.

21. Arnold E.N., Lillie T.S., Beesley T.E. Molecular modeling of cyclodextrin-guest molecular interaction.// J. Liq. Chrom. 1989. V. 12. №3. P.337-342.

22. Han S.M. Han Y.I., Armstrong D.W. Structural factors affecting chiral recognition and separation on p-cyclodextrin-bonded phases.// J. Chromatogr. 1988. V. 441. P. 376-384.

23. Fisher C.M. New HPLC column technology: inclusion complexing.// Chromatography international. 1984. Issue 5. P. 10-14.

24. Armstrong D.W., Yang X., Han S.M., Menges R.A. Direct liquid chromatographic separation of racemates with an a-cyclodextrin bonded phase. // Anal. Chem. 1987. Y. 59. P. 2594-2596.

25. Dzygiel P., Rudzinska E., Wieczorek P., Kafarski P. Determination of optical purity of phosphonic acid analogues of aromatic amino acids by capillary electrophoresis with a-cyclodextrin.// J. Chromatogr. A. 2000. V. 895. P.301-307.

26. Wu W., Stalcup A. Separation of porphyrins using a y-cyclodextrin stationary phase. J. Liq. Chrom. 1994. V. 17. №5. P. 1111-1124.

27. Chang C.A., Wu Q., Armstrong D.W. Reversed-phase high-performance liquid chromatographic separation of substituted phenolic compounds with a P-cyclodextrin bonded phase column.// J. Chromatogr. 1986. V. 354. P. 454-458.

28. Matsumoto K., Noguchi Y., Yoshida N. Synthesis and antitumor activity of platinum (II) complexes of amino-cyclodextrin.// Inorg. Chim. Acta. 1998. V. 272. P. 162-167.

29. Camilleri P., Reid C.A., Manallack D.T. Chiral recognition of structurally aminoalkylphosphonic acid derivatives on an acelated beta-cyclodextrin bonded phase.// Chromatographic. 1994. V. 38. №11/12. P. 771-775.

30. Williams K.L., Sander L.C., Wise S.A. Comparison of liquid and supercritical fluid chromatography using naphthylethylcarboylated-P-cyclodextrin chiral stationary phases.// J. Chromatogr. A. 1996. V. 746. P. 91-101.

31. Armstrong D.W., Reid G.L., Hilton M.L., Chang C.D. Relevance of enantiomeric separations in environmental science.// Enviromental pollution. 1993. V. 79. P. 51-58.

32. Armstrong D.W., Hilton M., Coffin L. Multimodal chiral stationary phases for liquid chromatography: (R)- and (S)-Naphthylethyl-carbamate-derivatized -P-cyclodextrin.// LC. GC. 1991. V. 9, №9. P. 646-652.

33. Armstrong D.W., Chang C.D., Lee S.H. (R)- and (S)-Naphthylethylcarbamate substittuted P-cyclodextrin bonded stationary phases for the reversed-phase liquid chromatographic separation of enantiomers.// J. Chromatogr. 1991. V. 539. P. 83-90.

34. Stalcup A.M., Chang S., Armstrong D.W., Pitha J. (S)-hydroxypropyl-P-cyclodextrin, a new chiral stationary phase for reversed-phase liquid chromatography.// J. Chromatogr. 1990. V. 513. P. 181-194.

35. Atamna I.Z., Muschik G.M., Issaq H.J. Effect of alcohol chain length, concentration and polarity on separations in high-performance liquid chromatography using bonded cyclodextrin columns.//J. Chromatogr. 1990. V. 499. P. 477-488.

36. Issaq H.J. The multimodal cyelodextrin bonded stationary phases for high-performance liquid chromatography.// J. Liq. Chrom. 1988. V. 11. №9&10. P. 2131-2135.

37. Lee S.H., Berthod A., Armstrong D.W. Systematic study on the resolution of the derivatized amino acids enantiomers on different cyclodextrin-bonded stationary phases.// J. Chromatogr. 1992. V. 603. P. 83-93.

38. Stalcup A.M., Chang S.C., Armstrong D.W. Effect of the configuration of the substituents of derivatized P-cyclodextrin bonded phases on enantioselectivity in normal-phase liquid chromatography.//J. Chromatogr. 1991. V. 540. P. 113-128.

39. Chang S.C., Wang L.R., Armstrong D.W. Facile resolution of N-tert-butoxy-carbonyl amino acids: the importance of enantiomeric purity in peptide synthesis.// J. Liq. Chrom. 1992. V. 15. №9. P. 1411-1429.

40. Shibata T., Okamoto I., Ishii K. Chromatographic optical resolution on polysaccharides and their derivatives.// J. Liq. Chrom. 1986. V. 9. №2&3. P. 313-340.

41. Okamoto Y., Yashima E. Polysaccharide derivatives for chromatographic separation of enantiomers.//Angew. Chem. Int. Ed. 1998. V. 37. P. 1021-1043.

42. Bargmann-Leyder N., Tambute A., Caude M. A comparison of LC and SFR for cellulose-and amylose-derived chiral stationary phases.// Chirality. 1995. V. 7. P. 311-325.

43. Cass Q.B., Degani A.G., Tiritan M.E., Matlin S.A., Curran D.P., Balog A. Enantiomeric resolution by HPLC of axial chiral amides using amylose tris(s)-l-phenylethylcarbamate.// Chirality. 1997. V. 9. P. 109-112.

44. Matlin S.A., Tiritan M.E., Crawford A.J., Cass Q.B., Boyd D.R. HPLC with carbohydrate carbamate chiral phases: Influence of chiral phase structure on enantioselectivity.// Chirality. 1994. Y. 6. P. 135-140.

45. Oliveros L., Senso A., Minguillon C. Benzoates of cellulose bonded on silica gel: chiral discrimination ability as high-performance liquid chromatographic chiral stationary phases.//Chirality. 1997. V. 9. P. 145-149.

46. Franco P., Minguillon C., Oliveros L. Solvent versatility of bonded cellulose-derived chiral stationary phases for high-performance liquid chromatography and its consequences in column loadbility.// J. Chromatogr. A. 1998. V. 793. P. 239-247.

47. Chirobiotic Handbook. Advanced Separation Technologies Inc. Whippany New Jersey, 1999. 44 p.

48. Ward T.J., Farris A.B. Chiral separation using the macrocyclic antibiotics: a review.// J. Chromatogr. A. 2001. V. 906. P. 73-89.

49. Armstrong D.W. The evolution of chiral stationary phases for liquid chromatography. // J. Chin. Chem. Soc. 1998. V. 45. P. 581-590.

50. Lehotay J., Hrobonova K., Krupsik J., Cizmarik J. Chiral separation of enantiomers of amino acid derivatives by HPLC on vancomycin and teicoplanin chiral stationary phases.// Pharmazie. 1998. V. 53. P. 863-865.

51. Berthoad A., Chen X., Kullman J.P., Armstrong D.W., Gasparrini F., D'Acquarica, Villani C., Carotti A. Role of the carbohydrate moieties in chiral recognition on teicoplanin-based LC stationary phases.// Anal. Chem. 2000. V. 72. P. 1767-1780.

52. Armstrong D.W., Liu Y., Ekborgott K.H. A covalently bonded teicoplanin chiral stationary phase for HPLC enantioseparations.// Chirality. 1995. V. 7. P. 474-497.

53. Berthod A., Liu Y., Bagwill C., Armstrong D.W. Facile liquid chromatographic enantioresolution of native amino acids and peptides using a teicoplanin chiral stationary phase.//J. Chromatogr. A. 1996. V. 731. P. 123-137.

54. Armstrong D.W., Tang Y., Chen S., Zhou Y., Bagwill C., Chen J.R. Macrocyclic antibiotics as a new class of chiral selectors for liquid chromatography.// Anal. Chem. 1994. V. 66. P.1473-1484.

55. Berthod A., Jin H.L., Beesley Т.Е., Duncan J.D., Armstrong D.W. Cyclodextrin chiral stationary phases for liquid chromatographic separations of drug stereoisomers.// J. Pharm. & Biomed. Analysis. 1990. V. 8. № 2. P. 123-130.

56. Hang S.M., Armstrong D.W. Use of microcolumn liquid chromatography with a chiral stationary phase for the separation of low-resolution enantiomers.// J. Chromatogr. 1987. V. 389. P. 256-261.

57. Jacobs W.A. o-Phtalaldehyde-sulfide derivatization of primary amines for liquid chromatography electrochemistry.// J. Chromatogr. 1987. V. 392. P. 435-441.

58. Lottspeich F. Microscale isocratic separation of phenylthiohydantoin amino acid derivarives.// J. Chromatogr. 1985. V. 326. P. 321-327.

59. Merino I.M., Gonzalez E.B., Sanz-Medel A. Liquid chromatographic enantiomeric resolution of amino acids with P-cyclodextrin bonded phases and derivatization with o-phthalaldehyde.// Anal. Chim. Acta. 1990. V. 234. P. 127-131.

60. Краснова И.Н., Карцова JI.A., Черкас Ю.В. Определение аминокислот в сыворотке крови человека методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в режиме изократического элюирования.// Журн. аналит. химии. 2000. Т. 55. №1. С. 66-74.

61. Стыскин Е.Л., Ициксон Л.Б., Брауде Е.В. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. М.: Химия, 1986. 242 с.

62. Энгельгард X. Жидкостная хроматография при высоких давлениях. М.: Мир, 1980. 245 с.

63. Thurman Е.М., Mills M.S. Solis-Phase Extraction. New-York: A Wiley-Interscience Publication. 1998. 344 p.

64. Коренман И.М. Экстракция в анализе органических веществ. М.: Химия, 1997. 200 с.

65. Beubsaet J.L., Jnno К. Characterisation of important interactions controlling retention behaviour of analytes in reversed-phase high-performance liquid chromatography.// Trend. Anal. Chem. 1998. V. 17. №3. P. 157-167.

66. Gulyaeva N., Zaslavsky A., Lechner P., Chait A., Zaslavsky B. Relarive hydrophobicity of organic compounds measured by partitioning in aqueous two phase systems.// J. Chromatogr. B. 2000. V. 743. P. 187-194.

67. Scott R.P. The role of molecular interactions in chromatography.// J. Chromatogr. 1976. V. 122. P. 35-53.

68. Exploring QSAR. Fundamentals and applications in chemistry and biology. / Eds. Hansh C., Leo A. Washington: ACS DC, 1995. 557 p.

69. Пчелин В.А. Еидрофобные взаимодействия в дисперсионных системах. М.: Знание, 1976. 64 с.

70. Hansch С., Leo A. Substituent constants for correlation analysis in chemistry and biology. New-York: Willey, 1979. 399 p.

71. Handbook of chemistry property estimation methods. Enviromental Behavior of Organic Compounds./ Eds. Lyman W.J., Reehl W.J., Rosenblatt D.H. Washington: ACS DC, 1990. 1046 p.

72. Hansch C., Fujita T. A method for the correlation of biological activity and chemical structure.//J. Am. Chem. Soc. 1964. V. 86. P. 1616-1626.

73. Friedman M. Chemistry, nutrition and microbiology of D-amino acids.// J.Agric. Food Chem. 1999. V. 47. P. 3457-3479.

74. Ekkoborg-Ott K.H., Armstrong D.W. Evaluation of concentration and enantiomeric purity of selected free amino acids in fermented malt beverage (beers).// Chirality. 1996. V. 8. P. 49-57.

75. Armstrong D.W., Gasper M., Lee S.H., Zukovski J., Ercal N. D-amino acid levels in human physiological fluids.// Chirality. 1993. V. 5. P. 375-378.

76. Armstrong D.W., Gasper M., Lee S.H., Ercal N., Zukovski J. Factors controlling the level and determination of D-amino acids in the urine and plasma of laboratory rodents.// Amino acids. 1993. V.5. P.299-315.

77. Харкевич Д.А. Фармакология. M.: Медицина, 1987. 549 с.

78. Armstrong D.W., Chen S., Chang С., Chang S. A new approach for the direct resolution of racemic beta adrenergic blocking agents by HPLC.// J. Liq. Chrom. 1992. V. 15. №3. P.545-556.

79. Машковский М.Д. Лекарственные средства. M.: Медгиз, 1954. 559 с.

80. Pham-Huy С., Radenen В., Sahui-Gnassi A., Claude J. High-performance liquid chromatographic determination of (S)- and (R)-propranolol in human plasma and urine with a chiral p-cyclodextrin bonded phase.// J. Chromatogr. B. 1995. V. 665. P. 125-132.

81. Arias R., Jimenez R., Alonso R., Telez M., Arrieta I., Flores P., Ortis-Lanstra E. Determination of the P-blockers atenolol in plasma by capillary zone electrophoresis.// J. Chromatogr. A. 2001. V. 916. P. 297-304.

82. Краснова И.Н., Колмакова И.В. Карцова JI.A. Анализ нейромедиаторных аминокислот и биогенных аминов в спинномозговой жидкости методом обрагценно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии.// Журн. аналит. химии. 1997. Т. 52. №7. С. 767-772.

83. Armstrong D.W., Rundlett K.L., Nair U.B. Enantioresolution of amphetamine, methamphetamine, and deprenyl (selegiline) by LC, GC and CE.// Current separations. 1996. V. 15. P. 57-61.

84. Pawlowska M., Zukovski J., Armstrong D.W. Sensitive enantiomeric separation of aliphatic and aromatic amines using aromatic anhydrides as non chiral derivatizing agents.//J. Chromatogr. 1994. V. 666. P.485-491.

85. Stalcup A.M., Williams K.L. Determination of enantiomers in human serum by direct injection onto a P-cyclodextrin HPLC bonded phase.// J. Liq. Chrom. 1992. V. 15. №1. P.29-37.

86. Oguri S. Separation of aminocompounds by HPLC and CE.// J. Chromatogr. B. 2000. V. 747. P. 1-19.

87. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии./ Под ред. Березина. М.: Мир, 1988.687 с.

88. Досон P., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991. 543 с.

89. Колб В.Г., Камышников B.C. Клиническая биохимия. М.: Беларусь, 1976. 312 с.

90. Добрынина В.И. Биологическая химия. М.: Медицина, 1976. 504 с.

91. Збарский Б.И., Иванов И.И., Мардашев С.Р. Биологическая химия. JL: Медицина, 1965. 520 с.

92. Wood A.T., Hall M.R. Reversed phase high-performance liquid chromatography of catecholamines and indoleamines using a simple gradient solvent system and native fluorescence detection.// J. Chromatogr. B. 2000. V. 744. P. 221-225.

93. Westerink B.H. Analysis of biogenic amines in microdialysates of the brain.// J. Chromatogr. B. 2000. V. 747. P. 21-32.

94. Cserhati T. Use of spectral mapping technique for the separation of solvent strength and selectivity on P-cyclodextrin polymer-coated HPLC column using monoamine oxidase inhibitory drugs as solutes.// Anal. Chim. Acta. 1997. V. 348. P. 197-202.

95. Stalcup A.M., Williams K.L. Determination of enantiomers in human serum by direct injection onto a P-cyclodextrin HPLC bonded phase.// J. Liq. Chrom. 1992. V. 15. №1. P. 29-37.

96. Ward T.J., Farris A.B. Chiral separation using macrocyclic antibiotics: a review.// J. Chromatogr. A. 2000. V. 906. P. 73-89.