Взаимодействие нативного и химически модифицированного сывороточного альбумина человека с олиго- и полирибонуклеотидами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

ГЕРАСИМОВА ЮЛИЯ ВЛАДИМИРОВНА

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ НАТИВНОГО И ХИМИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННОГО СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА ЧЕЛОВЕКА С ОЛИГО- И ПОЛИРИБОНУКЛЕОТИДАМИ

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Новосибирск - 2009

1 8 и ЮН 2009

003473570

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научный руководитель:

доктор химических наук, доцент Годовикова Татьяна Сергеевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, доцент Бунева Валентина Николаевна

доктор химических наук, член-корр. РАН, профессор Габибов Александр Габибович

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского, МГУ им. М. В. Ломоносова

Защита состоится » 2009 г. в 40 часов

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, пр-кт акад. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

С авторефератом можно ознакомиться на сайте www.niboch.nsc.ru

Автореферат разослан «¿?.5~» ЛШаЛ- 2009 г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Человеческий сывороточный альбумин является основным белком крови. Одна из функций альбумина состоит в депонировании и переносе широкого спектра эндогенных и экзогенных веществ. Наряду с низкомолекулярными лигандами альбумин связывает и биополимеры, в частности, нуклеиновые кислоты. Имеются убедительные доказательства, что альбумин способствует проникновению олигодезоксирибонуклеотидов и их фосфотиоатных аналогов в клетки. В связи с разработкой подходов к контролю экспрессии генов с использованием антисмысловых олигонуклеотидов, рибозимов и й1РНК, изучение взаимодействия нативного человеческого сывороточного альбумина, а также его клинически значимых химически модифицированных форм, с нуклеиновыми кислотами представляется особенно актуальным.

Помимо транспортной функции альбумин осуществляет катализ нескольких типов химических превращений, являясь функциональным аналогом некоторых гидролаз, лиаз, изомераз и тиол-пероксидаз. Недавно (ТакаЬавЫ, е1 а1., 2006) было показано, что в присутствии бычьего сывороточного альбумина наблюдается деполимеризация РНК. Данные по РНК-гидролизующей активности сывороточного альбумина человека в литературе отсутствуют. Так как концентрация данного белка в плазме крови высока (~ 0,6 мМ), взаимодействие альбумина с внеклеточными РНК может существенно влиять на их стабильность в крови, биораспределение и метаболизм. В связи с этим становится очевидной особая актуальность исследования каталитической активности альбумина в реакции деполимеризации нуклеиновых кислот.

Известно, что альбумин в сыворотке крови подвергается некоторым химическим модификациям, например, гликированшо и А'-гомоцистеинилированию, причем содержание модифицированных форм белка существенно увеличивается с возрастом, а также при развитии ряда патологических процессов, включая сахарный диабет, онкологические и сердечно сосудистые заболевания. Модификация альбумина может привести к изменению его структуры и, как следствие, оказать влияние на его взаимодействие с олиго- и полинуклеотидами в крови человека. Таким образом, для установления причин исключительной полифункциональности человеческого сывороточного альбумина, обуславливающей его биологическую роль в организме в норме и при патологии, чрезвычайно важным является изучение процессов взаимодействия как нативного человеческого сывороточного альбумина, так и его клинически значимых модифицированных форм с такими важными биополимерами как рибонуклеиновые кислоты.

Цель настоящей работы - исследование взаимодействия нативнойи химически модифицированных форм (гликированного и Л'-гомоцистеинилированного) человеческого сывороточного альбумина с РНК, а также сравнительный анализ способности альбумина и других белков нефракционированной плазмы крови связывать гомополирибонуклеотиды и их комплементарные комплексы.

В ходе исследования решались следующие задачи:

• анализ эффективности и специфичности взаимодействия препарата альбумина и белков плазмы крови с полирибонуклеотидами (поли(А), поли(О), поли(и), и поли(С)) и их дуплексами (поли(А)* поли(и) и поли(С)* поли(С));

• исследование способности альбумина катализировать гидролиз олигорибонуклеотидов, полирибонуклеотидов и РНК;

• изучение каталитических свойств (кинетических параметров реакции, влияния ионов металлов и рН на скорость реакции) и субстратной специфичности альбумина в реакции гидролиза РНК;

• изучение механизма деполимеризации нуклеиновых кислот под действием альбумина посредством определения структуры продуктов реакции методом 31Р-ЯМР спектроскопии;

• изучение влияния клинически значимых химических модификаций альбумина - гликирования и А^-гомоцистеинилирования - на связывание белка с олиго- и полирибонуклеотидами, а также на его РНК-гидролизующую активность;

• проведение аффинной модификации альбумина фосфорилирующим производным олигорибонуклеотидного субстрата и определение аминокислотных остатков альбумина, участвующих в связывании олигорибонуклеотидов, методами МА1Л31-ТОР масс-спектрометрии и 31Р -ЯМР-спектроскопии.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе впервые установлено, что в присутствии человеческого сывороточного альбумина наблюдается расщепление фосфодиэфирных связей в РНК. Выявлены существенные отличия каталитических свойств (кинетических параметров и оптимума рН) и субстратной специфичности альбумина и известных РНКаз человека, а также РНКазы А. Проведена локализация участка связывания олигорибонуклеотидов в составе альбумина. Обнаружено, что такие клинически значимые химические модификации человеческого сывороточного альбумина как гликирование и Д'-гомоцистеинилирование приводят к снижению эффективности гидролиза РНК, в то время как сродство белка к полирибонуклеотидами увеличивается. Полученные данные могут привести к расширению знаний о роли и функции альбумин-нуклеиновых комплексов в процессах жизнедеятельности человека в норме и при патологии,

а также способствовать разработке новых диагностических и прогностических тестов и созданию новых лекарственных средств.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы. Результаты работы были представлены на конференции «Физико-химическая биология», Новосибирск, Россия, 2006; Международном форуме «Актуальные проблемы современной науки», Самара, Россия, 2006; 15lh Conversation, Олбани, США, 2007; III Международной конференции «Фундаментальные науки - медицине», Новосибирск, Россия, 2007; 4th International Conference of Young Medics, Ереван, Армения, 2007; IV съезде Российского биохимического общества, Новосибирск, Россия, 2008.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 22 схемы, 44 рисунка и 6 таблиц. Библиография включает 214 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Сывороточный альбумин как один из основных полирибонуклеотид-связывающих белков крови человека

Для выявления в плазме крови белков, связывающих нуклеиновые кислоты, в работе использовали аффинные сорбенты на основе Полисил-СА, содержащие в качестве лигандов одноцепочечные поли(А)-, поли(Ц)-, nonn(G)-, поли(С)-последовательности, а также дуплексы поли(А)»поли(и) и поли(0)шполи(С). Белки, элюированные с аффинных сорбентов в составе комплексов с полинуклеотидом, анализировали электрофорезом в денатурирующем полиакриламидном геле с последующим окрашиванием серебром (рис. 1).

Видно, что для каждого аффинного сорбента характерен свой набор белков, связывающих полинуклеотидный лиганд. Так, при использовании сорбентов, содержащих поли(А) или поли(А)»поли(и) дуплекс, визуализировалось пять основных полос, соответствующих белкам с молекулярными массами, близкими к 73, 67, 54, 39 и 28 кДа (рис. 1, дор. 1 и 3 соответственно). Отличительным моментом в случае сорбента с поли(А)' поли(Ц)-дуплексом (рис.1, дор. 3) являлось уменьшение относительной интенсивности полос, соответствующих белкам 73, 67, 39 и 28 кДа, и увеличение относительной интенсивности полосы, соответствующей белку 54 кДа. В то же время, при элюировании белков с поли(и)-содержащего сорбента в геле была видна только одна полоса, соответствующая белку с молекулярной массой 28 кДа (рис. 1, дор. 2).

Рис. 1. Элекгрофорегический анализ белков крови, . выделенных на аффинных сорбентах, содержащих полн(А) (дор. 1), поли(Ц) (дор. 2), поли(А)" поли(и)-Ч дуплекс (дор. 3). поли(С) (дор. 4), поли(С) (дор. 5), поли(0)*поли(С)-дуплекс (дор. 6). Белки окрашивали солями серебра.

ЬЙ* .J

2к—:Шф .««г"

В случае поли(О)- и поли(С)* поли(С)-сорбентов на электрофореграммах наиболее интенсивно визуализировались две полосы, соответствующие белкам 67 и 54 кДа (рис. 1, дор. 4 и 6 соответственно). При инкубации плазмы крови с поли(С)-сорбентом наблюдалась такая же картина, как и для поли(и)-содержащето сорбента. В геле была видна одна слабо выраженная полоса, соответствующая белку с молекулярной массой ~ 28 кДа (рис. 1, дор. 5).

Для идентификации белков крови, образующих комплексы с полинуклеотидами, был проведен иммуноферментный анализ с использованием кроличьих поликлональных антител против альбумина, кератина К2е, кератина К1, лактоферрина и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Было обнаружено, что антитела против альбумина и кератинов (К1 и К2е) специфично связывались с полосой, соответствующей белкам ~ 67 кДа (рис. 2, дор. 2-4). Остальные антитела не окрашивали какие-либо белковые полосы.

Рис. 2. Иммуноферментный анализ поли(А)-связывающих белков плазмы крови человека. Белки плазмы крови, элюирующиеся с поли(А)-содержащего сорбента при 1 М NaCl, разделяли электрофорезом в 10 % ПААГ в денатурирующих условиях, переносили на нитроцеллюлозную мембрану и инкубировали с кроличьими поликлональными антителами против кератинов К1 (дор. 2) и К2е (дор. 3), HSA (дор. 4), человеческого лактоферрина (дор. 5) и глицсральдсгид-3-фосфатдсгидрогеназы (дор. 6). Комплекс антиген-антитело визуализировали с помощью антител козы против IgG кролика, конъюгированных с псроксидазой хрена, используя в качестве субстрата 0,03 % Н2О2 в присутствии 4-хлор-1-нафтола. Дор. 1 - окраска поли(А)-связывающих белков плазмы крови солями серебра.

Таким образом, сывороточный альбумин и кератины обладают сродством к полирибонуклеотидам. С наибольшей эффективностью альбумин взаимодействует с гомополипуринами, как одноцепочечными, так и в составе коплементарных комплексов.

2. Влияние клинически значимых химических модификаций альбумина на связывание белком гомоиолирибонуклеотидов

Фракция альбумина в крови гетерогенна и содержит, наряду с нативным белком, ряд клинически значимых модифицированных форм. Так, в крови здоровых доноров 6-15 % альбумина подвергается гликированию, а 0,26-0,36 % — N-гомоцистеинилированию. Содержание в крови модифицированного белка повышается при развитии ряда патологических процессов. Поскольку модификация альбумина может привести к изменению структуры белка и, как следствие, повлиять на его функционирование, задачей следующего этапа работы было проведение сравнительного анализа взаимодействия с нуклеиновыми кислотами нативного альбумина и его клинически значимых модифицированных форм.

Гликированный (gHSA) и ¿V-гомоцистеинилированный (Hcy-HSA) альбумины получали по ранее опубликованным методикам путем инкубации белка с раствором D-глюкозы (Schmitt et. al., 2005) или тиолактона гомоцистеина (Glowacki et. al., 2004) соответственно. Полученный гликированный альбумин по степени модификации (15 остатков глюкозы на молекулу белка) и характеристикам флуоресценции (Хвшб = 365 нм, Xj,cn = 440 нм) соответствовал форме белка, присутствующей в крови человека. По данным MALDI-TOF-масс-спектрометрии и реакции с реагентом Эллмана, степень модификации альбумина при N- гомоцистеинилировании составила 2 молекулы гомоцистеина на молекулу белка.

Равновесные константы диссоциации комплексов нативного и модифицированных форм человеческого сывороточного альбумина с поли(А) определяли высокоэффективным капиллярным электрофорезом. При увеличении концентрации белка время удерживания полинуклеотида в капилляре постепенно возрастало и достигало платового значения при концентрации белка выше 45 мкМ (рис. 3).

Таблица 1

Равновесные константы диссоциации комплексов HSA, gHSA и Hcy-HSA с полиадениловой кислотой

Белок Kä х10 \ М

HSA 1,3 ±0,2

gHSA 0,7 ±0,1

Hcy-HSA 0,31 ±0,08

Рис. 3. Зависимость фактора насыщения HSA (1), gHSA (2) или Hcy-HSA (3) полиадениловой кислотой (Rf) от концентрации белка.

Константы диссоциации нативиого и модифицированных форм HSA с полиадениловой кислотой рассчитывали из зависимости фактора насыщения белка полиадениловой кислотой (Rj) от концентрации белка (уравнение 1):

Rf = [HSA] / (Кл + [HSA]), (1)

где Rf = (шп - m) / (m{] - w;s), m - время выхода поли(А) при добавлении нативного или модифицированного HSA, т0 и ms - времена удерживания свободного и полностью связанного с белком лиганда соответственно.

Из данных, представленных в табл. 1, видно, что наибольшим сродством к полиадениловой кислоте обладает iV-гомоцистеинилированный альбумин, тогда как гликированный белок связывает полинуклеотид в ~ 2 раза менее эффективно. Наименьшее сродство к поли(А) наблюдается в случае нативного белка (табл. 1).

Для определения констант диссоциации комплексов gHSA с различными гомополинуклеотидными лигандами использовали метод флуоресцентного титрования в условиях флуоресценции продуктов гликирования (A^g = 365 нм, ^исл = 440 нм) (рис. 4). Расчет констант диссоциации комплексов белка с лигандами проводили по уравнению Штерна-Фольмера (уравнение 2):

F0/(Fo-F) = Kd//[Q]+l//, (2)

где F0 и F - интенсивности флуоресценции свободного и связанного с лигандом gHSA соответственно; /-доля молекул флуорофоров, доступных для тушения; Kd - константа диссоциации комплекса гликированного альбумина с полинуклеотидом; [Q] - концентрация лиганда (тушителя).

[поликуклеотед], мМ*

Рис. 4. Кривые флуоресцентного титрования гликированного альбумина с помощью поли(А)«поли(и)-дуплекса (1), полн(С) (2), поли(Ч) (3), поли(с1А) (4), поли(А) (5). Интенсивность испускания флуоресценции измеряли при X = 440 нм при возбуждении светом с X = 365 нм. * Концентрации полинуклеотидов рассчитаны на одну фосфодиэфирную связь

Таблица 2

Значения констант диссоциации и доли флуорофоров, доступных для тушения, для комплексов gHSA с полинуклеотидами*

Полинуклеотид Ка*103,М* /

Поли(А) 1,0 ±0,1 0,37 ±0,01

Itaui(dA) 2,9 ± 0,4 0,36+0,03

Поли(и) 2,5 ± 0,6 0,27 ± 0,04

Поли(С) 2,0 ± 0,3 0,23 ± 0,02

Поли(А)* поли(и)-дуплекс 1,1 ±0,2 0,15 + 0,01

Значения рассчитаны, исходя из концентрации полинуклеотидов на одну

Как видно из табл. 2, эффективность связывания гликированным альбумином полиадениловой кислоты примерно в три раза выше, чем ее дезокси-аналога. При этом значения факторов / для обоих белково-нуклеиновых комплексов примерно равны, что может свидетельствовать в пользу того, что при связывании лигандов конформация белка одинакова. Напротив, при равных значениях констант диссоциации комплексов gHSA с поли(А) и поли(А)*поли(и)-дуплексом доля доступных для тушения флуорофоров отличается примерно в два раза, что может быть объяснено различиями в пространственной структуре белка при связывании этих лигандов. Совокупность полученных данных свидетельствует о том, что на эффективность связывания гликированным альбумином полирибонуклеотидов влияют как структура гетероциклического основания, так и природа остатка сахара в составе лиганда.

3. РНК-гидролизующая активность сывороточного альбумина

Исследования последних лет привели к открытию новой функции белков плазмы крови. Было показано, что белки как иммунной системы человека (IgG, slgA), так и неиммуноглобулиновой природы, например, лактоферрин, обладают не только способностью связывать нуклеиновые кислоты, но и нуклеазной активностью. Недавно (Takahashi, et al., 2006) было обнаружено, что в присутствии бычьего сывороточного альбумина наблюдается расщепление фосфодиэфирных связей в РНК. На момент начала настоящей работы данные о РНК-гидролизующей активности человеческого сывороточного альбумина в литературе отсутствовали. В связи с этим, задачей следующего этапа настоящей работы было исследование реакции гидролиза РНК в присутствии HSA.

Рис. 5. Гель-электрофоретический анализ препарата HSA («Sigma», А3782) до и после очистки с помощью SDS-PAGE (дор. 1 и дор. 2 соответственно). Дор. М. - маркеры молекулярной массы.

В работе был использован коммерческий препарат человеческого сывороточного альбумина («Sigma», А3782), свободный от глобулинов и жирных кислот. Электрофоретический анализ препарата показал уровень гомогенности -97% (рис.5, дор. 1). Наряду с основной полосой, соответствующей по электрофоретической подвижности HSA (Mw ~ 67 кДа), на элекрофореграмме видна также полоса, соответствующая димеру белка (Aiw ~ 130 кДа). Присутствие димерав препарате альбумина подтверждается также данными MALDI-TOF-масс-спектрометрии.

Одним из основных общепринятых критериев при доказательстве собственной каталитической активности белков считается метод тестирования активности белков в геле. На рис. 6 представлены данные по тестированию РНК-гидролизующей активности альбумина in situ. После электрофоретического разделения коммерческого препарата HSA («Sigma», США) в денатурирующем ПААГ, содержащем сополимеризованный РНК-субстрат, для ренатурации белка из геля удаляли избыток SDS и инкубировали в буфере оптимального состава. Окраска геля бромистым этидием приводила к появлению на равномерно флуоресцирующем фоне РНК темного пятна в положении, соответствующем HSA (рис. 6, дор. 2, приведен негатив геля). При этом не наблюдалась деградация кДа М] 2 сополимеризованного в геле РНК-субстрата в остальных положениях геля, что свидетельствует об отсутствии в 66препарате HSA других белков с РНК-гидролизующей

45активностью.

30

Рис. 6. Анализ РНК-гидролизующей активности препарата HSA в геле: дор. М - маркерные белки, дор. 1,2- HSA. Дор. М, 1 - гель, окрашенный 20,1 СВВ G-250, дор. 2 - негатив геля, окрашенного бромистым этидием.

Подтверждением того, что наблюдаемая РНК-гидролизующая активность альбумина является собственным каталитическим свойством белка, служит выявление аналогичной активности у рекомбинантного альбумина (rHSA), который был любезно предоставлен Т. В. Бобик (ИБХ РАН). Изучение каталитических свойств рекомбинантного препарата проводили в условиях многооборотной реакции, используя в качестве субстрата поли(С). За протеканием процесса следили с помощью мР-ЯМР спектроскопии. О расщеплении фосфодиэфирных связей в молекуле субстрата свидетельствует уменьшение интегральной интенсивности сигнала фосфодиэфирных групп (S ~ 0 м. д.) с течением времени и появление сигналов в слабом поле (8 ~ 20 м. д.), характерных для соединений, содержащих в структуре остаток нуклеозид-2',3'-циклофосфата (рис. 7).

Константы скорости расщепления фосфодиэфирных связей в поли(С) в присутствии коммерческого препарата альбумина, выделенного из сыворотки человека, и рекомбинантного сывороточного альбумина человека, рассчитанные из зависимости степени расщепления субстрата от времени, составляют (1,21 ± 0,05)х10 "3 ч"1 и (1,06 ± 0,06)х10 "3 ч"1 соответственно. Таким образом, скорость расщепления фосфодиэфирных связей в поли(С) в присутствии генно-инженерного препарата альбумина сравнима с таковой для

Рис. 7. "Р-ЯМР-спектры растворов поли(С) (9,6 х 10 "3 М в расчете на 1 фосфодиэфирную связь, D2O), выдержанных в буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl (pH 7,0), 0,2 М KCl, 0,5 мМ EDTA, в присутствии rHSA (3,7 х 10 5 М) при 37 °С в течение 12,5 ч (а) и 180 ч (б).

Дополнительным подтверждением того, что РНК-гидролизующая активность препаратов HS А - собственное свойство белка, является то, что каталитические свойства и субстратная специфичность альбумина в реакциях гидролиза РНК отличаются от свойств секреторных РНКаз человека.

Для исследования каталитических свойств белка было определено число оборотов HSA в реакциях гидролиза фосфодиэфирных связей с использованием в качестве субстратов поли(С) и гетерогенного олигорибонуклеотида pAGGATCUAUAAAUGAC (ON16). Число оборотов реакции п рассчитывали, используя уравнение 3:

п = [RNA] х Ссх / [HSA] , (3)

где [RNA] - концентрация полицитидиловой кислоты в расчете на одну фосфодиэфирную связь или концентрация ON16, умноженная на количество расщепляемых связей, [HSA] - концентрация альбумина, Сех - степень расщепления полинуклеотида за 24 ч.

Было обнаружено, что одна молекула HSA за 24 ч индуцирует расщепление ~ 13 фосфодиэфирных связей в составе поли(С). При гидролизе гетерогенного олигорибонуклеотида число оборотов альбумина увеличивается по сравнению с величиной, полученной для реакции с поли(С). Так, одна молекула HSA за 24 ч индуцирует расщепление 144 фосфодиэфирных связей в составе ON16. Таким образом, эффективность альбумина как катализатора расщепления фосфодиэфирных связей зависит от первичной структуры субстрата.

реакции с природным белком.

ррга 20 IS 16 14 12 10 8 6 4 2 0 -2 б

_u.... .....................—;

ppm 20 18 16 14 12 10 » 6 4 2 О .2

Рис. 8. Зависимость начальной скорости гидролиза ирА-сайта в рс1(АССАТС)гШ(АТАААТСАС) в присутствии Н5А от концентрации олигонуклеотида.

Реакция расщепления фосфо-диэфирных связей в РНК в присутствии альбумина протекает в комплексе белка с субстратом, о чем свидетельствует тот факт, что зависимость скорости реакции от концентрации олигонуклеотида

характеризуется кривой с насыщением (рис. 8). Следует отметить, что протекание реакции через стадию образования специфического комплекса с катализатором с последующим образованием продукта реакции характерно для ферментативных реакций.

4. Механизм гидролиза фосфодиэфирных связей в РНК под действием человеческого сывороточного альбумина

Изучение механизма катализируемой альбумином деполимеризации нуклеиновых кислот проводили путем определения структуры продуктов гидролиза РНК методом 31Р-ЯМР спектроскопии. При анализе 31Р-ЯМР спектра полицитидиловой кислоты, выдержанной в присутствии альбумина при 37 °С в течение 21 суток (времени полужизни белка в кровяном русле), было обнаружено, что сигналы в области, характерной для фосфодиэфирных групп полинуклеотида (6 - 0 м. д.) полностью отсутствуют. При этом регистрировались сигналы, которые по положению в поле (5 = 4,52 м. д. и 8 = 4,25 м. д.), характеру расщепления (дублет) и константе спин-спинового взаимодействия (У =7,6 Гц) соответствуют атомам фосфора цитидин-3'- и цитидин-2'-монофосфатов соответственно. Отнесение сигнала нуклеозид-3'-монофосфата (8 = 4,52 м. д.) было сделано на основании данных 31Р-ЯМР-спектроскопии, полученных в ходе анализа продуктов гидролиза поли(С) с помощью бычьей панкреатической РНКазы А. Как известно, данный фермент на стадии гидролиза циклического фосфодиэфира количественно превращает 2',3'-циклофосфат в З'-фосфомоноэфир.

В спектре полицитидиловой кислоты, выдержанной с альбумином, регистрировался еще один сигнал с химическим сдвигом 20,95 м. д., который по положению в поле и характеру спин-спинового взаимодействия (У = 6,7 Гц и 12 Гц) может быть отнесен к цитидин-2',З'-циклофосфату. Сигнал при 2,55 м. д. по характеру расщепления (синглет) соответствует ортофосфату. При добавлении в реакционную смесь по истечению 21 суток новой порции поли(С) вновь начинает выявляться РНК-гидролизующая активность альбумина, о чем свидетельствуют данные 31Р-ЯМР спектроскопии.

Интегральная интенсивность сигнала фосфодиэфирных групп (5-Ом.д.) с течением времени уменьшается, и в слабом поле опять начинают регистрироваться два близко расположенных сигнала со значениями химических сдвигов 5 = 20,94 м. д. и 20,64 м. д.. Данные сигналы могут быть соответственно отнесены к нуклеозид-2,3'-цшслофосфату и олигонуклеотидным фрагментам, содержащим 2',3'-циклофодиэфирную группировку. Через 3 суток интегральная интенсивность сигнала от фосфодиэфирных групп уменьшается на 88 %. Полученные данные позволяют заключить, что ША является катализатором гидролиза РНК, поскольку он участвует в реакции гидролиза, ускоряя ее, но не входит в состав продуктов реакции и регенерируется после каждого цикла превращений.

1Л0

Рис. 9. Зависимость относительной интегральной интенсивности

сигналов фосфодиэфирных (•), 2',3'-циклофосфодиэфирных групп (■) и цитидин-2'(3')-монофосфата (А) от времени при взаимодействии поли(С) (9,6 х 10 -1 М, в расчете на 1 фосфодиэфирнуго связь) с НБА (7 " 10 "4 М) в буфере 50 мМ Трис-НС1 (рН 7,0), содержащем 0,2 КС1 и 0,5 мМ БЭТА, при 37 °С

время, ч

На рис. 9 показана зависимость от времени относительных интегральных интенсивностей сигналов фосфодиэфирных, 2',3'-циклофосфатных и 2'-иЗ'-монофосфатных групп, регистрирующихся в спектре 31Р-ЯМР полицитидиловой кислоты, выдержанной в присутствии Н8А. Видно, что кинетика изменения интегральных интенсивностей может быть описана кинетическими уравнениями для двух последовательных реакций, где промежуточными продуктами реакции являются соединения, содержащие 2',3'-циклофосфодиэфирную группу. Рассчитанные значения констант скоростей реакции гидролиза поли(С) до циклофосфодиэфиров и циклофосфодиэфиров до цитидин-2'- и 3'-монофосфатов составляют 0,108 ± 0,001 ч"1 и (1,58 ± 0,08) х 10 3 ч"1, соответственно. Таким образом, ША в ~ 70 раз более активен в реакции гидролиза фосфодиэфирных связей в поли(С), чем в реакции гидролиза 2',3'-циклофосфодиэфиров.

Принимая во внимание данные 31Р-ЯМР-спектроскопии (рис. 10), можно сделать вывод, что в олигорибонуклеотидах расщепление фосфодиэфирных

ррт 6

2% » "" 5....."¿'"""з Т.....1 .....6"

ррт "2 Г 20 '5 4 3 2 .....Г" о"

и

в

I I!

связей под действием альбумина протекает аналогично. Как видно из рис. 10, при взаимодействии р (1))6 с альбумином уже через 1 ч инкубации в спектрах реакционной смеси кроме сигнала исходного олигонуклеотида (5 = 0,19-0,35 м. д.) регистрируются два близко расположенных сигнала со значениями химических сдвигов 20,55 и 20,66 м. д., соответствующие фрагментам

олигорибонуклеотида, имеющим в своем составе 2',3'-циклофосфатную группировку. На больших временах (29 ч) в спектре реакционной смеси регистрируется еще один сигнал с химическим сдвигом 20,91 м. д. (рис. 106). По положению в поле зарегистрированный сигнал может быть отнесен к уридин-2',3'-циклофосфату. Далее циклические интермедиаты гидролизуются с образованием нуклеозид-3'- или нуклеозид-2'-монофосфата, о чем свидетельствует появление в ЯМР-спектре реакционной смеси сигналов с химическими сдвигами 4,68 и 4,29 м. д. соответственно (рис. 10в).

Таким образом, альбумин катализирует деградацию РНК по двустадийному механизму, включающему переэтерификацию и последующий гидролиз промежуточного циклического продукта реакции.

Катализ гидролиза РНК под действием сывороточного альбумина может протекать по нескольким механизмам. При взаимодействии с олиго- и полинуклеотидами Н5А может изменять геометрию фосфодиэфирных связей, тем самым способствуя их разрыву («конформационный стресс»). Кроме того, при образовании комплекса между альбумином и РНК ионогенные группы боковых радикалов некоторых аминокислотных остатков белка могут оказаться вблизи фосфодиэфирной связи и обеспечить общий кислотный, основной или кислотно-основной катализ реакции гидролиза. Анализ зависимости скорости расщепления альбумином фосфодиэфирных связей в • РНК от рН свидетельствует о том, что гидролиз протекает по механизму кислотно-основного катализа.

ррт 21 20

Рис. 10.3 'Р-ЯМР-спектры растворов р(1Г)6 (1 * 10М, 020), выдержанных в присутствии ГОА ОхЮ-'М) в буфере, содержащем 50 мМ Трис-НС1 (рН 7,0), 0,2 М КС1, 0,5 мМ ЕОТА, при 37 °С в течение 1 ч (а). 29 ч (б) и 35 ч С«).

k^tt, мин"1

0.08

Влияние рН на скорость гидролиза РНК в присутствии HSA исследовали, используя в качестве субстрата олигорибонуклеотид ON16. Видно, что кривая

зависимости эффективной константы скорости расщепления олиго-рибонуклеотида ON 16 в присутствии HSA от рН, приведенная на рис. 11, имеет колоколообразный вид с максимумом при рН - 5,5. Наблюдаемая классическая колоколообразная

зависимость константы скорости реакции гидролиза олиго-

рибонуклеотида под действием альбумина, характерная для рибонуклеаз, может указывать на то, что гидролиз протекает по механизму кислотно-основного катализа с участием двух ионогенных групп HSA (схема 1).

(.0 «.S

рН

Рис. 11. Зависимость эффективной

константы скорости расщепления СЖ16 в присутствии ША от рН.

\лл/-СН>

VWCHt

Si_у ~т к_у\

н 1 ,—J ' н I ( н

0 ""

1

/О—Р

с й

Н,0

о/ он.

)

/Q—р=0

л

I OR

ROH

о*

о

ROH Б! I

О—Р=0

I

О"

о=р—о I

о"

АН

Схема 1.

Рассчитанные значения констант ионизации функциональных групп белка, принимающих участие в катализе, составляют рЛ^ = 6,1 ± 0,1, р£2 = 4,9±0,1.

5. Субстратная специфичность альбумина в реакции гидролиза фосфодиэфирных связей в РНК

Одним из свойств, отличающих друг от друга рибонуклеазы человека, является предпочтительное расщепление ферментами фосфодиэфирных связей в поли(С)- или поли(11)-субстратах. Для того чтобы сравнить субстратную специфичность сывороточного альбумина человека в реакции гидролиза РНК со специфичностью, проявляемой известными РНКазами крови, было проведено исследование эффективности гидролиза полирибонуклеотидов в присутствии ША.

Кинетику гидролиза поли(С), поли(и) или поли(А) в присутствии HSA исследовали методом 3|Р-ЯМР спектроскопии. В качестве контроля использовали растворы полирибонуклеотидов, выдержанные в тех же условиях, но в отсутствие белка. Контрольные образцы поли(Ц) и поли(А) были стабильны в условиях проведения эксперимента. Полицитидиловая кислота за 180 ч расщеплялась менее чем на 5 %.

Скорость реакции гидролиза под действием альбумина уменьшается в ряду поли(С) > поли(и) > поли(А). Так, например, относительная интегральная интенсивность сигналов циклофосфодиэфирной группы поли(11) после 7 ч инкубации в присутствии HSA составляет около 2 %, тогда как для поли(С) это значение равно 48 %. Наименее эффективно в присутствии HSA гидролизуются фосфодиэфирные связи в поли(А) (рис. 12). Значения констант скорости гидролиза полицитидиловой, полиуридиловой и полиадениловой кислот в присутствии HSA, рассчитанные по уравнению для реакции псевдопервого порядка, составляют 0,108 ±0,001 ч"1, (2,30 ± 0,02) хЮ3 и (1,0 ± 0,3) х10 "3 ч"1 соответственно.

Время, ч

Рис. 12. Зависимость стспсни расщепления поли(С) (•), поли(Ц) (■) или поли(А) (А) в присутствии НЭА от времени.

Таблица 3

Величины относительной активности РНКазы А, РНКаз человека и НЭА при гидролизе полинуклеотидов

Белок Поли(С) Поли(Ц) Поли(А)

РНКаза А1 100% 4,7 % 0,005%

РНКаза 1 человека2 100% 3,5% 0,03 %

РНКазы 2 иЗ человека2 100% 1240 % 0%

HSA 100% 2,2% 0,9%

1 - по данным delCardayre et. al., 1995

2 - по данным Sorrentino et. al., 1994

Следует отметить, что активность альбумина в реакции гидролиза поли(С)-субстрата в раз ниже, чем активность РНКазы А

(к = 3,1 х 105 мин"1, с!е1Саг(1ауге е1. а1., 1995). Несмотря на низкую эффективность расщепления РНК, альбумин может принимать участие в деградации внеклеточных РНК в крови благодаря его высокой концентрации (-0,6 мМ).

В табл. 3 приведены данные по относительной активности ША, бычьей панкреатической РНКазы А и РНКаз человека. Наиболее существенное отличие в субстратной специфичности альбумина и РНКаз панкреатического типа состоит в том, что альбумин гидролизует поли(А) всего в два раза медленнее, чем поли(11), тогда как активность РНКазы А в отношении полиадениловой кислоты на три порядка меньше, чем в отношении поли(1_Г). РНКазы человека панкреатического типа в реакции гидролиза поли(А) в ~ 100 раз менее активны, чем в случае поли(и). РНКазы человека непанкреатического типа предпочтительно гидролизуют поли(и)-субстрат и неактивны в отношении полиадениловой кислоты. Таким образом, субстратная специфичность сывороточного альбумина человека в реакции гидролиза полинуклеотидов отличается от специфичности РНКаз человека.

L Т1 1 2 3 4 5 f Т Я 9 10 11 12 13 Ы 15 M

US8.C9I * U82 МП

cîo !

\а

и

^ АА

U А „С А

U-A ' GU

a-u \ g-c»

__A-U._

U - А

с-с ». V

С-С \ A-U ' С-0

с-

л

С-С,, G-и*' ■ U-A c-g

L'-A : ... ч А к

Auccci^ ссс

agggacaa < 3' 1 t *V«-A

i / g-c

, a-u-' au s

А-иЖ

„G А U А С А.

Рнс. 13. Анализ продуктов расщепления 5'-[""Р]-меченого in vitro транскрипта РНК H1V-1 в присутствии HSA, rHSA или BSA. Радиоавтограф 12 % денатурирующего ПААГ. Дорожки L и Т1 -расщеплепие РНК 2 M имидазолом (рН 7,0) и РНКазой Т1 в денатурирующих условиях соответственно; дор. 1-2 - инкубация РНК в отсутствие белка. РНК инкубировали в 50 мМ Трис-HCl (рН 7,0), содержащем 0,2 M КС1 и 10 мМ EDTA, в присутствии 2 * 10 5 M HSA (дор. 3-7), BSA (дор. 8-12) или rHSA (дор. 13-16) при 37 "С в течение 0 мин (дор. 1), 10 мин (дор. 3, 8, 13), 30 мин (дор. 4. 9, 14), 1 ч (дор. 5, 10), 2,5 ч (дор. 6, 11, 15) и 22 ч (дор. 2, 7, 12, 16). Слева указаны сайты гидролиза РНК альбумином.

Рис. 14. Вторичная структура in vitro транскрипта РНК HIV-1 (по данным Isel С. et. al., 1995). Стрелками показаны фосфоди-эфирные связи, подвергающиеся расщеплению под действием HSA. Сплошными стрелками обозначены основные сайты расщепления, пунктирными - сайты, расщепляющиеся с меньшей эффективностью.

Специфичность HSA в реакции расщепления гетерогенной РНК изучали, используя в качестве субстрата транскрипт РНК HIV-1 длиной в 96 нуклеотидных звеньев, который был получен и любезно предоставлен к.х.н. Н.В. Тамковичем (ИХБФМ СО РАН). Из данных рис. 13 видно, что в присутствии сывороточного альбумина расщепление РНК-субстрата происходит, главным образом, по CpA/UpA-мотивам, являющимися так называемыми «горячими точками» РНК, в наибольшей степени склонными и к спонтанному гидролизу. Основными гидролизуемыми связями являются фосфодиэфирные связи U4-G5, U7-Ag и Un-An в шпильке 1, С22-А2з в одноцепочечном участке между шпильками 1 и 3 , U32-A33, U41-A42, U51-A52 и С54-А55 в шпильке 3, C6g-Аб9 в шпильке 4, U77-A78 и U88-A89 в шпильке 5 , а также С91-А92 (рис. 14). Из 29 фосфодиэфирных связей, подвергающихся расщеплению, 12 связей расположены в СрА- и UpA-последовательностях. Таким образом, в реакции гидролиза РНК альбумин проявляет, главным образом, пиримидин-A специфичность. В присутствии бычьего сывороточного альбумина (BSA) расщепление фосфодиэфирных связей в субстрате также наблюдается, в основном, по CpA/UpA-мотивам. Рассчитанные значения констант скорости образования продуктов гидролиза РНК в присутствии HSA и BSA составляют 0,028 ± 0,006 мин"1 и 0,0033 ± 0,0003 мин"1, соответственно. Таким образом, альбумин из бычьей сыворотки на порядок менее эффективен в реакции гидролиза РНК, чем его человеческий аналог.

6. Влияние гликирования и Д^-гомоцистеинилирования на РНК-гидролизующую активность альбумина

Как было показано выше (раздел 2), клинически значимые химические модификации человеческого сывороточного альбумина - гликирование и iV-гомоцистешшлирование - влияют на способность белка связывать нуклеиновые кислоты. Так как модификация может затрагивать функционально-значимые остатки лизина, нельзя исключить, что это может повлиять на биологическую активность белка, в частности, на его способность катализировать реакцию гидролиза РНК.

Влияние пост-трансляционных модификаций HSA на его РНК-гидролизующую активность изучали, используя в качестве субстрата 5'-32Р-меченый олигорибонуклеотид ON16. Из данных рис. 15 видно, что как гликирование, так и Л/-гомоцистеинилирование, приводят к снижению РНК-гидролизующей активности HSA. Так, за 2,5 ч в присутствии gHSA или Hcy-HSA олигорибонуклеотид расщепляется на 27 % и 44 % соответственно, тогда как немодифицированный альбумин в тех же условиях индуцирует расщепление ON16 более чем на 70 %. Специфичность расщепления олигонуклеотидной мишени при модификации альбумина практически не изменяется. Основными сайтами расщепления олигорибонуклеотида в

присутствии всех форм альбумина являются связи между Ш-А8 и и9-А10 (рис. 15).

L _ т| ,.с 1 2 3 Рис. 1S. Радиоавтограф геля при электрофоретическом анализе 1 продуктов гидролиза ON16 в присутствии HSA (дор. 1), Hcy-HSA

(дор. 2) или gHSA (дор. 3). Дор. L - расщепление ON16 в ' ¿J ч.-»- .г 1 ^ M имидазольиом буфере (рН 7,0), дор. Т1 - гидролиз ON16 под

действием РНКазы Т1, дор. С - продукты спонтанного гидролиза ON16. Условия расщепления - 50мМТрис-НС1 (рН 7,0), 0,2 M КС], 0,5 мМ EDTA, 1 * 10 "'M [5'-32P]ON16, 1 * 10 5M HSA, gHSA Л Щ* ~ или Hcy-HSA, 37 °С, 2,5 ч.

7. Установление сайта связывания альбумина с олигорибонуклеотидами

Важным аспектом при изучении структуры белково-нуклеиновых комплексов является установление аминокислотных остатков, взаимодействующих с функциональными группами нуклеиновых кислот. Для определения аминокислотных остатков НБА, взаимодействующих с

олигорибонуклеотидным субстратом, использовали фосфорилирующий аналог субстрата - цвиттер-ионный амидофосфат гексауридилата (ВМАР-р(и),;) (рис. 16).

н3сч.

N

н3с

N-plUls

Рис. 16. Структура фосфорилирующего аналога субстрата.

По данным "Р-ЯМР-спектроскопии, основными

продуктами реакции при модификации НБА ОМАР-р(и)6 является конъюгат олиго-нуклеотида с белком, в котором фосфорилированы остатки лизина или тирозина (схема 2). Ковалентные аддукты р(11)б с альбумином, образованные при взаимодействии фосфорилирующего аналога субстрата с боковым радикалом тирозина,

Схема 2.

течением времени

неустойчивы и

гидролизуются с образованием исходного фосфомоноэфира олигонуклеотида.

По данным масс-спектрометрии, модифицированный альбумин содержит одну молекулу гексауридилата на молекулу белка (ДА/ = 1854 Да). В результате модификации альбумина БМАР-р(и)6 образуется ковалентный аддукт, электрофоретическая подвижность которого меньше, чем исходного олигонуклеотида (рис. 17, дор. 2 и 3). Немодифицированный белок не

визуализируется при окрашивании геля (рис. 17, дор. 1). Добавление в реакционную смесь свободного олигонуклеотида той же последовательности приводит к снижению степени модификации (рис. 17, дор. 4). Это свидетельствует о том, что фосфорилирование альбумина БМАР-р(и)6 происходит внутри сайта связывания олигонуклеотида в составе белка.

1

HSA-p(U)6 —

Рис. 17. Электрофоретический анализ продуктов модификации HSA фосфорилирующим производным p(U)6. Дор. 1 - HSA; дор. 2 - p(U)6; дор. 3 - реакционная смесь при инкубации HSA (1 х 10 "3 М) с DMAP-p(U)6 (2 * 10 ~3 М) при 37 °С в течение 23 ч; дор. 4 - реакционная смесь при инкубации HSA, предварительно выдержанного с 10-кратным мольным избытком p(U)6 в течение 30 мин, с DMAP-p(U)i при 37 °С в течение 23 ч. Гель окрашен «Stains-All».

P(U). -

Модификация остатков лизина в молекуле альбумина приводит к снижению РНК-гидролизующей активности белка (рис. 18). За 15 мин под действием нативного ГОА расщеплялось 88 % ОЫ16, тогда как в присутствии модифицированного альбумина расщеплялось только 63 % олигорибонуклеотида. Совокупность полученных данных указывает на то, что аминокислотные остатки, взаимодействующие с фосфорилирующим аналогом субстрата, локализованы в сайте связывания альбумина с олигонуклеотидами.

С 12 3 4

Рис. 18. Электрофоретический анализ продуктов гидролиза

(>N16 в присутствии ША-р(и)б (дор. 1 и 2) или ШИИРЧИИЯРИВ ЩШ& немодифицированного ША (дор. 3 и 4). Дор. С - продукты спонтанного гидролиза ОШ6. Условия расщепления -50 мМ трис-НС1 (рН 7,0), 0,2 М КС1, 0,5 мМ ЕЬТА, 1 * 10 "6М [5'-32Р]ОШ6, 5 х 10 5 М НЭА или ША-р(и)6, 37 °С, 15 мин (дор. 1 и 3) и 30 мин (дор. 2 и 4).

С целью определения аминокислотных остатков каталитического центра альбумина белок, модифицированный фосфорилирующим производным гексауридилата, гидролизовали трипсином. Модифицированные пептиды после элюции из геля анализировали МАЬБ1-ТОР масс-спектрометрией. Поиск соответствия масс полученных пептидов альбумина с массами, рассчитанными теоретически, проводили с помощью программы Ршс1Рер1 (Оа1:йкег е1. а1., 2002). Поскольку в условиях регистрации масс-спектров фосфамидная связь неустойчива, в масс-спектрах модифицированных пептидов регистрировались сигналы от пептидов, не содержащих олигонуклеотид, но имеющих, по крайней мере, один пропущенный сайт расщепления. В результате анализа полученных спектров выявлено два

пептида, содержащих остатки лизина, после которых не наблюдалось расщепления модифицированного НБА трипсином (табл. 4). На роль аминокислотных остатков, подвергающихся модификации при взаимодействии ША с фосфорилирующим производным гексауридилага, претендуют остатки лизина в положении 205, 212, 413, 414 и 432 полипептидной цепи.

Таблица 4

Пептиды, выявляемые при трипсинолизе ША-р(11)б

Пептид [M+HfTe4> [М+Н]+,ксп

200-С AS LQKFGER AFKAW AV ARLSQRFPK-225 2995,62 2995,73

411-YTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSK-436 2815,60 2816,06

* Остатки лизина, предположительно подвергающиеся модификации фосфорилирующим производным ОМАР-р(и)б, выделены жирным шрифтом.

Рис. 19. Структура участка связывания альбумина с олигорибонуклеотидами. На модели HSA, взятой из Protein Data Bank (pdble78), отмечены остатки лизина (красным), входящие в состав модифицированных пептидов, и остаток Туг-452 (зеленым).

Из модели структуры сайта связывания альбумина с

олигорибонуклеотидами видно, что остатки Lys-205 и Lys-432, входящие в состав модифицированных пептидов, ориентированы внутрь полости, образованной между субдоменами IIA и ША HSA (рис. 19). В непосредственной близости от Lys-432 расположен Туг-452, который может претендовать на роль остатка тирозина, подвергающегося фосфорилированию на начальной стадии модификации альбумина DMAP-p(U)6. Можно предположить, что производное олигонуклеотида связывается в полости между субдоменами IIA и ША альбумина таким образом, что его 5 -концевая фосфатная группа оказывается расположенной вблизи остатков Lys-205, Lys-342 и Туг-452.

выводы

1. Сравнительный анализ эффективности и специфичности связывания белков плазмы крови человека с полирибонуклеотидами (поли(А), поли(О), поли(и), и поли(С)) и их дуплексами (поли(А)* поли(11) и поли(С)* поли(С)) показал, что наиболее эффективно с гомополипуриновыми последовательностями как одноцепочечными, так и в составе комплементарных комплексов связывается белок, соответствующий, по данным гель-электрофоретического, МАЬОГ-ТОР масс-спектрометрического и иммуноферментного анализа, сывороточному альбумину человека.

2. Впервые показано, что человеческий сывороточный альбумин катализирует гидролиз РНК. На основании выполнения некоторых общепринятых критериев установлено, что РНК-гидролизующая активность является собственным свойством альбумина. Каталитические свойства и субстратная специфичность альбумина в реакции гидролиза РНК отличаются от свойств секреторных РНКаз человека. Эффективность альбумина в реакции деполимеризации гомополирибонуклеотидов уменьшается в ряду поли(С) > поли(и) > поли(А). С наибольшей эффективностью альбумин расщепляет фосфодиэфирные связи 11рА- и СрА-сайтов в гетерогенных олиго- и полирибонуклеотидах.

3. Методами 31Р-ЯМР спектроскопии и анионообменной хроматографии установлено, что гидролиз РНК под действием альбумина протекает по механизму внутримолекулярной трансэтерификации с образованием продуктов с 2',3'-циклофосфодиэфирной группировкой, которые далее медленно гидролизуются с образованием нуклеозид-3'- и нуклеозид-2'-фосфомоноэфиров. Зависимость скорости расщепления альбумином фосфодиэфирных связей в РНК от рН свидетельствует о том, что гидролиз протекает по механизму кислотно-основного катализа.

4. Впервые обнаружено, что клинически значимые химические модификации человеческого сывороточного альбумина - гликирование и /У-гомоцистеинилирование - приводят к снижению эффективности гидролиза РНК более чем на порядок, в то время как сродство альбумина к нуклеиновым кислотам при модификации незначительно увеличивается.

5. Методами аффинной модификации альбумина фосфорилирующим производным гексауридилата и МЛЬИ-ТОБ масс-спектрометрии обнаружено, что в участке связывания альбумина с олигорибонуклеотидами локализованы остатки лизина как из субдомена ПА (Ьуз-205 и Ьуз-212), так и из субдомена ША (Ьу$-432) белка.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Gerasimova Y. V., Alekseyeva I. V., Bogdanova T. G., Erchenko I. A., Kudryashova N. V., Chelobanov B. P., Laktionov P. P., Alekseyev P. V., Godovikova T. S. Affinity separation of polyribonucleotide-binding human blood proteins // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006. V. 16. P. 5526-5529.

2. Gerasimova Y. V.. Erchenko I. A., Godovikova T. S. Interaction of non-enzymatically glycated HSA with polyribonucleotide ligands // J. Biomol. Struct. Dyn. 2007. V. 24. P. 690-691.

3. Gerasimova Y. V., Erchenko I. A., Shakirov M. M„ Godovikova T. S. Interaction of human serum albumin and its clinically relevant modification with oligoribonucleotides // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008. V. 18. P. 4511^514.

4. Gerasimova Y. V., Knorre D. G., Shakirov M. M., Godovikova T. S. Human serum albumin as a catalyst of RNA cleavage: Л'-Homocystcinylation and N-phosphorylation by oligonucleotide affinity reagent alter the reactivity of the protein // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008. V. 18. P. 5396-5398.

Подписано к печати 19.05.2009. Формат бумаги 60x84 1/16. 1,4 печ. л. Тираж 100 экз. Заказ № 0519. Отпечатано ООО «Нонпарель», 630090, Новосибирск, ул. Институтская 4/1, тел 330-26-98

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

РАЗДЕЛ 1. СЫВОРОТОЧНЫЙ АЛЬБУМИН: ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ЛИГАНДАМИ И КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА обзор литературы)

1.1. Структура и взаимодействие сывороточного альбумина с лигандами

1.2. Каталитические свойства сывороточного альбумина

1.2.1. Сывороточный альбумин как гидролаза

1.2.1.1. Гидролиз сложных эфиров

1.2.1.2. Гидролиз тиоэфиров

1.2.1.3. Гидролиз производных фосфорной и фосфоновой кислот

1.2.1.4. Гидролиз амидов и амидофосфатов

1.2.1.5. Гидролиз Р-лактамных антибиотиков

1.2.1.6. Гидролиз бензизоксазола

1.2.2. Сывороточный альбумин как лиаза

1.2.3. Сывороточный альбумин как изомераза •

1.2.3.1. Кето-енольная таутомерия и структурная изомеризация эпоксисоединений

1.2.3.2. Перемещение двойной связи

1.2.4. Сывороточный альбумин как оксидоредуктаза

1.2.5. Роль лизина в реакциях, катализируемых сывороточным альбумином

Сывороточный альбумин — важнейший транспортный белок, осуществляющий депонирование и перенос многих эндогенных метаболитов и ксенобиотиков в плазме крови, межклеточной жидкости и лимфе [1]. Универсальность транспортной функции альбумина обеспечивается его уникальной способностью связывать лиганды различной химической природы: жирные и желчные кислоты, билирубин, стероидные и тиреоидные гормоны, а также многие лекарственные вещества.

Кроме низкомолекулярных лигандов, альбумин связывает также и биополимеры, например, пептиды [2] и нуклеиновые кислоты [1, 3,4]. На данный момент получены убедительные доказательства того, что альбумин не только связывает дезоксирибонуклеиновые кислоты, но и способствует их проникновению в клетки [5, 6]. В то же время взаимодействие человеческого сывороточного альбумина с РНК ограничено исследованиями на уровне определения констант связывания с тРНК [7].

Одной из важных функций, присущей сывороточному альбумину, является его способность катализировать многие химические реакции [1,8]. В последние годы было показано, что в присутствии бычьего сывороточного альбумина наблюдается деполимеризация РНК [9]. Что касается человеческого сывороточного альбумина, на момент выполнения настоящей работы данные по РНК-гидролизующей активности белка в литературе отсутствовали. Так как концентрация данного белка в плазме крови высока (~ 0,6 мМ), взаимодействие альбумина с внеклеточными РНК может существенно влиять на их стабильность в крови, биораспределение и метаболизм.

Фракция альбумина в сыворотке крови гетерогенна и содержит, наряду с нативпым белком, ряд пост-траисляционно модифицированных форм. Различные модифицированные формы человеческого сывороточного альбумина обнаруживаются, главным образом, при патологии. Так, например, альбумин в крови подвергается гликированию с образованием продуктов, ответственных за развитие осложнений при сахарном диабете [10]. Взаимодействие альбумина с циркулирующим в крови тиолактоном гомоцистеина приводит к образованию ТУ-гомоцистеинилированного белка, вызывающего аутоиммунный ответ и способствующего развитию атеросклероза и сердечно-сосудистых заболеваний [11]. Модификация альбумина может привести к изменению его структуры и, как следствие, лиганд-связывающей способности. Если для комплексов нативного альбумина с нуклеиновыми кислотами получены некоторые физико-химические характеристики, то в случае модифицированных альбуминов не исследована ни эффективность их связывания с нуклеиновыми кислотами, ни их способность гидролизовать данные лиганды. Развитие работ в этом направлении может не только привести к расширению знаний о роли и функции альбумин-нуклеиновых комплексов в процессах жизнедеятельности человека в норме и при патологии, но и представляет определенный клинический интерес, так как будет способствовать разработке новых диагностических и прогностических методов и созданию новых лекарственных средств.

Таким образом, для установления причин исключительной полифункциональности человеческого сывороточного альбумина, обуславливающего его биологическую роль в организме, а также в связи с перспективой использования антисмысловых олигонуклеотидов или иитерферирующих РНК в качестве терапевтических средств, детальное изучение процессов взаимодействия как нативного человеческого сывороточного альбумина, так и его клинически значимых химически модифицированных форм альбуминов с такими важными молекулами как РНК представляется актуальным.

Целью настоящей работы являлось исследование взаимодействия нативного и химически модифицированных форм (гликированного и тУ-гомоцистеинилированного) человеческого сывороточного альбумина с РНК, а также сравнительный анализ способности альбумина и других белков нефракционированной плазмы крови связывать гомополирибонуклеотиды и их комплементарные комплексы.

В ходе исследования решались следующие задачи:

• анализ эффективности и специфичности взаимодействия препарата альбумина и белков плазмы крови с полирибонуклеотидами (поли(А), поли(О), поли(и), и поли(С)) и их дуплексами (поли(А).поли(Ц) и поли(С).поли(С));

• исследование способности альбумина катализировать гидролиз олигорибонуклеотидов, полирибонуклеотидов, и РНК;

• изучение каталитических свойств (кинетических параметров реакции, влияния ионов металлов и рН на скорость реакции) и субстратной специфичности альбумина в реакции гидролиза РНК;

• изучение механизма деполимеризации нуклеиновых кислот под действием альбумина посредством определения структуры продуктов реакции методом 31Р-ЯМР спектроскопии;

• изучение влияния клинически значимых химических модификаций альбумина -гликирования и ТУ-гомоцистеинилирования — на связывание белка с олиго- и полирибонуклеотидами, а также на его РНК-гидролизующую активность;

• проведение аффинной модификации альбумина фосфорилирующим производным олигорибонуклеотидного субстрата и определение аминокислотных остатков альбумина, участвующих в связывании олигорибонуклеотидов, методом л 1

МА1Л)1-ТОР масс-спектрометрии и Р-ЯМР-спектроскопии.

Выводы

1. Сравнительный анализ эффективности и специфичности связывания белков плазмы крови человека с полирибонуклеотидами (поли(А), поли(С), поли(и), и поли(С)) и их дуплексами (поли(А).поли(и) и поли(С).поли(С)) показал, что наиболее эффективно с гомополипуриновыми последовательностями как одноцепочечными, так и в составе комплементарных комплексов связывается белок, соответствующий, по данным гель-электрофоретического, МАЬ01-Т0Р масс-спектрометрического и иммуноферментного анализа, сывороточному альбумину.

2. Впервые показано, что человеческий сывороточный альбумин катализирует гидролиз РНК. На основании выполнения некоторых общепринятых критериев установлено, что РНК-гидролизующая активность является собственным свойством альбумииа. Каталитические свойства и субстратная специфичность альбумина в реакции гидролиза РНК отличаются от свойств секреторных РНКаз человека. Эффективность альбумина в реакции деполимеризации гомополирибонуклеотидов уменьшается в ряду поли(С) > поли(и) > поли(А). С наибольшей эффективностью альбумин расщепляет фосфодиэфирные связи ирА- и СрА-сайтов в гетерогенных олиго- и пол ирибону клеотидах.

3. Согласно данным 31Р-ЯМР спектроскопии и анионообменной хроматографии установлено, что гидролиз РНК под действием альбумина протекает по механизму внутримолекулярной траисэтерификации с образованием продуктов с 2',3'-циклофосфодиэфирной группировкой, которые далее медленно гидролизуюгея с образованием нуклеозид-3'- и нуклеозид-2'-фосфомоноэфиров. Анализ зависимости скорости расщепления альбумином фосфодиэфирных связей в РНК от рН свидетельствует о том, что гидролиз протекает по механизму кислотно-основного катализа.

4. Впервые обнаружено, что клинически значимые химические модификации человеческого сывороточного альбумина — гликирование и А^-гомоцистеинилирование - приводят к снижению эффективности гидролиза РНК более чем на порядок, в то время как сродство альбумина к нуклеиновым кислотам при модификации незначительно увеличивается.

5. Методами аффинной модификации альбумина фосфорилирующим производным гексауридилата МАЬОГ-ТОР масс-спектрометрии обнаружено, что в участке связывания альбумина с олигорибонуклеотидами локализованы остатки лизина как из субдомена ПА (Ьуз-205 и ЬуБ-212), так и из субдомена ША (Ьуз-432) белка.

1. Peters Jr. Т. All about albumin: biochemistry, genetics and medical applications. San Diego: Academic Press, 1996. pp. 432.

2. Власов В.В., Паутова J1.B., Рыкова Е.Ю., Якубов JI.A. Взаимодействие олигонуклеотидов с белками сыворотки крови // Биохимия. 1993. Т. 58. С. 1247—1251.

3. Лактионов П.П., Брыксин А.В., Рыкова Е.Ю., Власов В.В. Исследование олигонуклеотид-белковых взаимодействий в крови in vivo II Бюл. Эксп. Биол. Мед. 1999. Т. 127. С. 654-657.

4. Arnedo A., Irache J.M., Gonzalez Gaitano G., Valganon M., Espuelas S. Bovine serum albumin modified the intracellular distribution and improved the antiviral activity of an oligonucleotide // J. Drug Target. 2003. V. 11. P. 197-204.

5. Arnedo A., Irache J.M., Merodio M., Espuelas S., Millan M.S. Albumin nanoparticles improved the stability, nuclear accumulation and anticytomegaloviral activity of a phosphodiester oligonucleotide // J. Control Release. 2004. V. 94. P. 217-227.

6. Malonga H., Neault J.F., Tajmir-Riahi H.A. Transfer RNA binding to human serum albumin: a model for protein-RNA interaction // DNA Cell Biol. 2006. V. 25. P. 393-398.

7. Kragh-Hansen U., Chuang Victor T.G., Otagiri M. Practical aspects of the ligand -binding and enzymatic properties of human serum albumin // Biol. Pharm. Bull. 2002. V. 25. P. 695-704.

8. Ulrich P., Cerami A. Protein glycation, diabetes and aging // Recent Prog. Horm. Res. 2001. V. 56. P. 1-21.

9. Jakubowski H. Pathophysiological consequences of homocysteine excess // J. Nutr. 2006. V. 136. P. 1741S—1749S.

10. Carter D.C., Ho J.X. Structure of serum albumin // Adv. Protein. Chem. 1994. V. 45. P. 153-203.

11. Sugio S., Kashima A., Mochizuki S., Noda M., Kobayashi K. Crystal structure of human serum albumin at 2.5 A resolution // Protein. Eng. 1999. V. 12. P. 439^146.

12. Sudlow G., Birkett D. J., Wade D. N. The characterization of two specific drug binding sites on human serum albumin I I Mol. Pharmacol. 1975. V. 11. P. 824-832.

13. Petersen C.E., Ha C.-E., Harohalli K., Feix J.B., Bhagavan N. V. A dynamic model for bilirubin binding to human serum albumin // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 20985-20995.

14. Adams P.A., Berman M.C. Kinetics and mechanism of the interaction between human serum albumin and monomeric haemin // Biochem. J. 1980. V. 191. P. 95-102.

15. Pearlman W.H., Crepy O. Steroid-protein interaction with particular reference to testosterone binding by human serum // J. Biol. Chem. 1967. V. 242. P. 182-189.

16. Petitpas I., Bhattacharaya A.A., Twine S., East M., Curry S. Crystal structure analysis of warfarin binding to human serum albumin: anatomy of drug site I // J. Biol. Chem. 2001. V 276. P.22804-22809.

17. Viani A., Cappiello M., Silvestri D., Pacifici G.M. Binding of furosemide to albumin isolated from human fetal and adult serum //Dev. Pharmacol. Ther. 1991. V. 16. P. 33-40.

18. Montero M.T., Pouplana R., Vails O., Garcia S. On the binding of cinmethacin and indomethacin to human serum albumin // Pharm. Pharmacol. 1986. V. 38. P. 925-927.

19. Ghuman J., Zunszain P.A., Petitpas I., Bhattacharaya A.A., Otagiri M., Curry S. Structural basis of the drug-binding specificity of human serum albumin // J. Mol. Biol. 2005. V. 353. P.38-52.

20. Kragh-Hansen U. Evidence for a large and flexible region of human serum albumin possessing high affinity binding sites for salicylate, warfarin, and other Iigands // Mol. Pharmacol. 1988. V. 34. P. 160-171.

21. Walanabe H., Tanase S., Nakajou K., Maruyama T., Kragh-Hansen U., Otagiri M. Role of Arg-410 and Tyr-411 in human serum albumin for Iigand binding and esterase-like activity//J. Biochem. 2000. V. 349. P. 813-819.

22. Keire D.A., Mariappan S. V., Peng J., Rabenstein D.J. Nuclear magnetic resonance studies of the binding of captopril and penicillamine by serum albumin // Biochem. Pharmacol. 1993. V. 46. P. 1059-1069.

23. McMenamy R.H., Oncley J. L. The specific binding of Z-tryptophan to serum albumin // Biol. Chem. 1958. V. 223. P. 1436-1447.

24. Petitpas /., Petersen C.E., Ha C.E., Bhattacharaya A.A., Zunszain P.A., Ghuman J. Structural basis of albumin-thyroxine interactions and familial dysalbuminemic hyperthyroxinemia // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 6440-6445.

25. Wanwimolruk S., Birkett D. J., Brooks P. M. Structural requirements for drug binding to site II on human serum albumin // Mol. Pharmacol. 1983. V. 24. P. 458-463.

26. Irikura M., Takadate A., Goya S., Otagiri M. 7-Alkylaminocournarin-4-acetic acids as fluorescent probe for studies of drug-binding sites on human serum albumin // Chem. Pharm. Bull. 1991. V. 39. P. 724-728.

27. Nerli B., Romanini D., Pico G. Structural specificity requirements in the binding of p-lactam antibiotics to human serum albumin // Chem. Biol. Interact., 1997. V. 104. P.179-202.

28. Bhatacharya A. A., Curry S., Frank N. P. Crystallographic analysis reveals common modes of medium and long-chain fatty acids to human serum albumin // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 38731-38738.

29. Sengupta S., Chen H., Tagawa T., DiBello P.M., Majors A.K., Budy B., Ketterer M.E., Jacobsen D.W. Albumin thiolate anion is an intermediate in the formation of albumin-S'-S'-homocysteine Hi. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 30111-30117.

30. Narazaki R., Otagiri M. Covalent binding of a bucillamine derivative with albumin in sera from healthy subjects and patients with various diseases // Pharm. Res. 1997. V.14. P.351-353.

31. Ivanov A. I., Christodoulou J., Parkinson J. A., Barnham K. J., Tuker A., Woodrow J., Sadler P. J. Cisplatin binding sites on human serum albumin I I J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P.14721-14730.

32. Geselowitz D.A., Neckers L.M. Bovine serum albumin is a major oligonucleotide-binding protein found on the surface of cultured cells // Antisense Res. Dev. 1995. V. 5. P. 213-217.

33. Agrawal S. In vivo pharmacokinetics of oligonucleotides // Applied antisense oligonucleotide technology / Eds. Stein C.A., Krieg A.M. New York: Wiley-Liss, 1998. P. 365-386.

34. Srinivasan S.K., Tewary H.K., Iversen P.L. Characterization of binding sites, extent of binding, and drug interactions of oligonucleotides with albumin // Antisense Res. Dev. 1995. V. 5. P. 131-139.

35. Malonga H., Neault J.F., Tajmir-Riahi H.A. DNA interaction with human serum albumin studied by affinity capillary electrophoresis and FTIR spectroscopy // DNA Cell Biol. 2006. V. 25. P. 63-68.

36. Tiruppathi C., Finnegan A., Malik A.B. Isolation and characterization of a cell surface albumin-binding protein from vascular endothelial cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 250-254.

37. Li B., Sedlacek M., Manoharan I., Boopathy R., Duysen E. G., Masson P., Lockridge O. Butyrylcholinesterase, paraoxonase, and albumin esterase, but not carboxylesterasc, are present in human plasma // Biochem. Parmacol. 2005. V. 70. P. 1673-1684.

38. Wilde C.E., Kekwick G.O. The arylesterase of human serum // Biochem. J. 1964. V. 91. P. 297-307.

39. Casida J.E., Augustinsson K.-B. Reaction of plasma albumin with I-naphtyl iV-methylcarbamate and certain other esters // Biochim. Biophys. Acta. 1959. V. 36. P. 411^26.

40. Wolfbeis O.S., Gurakar A. The effect of fatty acid chain length on the rate of arylester hydrolysis by various albumins // Clin. Chim. Acta. 1987. V. 164. P. 329-337.

41. Matsushita S., Ishima Y., Chuang V. T. G., Watanabe II., Tanase S., Maruyama T., Otagiri M. Functional analysis of recombinant human serum albumin domains for pharmaceuticals applications // Pharm. Res. 2004. V. 21. P. 1924-1932.

42. Ozeki Y., Kurono Y., Yotsuyanagi T., Ikeda K. Effects of drug binding on the esterase activity of human serum albumin: inhibition modes and binding sites of anionic drugs // Chem. Pharm. Bull. 1980. V. 28. P. 535-540.

43. Ahmed N., Dobler D., Dean M., Thornalley P. J. Peptide mapping identifies hotspot site of modification in human serum albumin by methylglyoxal involved in ligand binding and esterase activity // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 5724-5732.

44. Means G.E., Bender M.L. Acetylation of human serum albumin by p-nitrophenyl acetate // Biochemistry 1975. V. 14. P. 4989-4994.

45. Masson P., Froment M. T., Darvesh S., Schopfer L. M., Lockridge O. Aryl acylamidase activity of human serum albumin with o-nitrotrifluoroacetanilide as the substrate // J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 2007. V. 22. P. 463^69.

46. Branden C., Tooze J. Introduction to Protein Structure. New York: Garland Publishing Inc., 1991. P. 205-222.

47. He X.M., Carter D.C. Atomic structure and chemistry of human serum albumin // Nature. 1992. V. 358. P. 209-215.

48. Salvi A., Corrupt P.-A., Mayer J. M., Teste B. Esterase-like activity of human serum albumin toward prodrug esters of nicotinic acid' // Drug Metab. Dispos. 1997. V. 25. P. 395-398.

49. Dubois-Presle N., Lapicque F., Maurice M. II, Fournel-Gigleux S., Magdalou J., Abiteboul M., Siest G,, Netter P. Stereoselective esterase activity of human serum albumin toward ketoprofen glucuronide // Mol. Pharmacol. 1995. V. 47. P. 647-653.

50. Aso Y, Yoshioka S., Takeda Y. Epimerization and racemization of some chiral drugs in the presence of human serum albumin // Chem. Pharm. Bull. 1990. V. 38. P. 180-184.

51. Kurono Y., Kondo T., Ikeda K. Esterase-like activity of human scrum albumin: enantioselectivity in the burst phase of reaction with p-nitrophenyl alpha-methoxyphenyl acetate //Arch. Biochem. Biophys. 1983. V. 227. P. 339-341.

52. Hawkins D, Pinckard R.N., Farr R.S. Acetylation' of human serum albumin by acetylsalicylic acid // Science. 1968. V. 160. P. 780-781.

53. Pinckard R.N., Hawkins D., Farr R.S. In vitro acetylation of plasma proteins, enzymes and DNA by aspirin //Nature. 1968. V. 219. P. 68-69.

54. Hawkins D., Pinckard R.N., Crawford I.P., Farr R.S. Structural changes in human serum albumin induced by ingestion of acetylsalicylic acid // J. Clin. Invest. 1969. V. 48. P. 536-542.

55. Walker J. E. Lysine residue 199 of human serum albumin is modified by acetylsalicylic acid // FEBS Lett. 1976. V. 66. P. 173-175.

56. Yang F., Bian C., Zhu L., Zhao G., Huang Z., Huang M. Effect of human serum albumin on drug metabolism: structural evidence of esterase activity of human serum albumin // J. Struct. Biol. 2007. V. 157. P. 348-355.

57. Gerig J.T., Reinheimer J.D. Modification of HSA with trifluoromethyl-substituted aryl halides and sulfonates // J. Am. Chem. Soc. 1975. V. 97. P. 168-173.

58. Gerig J.T., Katz K.E., Reinheimer J.D. Reaction of 2,6-dinitro-4-trifluoromethylbenzenesulfonate with HSA // Biochim. Biophys. Acta. 1978. V. 534. P. 196-209.

59. Diaz N. Suarez D., Sordo T.L., Merz K.M. Molecular dynamics study of the IIA binding site in human serum albumin: influence of protonation state of Lysl95 and Lysl99 // J. Med. Chem. 2001. V. 44. P. 250-260.

60. Honma K.N.M., Ishikawa Y. Acetylsalicylate-human serum albumin interaction as studied by NMR spectroscopy antigenicity-producing mechanism of acetylsalicylic acid // Mol. Immunol. 1991. V. 28. P. 107-113.

61. Sogorb M. A., Carrera V., Benabent M., Vilanova E. Rabbit serum albumin hydrolyzes the carbamate carbaryl // Chem. Res. Toxicol. 2002. V. 15. P. 520-526.

62. Sogorb M. A., Carrera V., Vilanova E. Hydrolysis of carbaryl by human serum albumin //Arch. Toxicol. 2004. V. 78. P. 629-634.

63. Kurooka S., Yoshimura Y. Mercaptoethanol release upon interaction of S-lauroylmercaptoethanol with serum albumin // J. Biochem. 1973. V. 74. P. 785-795.

64. Agarwal R. P., Phillips M., McPherson R. A., Hensley P. Serum albumin and the metabolism of disulfiram // Biochem. Pharmacol. 1986. V. 35. P. 3341-3347.

65. Mourik J., de Jong L. P. Binding of the organophosphated parathion and paraoxon to bovine and human serum albumin // Arch. Toxicol. 1978. V. 41. P. 43^8.

66. Sultatos L. G., Basker K. M., Shao M., Murphy S. D. The interaction of the phosphorothioate insecticides chlorpyrifos and parathion and their analogues with bovine serum albumin // Mol. Pharmacol. 1984. V. 26. P. 99-104.

67. Ortigoza-Ferado J., Richter R.J., Hornung S.K., Motulsky A.G., Furlong C.E. Paraoxon hydrolysis in human serum mediated by a genetically variable arylesterase and albumin // Am. J. Hum. Genet. 1984. V. 36. P. 295-305.

68. Means G.E., Wu H.L. The reactive tyrosine residue of human serum albumin: characterization of its reaction with diisopropylfluorophosphate // Arch. Biochem. Biophys. 1979. V. 194. P. 526-530.

69. Li B., Schopfer L.M.,< Hinrichs S.H., Masson P., Lockridge O. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass apectrometry assay for organophosphorus toxicants bound to human albumin at Tyr411 // Anal. Biochem. 2007. V. 361. P. 263-272.

70. Black R.M., Harrison J.M., Read R. W. The interaction of sarin and soman with plasma proteins: the identification of a novel phosphonylation site // Arch. Toxicol. 1999. V. 73. P. 123-126.

71. Williams NH., Harrison J.M., Read R.W., Black R.M. Phosphylated tyrosine in albumin as a biomarker of exposure to organophosphorus nerve agents // Arch. Toxicol. 2007. V. 81. P. 627-639.

72. Li B., Nachon F., Froment M.-T., Verdier L., Debouzy J.-C., Brasme B., Gillon E., Schopfer L. M., Lockridge O., Masson P. Binding and hydrolysis of soman by human serum albumin//Chem. Res. Toxicol/2008. V. 21. P. 421^31.

73. Manoharan I., Boopathy R. Diisopropylfluorophosphate-sensitive aryl acylamidase activity of fatty acid free human serum albumin // Arch. Biochem. Biophys. 2006. V. 452. P. 186-188.

74. Ohta N., Kurono Y., Ikeda K. Esterase-like activity of human serum albumin. 11: Reaction with iV-trans-cinnamoylimidazoles // J. Pharm. Sei. 1983. V. 72. P. 385-388.

75. Kwon C.-H., Maddison K., LoCastro L., Borch R. F. Accelerated decomposition of 4-hydroxycyclophosphamide by human serum albumin // Cancer Res. 1987. V. 47. P. 1505-1508.

76. Nerli B., Pico G. Evidence of human serum albumin ß-lactamase activity // Biochem. Mol. Biol. Int. 1994. V. 32. P. 789-795.

77. Nerli B., Garcia F., Pico C. An unknown hydrolase activity of human serum albumin: ß-lactamase activity // Biochem. Mol. Biol. Int. 1995. V. 37. P. 909-915.

78. Bruderlein H., Daniel R., Perras D., DiPaola A., Fidelia A., Belleau B. An investigation of,the destruction of the ß-lactame ring of penems by the albumin drug-binding site //Can. J. Biochem. 1981. V. 59. P. 857-866.

79. Tsuda Y., Tsunoi Т., Watanabe N., Ishida M., Yamada II, Itoh T. Stereoselective binding and degradation of sulbenicillin in the presence of human serum albumin // Chirality. 2001. V. 13. P. 236-243.

80. Yvon M., Wal J.-M. Identification of lysine residue 199 of human serum albumin as a binding site for benzylpenicilloyl groups // FEBS Lett. 1988. V. 239. P. 237-240.

81. Yvon M., Anglade P., Wal J. M. Binding of benzyl penicilloyl to human serum albumin. Evidence of a highly reactive region at the junction of domains 1 and 2 of the albumin molecule // FEBS Lett. 1989. V. 247. P. 273-278.

82. Yvon M., Anglade P., Wal J. M. Identification of the binding sites of benzyl penicilloyl, the allergenic metabolite of penicillin, on the serum albumin molecule // FEBS Lett. 1990. V. 263. P. 237-240.

83. Kikuchi K, Thon S. N., Hilvert D. Albumin-catalyzed proton transfer // J. Am. Chem. Soc. 1996. V. 118. P. 8184-8185.

84. Gueriguian J. Prostaglandin-macromolecule interactions. I. Noncovalent binding of prostaglandins Al, El, F2a, and E2 by human and bovine serum albumins // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1976. V. 197. P. 391-401.

85. Filzpatrick F. A., Wynalda M. A. Albumin-lipid interactions: prostaglandin stability as a probe for characterizing binding sites on vertebrate albumins // Biochemistry. 1981. V. 20. P. 6129-6134.

86. Granstrom E., Hamberg M., Hansson G., Kindahl II. Chemical instability of 15-keto-13,14-dihydro-PGE2: the reason for low assay reliability // Prostaglandins. 1980. V. 19. P. 933-957.9 1 ^

87. Kikawa Y., Narumiya S., Fukushima M., Wakatsuka II, Hayaishi O. 9-Deoxy-A ,A 13,14-dihydroprostaglandin D2, a metabolite of prostaglandin D2 formed in human plasma // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. V. 81. P. 1317-1321.

88. Filzpatrick F. A., Wynalda M. A. Albumin-catalyzed metabolism of prostaglandin D2. Identification of products formed in vitro //J. Biol. Chem. 1983. V. 258. P. 11713-11718.

89. Буко В.У., Заводник И.Б., Степуро И.И. Взаимодействие простагландина Е2 с сывороточным альбумином человека//Биохимия. 1987. Т. 52. С. 891-895.

90. Folco G,C., Granstrom Е., Kindahl Н. Albumin stabilizes thromboxane A2 // FEBS Lett. 1977. V. 82. P. 321-324.

91. Wynalda M. A., Filzpatrick F. A. Albumins stabilize prostaglandin I2 // Prostaglandins. 1980. V. 20. P. 853-861.

92. Filzpatrick F. A., Morton D. R., Wynalda M. A. Albumin stabilizes leukotriene A4 I I J. Biol. Chem. 1982. V. 257. P. 4680^1683.

93. Haeggstrom J., Fitzpatrick F., Radmark O., Samuelsson B. Albumin stabilizes 14,15-leukotriene A4//FEBS Lett. 1983. V. 164. P. 181-184.

94. Hamberg M., Fredholm B.B. Isomerization of prostaglandin H2 into prostaglandin D2 in the presence of serum albumin // Biochim. Biophys. Acta. 1976. V. 431. P. 189-193.

95. Watanabe T., Narumiya S., Shimizu T. Hayaishi O. Characterization of the biosynthetic pathway of prostaglandin D2 in human platelet-rich plasma // J. Biol. Chem. 1982. V. 257. P. 14847-14853.

96. Stehle R.G., Oesterling TO. Stability of prostaglandin El and dinoprostone (prostaglandin E2) under strongly acidic and base conditions // J. Pharm. Sci. 1977. V. 66. P.1590-1595.

97. Fitzpatrick F. A., Liggett W. F., Wynalda M. A. Albumin-eicosanoid interaction. A model system to determine their attributes and inhibition // J. Biol. Chem. 1984. V. 259. P. 2722-2727.

98. Polet H., Levine L Metabolism of prostaglandins E, A, and C in serum // J. Biol. Chem. 1975. V. 250. P. 351-357.

99. Hurst R., Bao Y., Ridley S., Williamson G. Phospholipid hydroperoxide cysteine peroxidase activity of human serum albumin // Biochem. J. 1999. V. 338. P. 723-726.

100. Christodoulou J., Sadler P. J., Tucker A. *H NMR of albumin in human blood plasma: drug binding and redox reactions at Cys 34 // FEBS Lett. 1995. V. 376. P. 1-5.

101. Cha M.-K., Kim I.-H. Glutathione-linked thiol peroxidase activity of human serum albumin: a possible antioxidant role of serum albumin in blood plasma // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. V. 222. P. 619-625.

102. Cha M.-K., Kim I.-H. Disulfide between Cys392 and Cys438 of human serum albumin is redox-active, which is responsible for the thioredoxin-supported lipid peroxidase activity // Arch. Biochem. Biophys. 2006. V. 445. P. 19-25.

103. Kurono Y., Ichioka K., Ikeda K. Kinetics of the rapid modification of human serum albumin with trinitrobenzensulfonate and localization of its site // J. Phar. Sci. 1983. V. 72. P. 432—435.

104. Taylor R. P., VatzJ. B. Bovine serum albumin as a catalyst. Accelerated decomposition ofaMeisenheimer complex//J. Am. Chem. Soc. 1973. V. 95. P. 5819-5820.

105. Taylor R.P., Chau V., Bryner C., Berga S. Bovine serum albumin as a catalyst. II. Characterization of the kinetics // J. Am. Chem. Soc. 1975. V. 97. P. 1934-1943.

106. БурДж. Методы введения нитрозогруппы, реакции нитрозосоединений // Химия нитро- и нирозогрупп / Под ред. Фойера Г. М.: Мир, 1972. Т. С. 194.

107. Бобик Т.В., Воробьев И.И., Пономаренко Н.А., Габибов А.Г., Мироишиков A.PI. Экспрессия человеческого сывороточного альбумина в метилотрофных дрожжах Pichia pastoris и его структурно-функциональный анализ // Биоорган. Химия. 2008. Т. 34. С. 56-62.

108. Гордон А., Форд Р. Спутник химика. М.: Мир. 1976. С. 437-444.121 .Досои Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир. 1991. С. 32-34.

109. Handbook of biochemistry and molecular biology: nucleic acids / Ed. Fasman Т.Е. Cleveland: CRC Press. 1975. P. 589.

110. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

111. Westermeirer R., Naven T. Proteomics in practice: a laboratory manual of proteome analysis. Weinheim: Wiley-VCH. 2002. P. 233-237.

112. Sreerama N., Woody R.W. Estimation of protein secondary structure from circular dichroism spectra: comparison of CONTIN, SELCON, and CDSSTR methods with an expanded reference set // Anal. Biochem. 2000. V. 287. P. 252-260.

113. Скоупс P. Методы очистки белков. M.: Мир. 1985. С. 342.

114. Towbin Н., Staehelin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. V. 9. P. 4350-4356.

115. Chen R.F. Removal of fatty acids from serum albumin by charcoal treatment // J. Biol. Chem. 1967. V. 242. P. 173-181.

116. Schmitt A., Schmitt J., Munch G., Gasic-Milencovich J. Characterization of advanced glycation end products for biochemical studies: side chain modifications and fluorescence characteristics // Anal. Biochem. 2005. V. 338. P. 201-215.

117. Glowacki R., Jakubowski H. Cross-talk between Cys34 and lysine residues in human serum albumin revealed by iV-homocysteinylation // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 10864-10871.

118. Janatova J., Fuller J.K., Hunter M.J. The heterogeneity of bovine serum albumin with respect to sulfhydryl and dimer content // J. Biol. Chem. 1968. V. 243. P. 3612-3622.

119. Lehrer S.S. Solute perturbation of protein fluorescence. The quenching of the tryptophan fluorescence of model compounds and of lysozyme by iodide ion // Biochem. 1971. V. 10. P.3254-3263.

120. Rosental A.L., Lack S.A. Nuclease detection in SDS-polyacrilamide gel electrophoresis //Anal. Biochem. 1977. V. 80. P. 76-90.

121. Маниатис Дж., Фрич О., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир. 1984. С. 132-134.

122. Власов А.В., Власов В.В., Жъеже Р. Катализируемый имидазолом гидролиз РНК как реакция для исследования вторичной структуры РНК и комплексов РНК с олигонуклеотидами // Докл. РАН. 1996. Т. 349. С. 411-413.

123. Donis-Keller Н., Махат А.М\ Gilbert W. Mapping adenines, guanines, and pyrimidines in RNA //Nucleic Acids Res. 1977. V. 4. P. 2527-2538.

124. Mironova N.L., Pyshnyi D.V., Ivanovo E.M., Zenkova M.A., Gross H.J., Vlassov V.V. Covalently attached oligodeoxyribonucleotides induce RNase activity of a short peptide and modulate its base specificity //Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. P. 1928-1936.

125. Репкова M.H., Иванова T.M., Филиппов P.В., Венъяминова А.Г. Фотоактивируемые перфторарилазидные производные олигорибонуклеотидов: синтез и свойства // Биоорган. Химия. 1996. Т. 22. С. 342^40.

126. Gattiker A., Bienvenut W.V., Bairoch A., Gasteiger Е. FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification //Proteomics. 2002. V. 2. P. 1435-1444.

127. Yakubov L., Khaled Z„ Zhang L.M., Truneh A., Vlassov V., Stein C.A. Oligodeoxynucleotides interact with recombinant CD4 at multiple sites // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P.18818-18823.

128. Chen Z., Fadiel A., Naftolin F, Eichenbaum K.D., Xia Y. Circulation DNA: biological implications for cancer metastasis and immunology // Medical Hypothesis. 2005. V. 65. P. 956-961.

129. Benimetscaya L., Loike J.D., Khakled Z., Loike G., Silverstein S.C., Cao L., Elkhoury R.Y., Cai J., Stein C.A. Mac-1 (CDllb/CD18) is an oligodeoxynucleotide-binding protein // Nature Med. 1997. V. 2. P. 414-420.

130. Hanss В., Leal-Pinto E., Bruggeman L.A., Copeland T.D., Klotman P.E. Identification and charactcrization of a cell membrane nucleic acid channel // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 1921-1926.

131. Челобанов Б.П., Лактионов П.П., Харькова M.B., Рыкова Е.Ю., Пышный Д.В., Пышная И.А., Маркус К., Мейер Г.Е., Власов В.В. Взаимодействие кератина К1 с нуклеиновыми кислотами на поверхности клеток // Биохимия. 2003. Т. 68. С. 1540-1549.

132. Chelobanov B.P., Laktionov P.P., Kharkova M.V., Rykova E.Y., Vlassov V.V. Isolation of nucleic acid binding proteins: an approach for isolation of cell surface, nucleic acid binding proteins // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2004. V. 1022. P.239-243.

133. Nevinsky G.A., Buneva V.N. Natural catalytic antibodies-abzymes // Catalytic antibodies / Ed. Keinan E. Weinheim: Wiley-VCH, 2005. P. 534-542.

134. Паутова JI.B., Лактионов П.П., Рыкова Е.Ю., Якубов Л.А., Власов В.В. Исследование сайтов связывания олигонуклеотидов в молекуле иммуноглобулина // Мол. Биол. 1994. Т. 28. С. 1106-1112.

135. Rykova E.Yu., Pautova L.V., Yakubov L.A., Karamyshev V.N., Vlassov V.V. Serum immunoglobulins interact with oligonucleotides // FEBS Lett. 1994. V. 344. P. 96-98.

136. Hollams E.M., Giles KM., Thompson A.M., Leedman P.J. mRNA stability and the control of gene expression: implications for human disease // Neurochcm. Res. 2002. V. 27. P. 957-980.

137. Burd C., Matunis E., Dreyfuss G. The multiple RNA-binding domains of the mRNA poly(A) binding protein have RNA-binding activities // Mol. Cell. Buiol. 1991. V. 11. P. 3419-3424.

138. Gahan P.В., Swaminathan R. Circulating nucleic acids in plasma and serum. Recent developments //Ann. N.Y. Acad. Sci. 2008. V. 1137. P. 1-6.

139. Loke S.L., Stein C.A., Zhang X., Mori K, Nakanishi M., Subasinghe C., Cohen J.S., Neckers L.M. Characterization of oligonucleotide transport into living cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 6474-6479.

140. Leimoni I.D., Sideris D.C., Fragoulis E.G. Purification from normal human plasma and biochemical characterization of a ribonuclease specific for poly(C) and poly(U) // Arch. Biochem. Biophys. 2003. V. 413. P. 83-90.

141. Shariat-Madar Z., Mahdi F., Schmaier A.H. Mapping binding domains of kininogenes on endothelial cell cytokeratin 1 // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 7137-7145.

142. Gonias S.L., Hembrough T.A., Sankovic M. Cytokeratin 8 functions as a major plasminogen in select epithelial and carcinoma cell lines // Front Biosci. 2001. V. 6. P. 1403-1411.

143. Wells M.J., Hatton M.W., Hewlett В., Podor T.J., Sheffield W.P., Blajchman M.A. Cytokeratin 18 is expressed on the hepatocyte plasma membrane surface and interacts with thrombin-antithrombin complexes // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 28574-28581.

144. Ramirez P., Del Razo L.M., Gutierrez-Ruiz M.C., Gonsebatt M.E. Arsenite induces DNA-protein crosslinks and cytokeratin expression in the WRL-68 human hepatic cell line // Carciogenesis. 2000. V. 21. P. 701-706.

145. Acosta J., Hettinga J., Fluckiger R., Krumrei N., Goldjine A., Angarita L., Halperin J. Molecular basis for a link between complement and the vascular complications of diabetes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 5450-5455.

146. Thornalley P. J., Langborg A., Minhas H.S. Formation of glyoxal, methylglyoxal and 3-deoxyglucosone in the glycation of proteins by glucose // Biochem. J. 1999. V. 344. P. 109-116.

147. Ahmed N., Frye E.B., Degenhardt T.P., Thorpe S.R., Baynes J.W. iV-Epsilon-(carboxyethyl)lysine, a product of the chemical modification of proteins by methylglyoxal, increases with age in human lens proteins // Biochem. J. 1997. V. 324. P. 565-570.

148. Paul R.G., Avery N.C., Slatter D.A., Sims T.J., Bailey A. J. Isolation and characterization of advanced glycation end products derived from the in vitro reaction of ribose and collagen // Biochem. J. 1998. V. 330. P. 1241-1248.

149. Hayase F., Nagaraj R.H., Miyata S., Njoroge F.G., Monnier V.M. Aging of proteins: immunological detection of a glucose-derived pyrrole formed during Maillard reaction in vivo II J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 3758-3764.

150. Wilker S.C., Chellan P., Arnold B.M., Nagaraj R.H. Chromatograhic quantification of argpyrimidine, a methylglyoxal-derived product in tissue proteins: comparison with pentosidine //Anal. Biochem. 2001. V. 290. P. 353-358.

151. Sell D.R., Monnier V.M. End-stage renal disease and diabetes catalyze the formation of a pentose-derived crosslink from aging human collagen // J. Clin. Invest. 1990. V. 85. P.380-384.

152. Schmitt A., Gasic-Milencovich J., Schmitt J. Characterization of advanced glycation end products: Mass changes in correlation to side chain modification // Anal. Biochem. 2005. V. 338. P. 201-215.

153. Shaklai N., Garlick R.L., Bunn H.F. Nonenzymatic glycosylation of human serum albumin alters its conformation and function Hi. Biol. Chem. 1984. V. 259. P. 3812-3817.

154. Mendez D.L., Jensen R.A., McElroy L.A., Pena J.M., Esquerra R.M. The effect of non-enzymatic glycation on the unfolding of human serum albumin II Arch. Biochem. Biophys. 2005. V. 444. P. 92-99.

155. Lapolla A., Fedele D., Traldi P. Diabetes and mass spectrometry // Diabetes. Metab. Res. Rev. 2001. V. 17. P. 99-112.

156. Lapolla A., Fedele D., Seraglia R., Catinella S., Baldo L., Aronica R., Traldi P. A new effective method for the evaluation of glycated intact plasma proteins in diabetic subjects // Diabetologia. 1995. V. 38. P. 1076-1081.

157. Jakubowski H. Protein homocysteinylation: possible mechanism underlying pathological consequences of elevated homocysteine levels // FASEB J. 1999. V. 13. P. 2277-2283.

158. Sikora M., Marczak L., Stobiecki M., Twardowski Т., Jakubowski H. Determination of 7V-homocysteinylated albumin in human serum // FEBS J. 2007. V. 274 (supplement 1). P. 295.

159. N'soukpoe-Kossi C.N., St-Louis C., Beauregard M., Subirade M, Carpenter R., Hotchandani S., Tajmir-Riahi H.A. Reservatrol binding to human serum albumin // J. Biomol. Struc. Dyn. 2006. V. 24. P. 277-283.

160. Dockal M., Carter D.C., Riiker F. The three recombinant domains of human serum albumin. Structure, characterization and ligand binding properties // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 29303-29310.

161. Али Хан M.B., Рашид 3., Али Хан В., Али Р. Биохимический, биофизический и термодинамический анализ сывороточного альбумина человека, гликозилированного in vivo // Биохимия. 2007. Т. 72. С. 175-183.

162. Coussons P.J., Jacoby J., McKay A., Kelly S.M., Price N.C., Hunt J.V. Glucose modification of human serum albumin: a structural study // Free Radical Biol. Med. 1997. V. 22. P. 1217-1227.

163. Nevinsky G.A., Kanyshkova T.G., Semenov D.V., Vlassov A.V., Gal'vita A.V., Buneva V.N. Secretory immunoglobulin A from healthy human mothers' milk catalyzes nucleic acid hydrolysis // Appl. Biochem. Biotechnol. 2000. V. 83. P. 115-129.

164. Buneva V.N., Kanyshkova Т.О., Vlassov А. V., Semenov D. V., Khlimankov D., Breusova L.R., Nevinsky G.A. Catalytic DNA- and RNA-hydrolyzing antibodies from milk of healthy human mothers //Appl. Biochem. Biotechnol. 1998. V. 75. P. 63-76.

165. Krasnorutski M.A., Buneva V.N., Nevinsky G.A. Immunization of rabbits with DNase I produces polyclonal antibodies with DNase and RNase activities // J. Mol. Recognit. 2008. V.21.P. 233-242.

166. Бабина C.E., Канышкова C.E., Бунева B.H., Невинский Г.А. Лактоферрип — дезоксирибонуклеаза человеческого молока// Биохимия. 2004. Т. 69. С. 1239-1250.

167. Takahashi Н., Sawa Н., Hasegawa Я, Sata Т., Hall W. W., Nagashima К., Kurala Т. Reconstitution of cleavage of human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) RNAs // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. V. 293. P. 1084-1091.

168. Jarvinen P., Oivanen M., Lonnberg H. Interconversion and phosphoester hydrolysis of 2',5'- and 3',5'-dinucleoside monophosphates: kinetics and mechanisms // J. Org. Chem. 1991. V. 56. P.5396-5401.

169. Oivanen M., Schnell R., Pfleiderer W., Lonnberg H. Interconversion and hydrolysis of monomethyl and monoisopropyl esters of adenosine 2'- and З'-monophosphates: kinetics and mechanisms // J. Org. Chem. 1991. V. 56. P. 3623-3628.

170. Kierzek R. Nonenzymatic hydrolysis of oligoribonucleotides // Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 5079-5084.

171. Riepe A., Beier H., Gross H.J. Enhancement of RNA self-cleavage by micellar catalysis // FEBS Lett. 1999. V. 457. P. 193-199.

172. Bar bier В., Brack A. Conformation-controlled hydrolysis of polyribonucleotides by equential basic polypeptides//J. Am. Chem. Soc. 1992. V. 114. P. 3511-3515.

173. Raines R.T. Ribonuclease A // Chem. Rev. 1998. V. 98. P. 1045-1065.

174. Loverix S., Winqvist A., Stromberg R., Steyaert J. Mechanism of RNase Tl: concerted triester-like phosphoryl transfer via a catalytic three-centered hydrogen bond // Chem. Biol. 2000. V. 7. P. 651-658.

175. Lebedev A.V., Rezvukhin A.I. Tendencies of 3IP chemical shifts changes in NMR spectra of nucleotide derivatives //Nucleic Acids Res. 1984. V. 12. P. 5547-5566.

176. Sorrentino S., Libonati M. Human pancrcatic-type and non-pancreatic-type ribonucleases: a direct side-by-side comparison of their catalytic properties // Arch. Biochem. Biophys. 1994. V. 312. P. 340-348.

177. Kierzek R. Hydrolysis of oligoribonucleotides: influence of sequence and length // Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 5073-5077.

178. Isel C., Ehresmann C., Keith G., Ehresmann В., Marquet R Initiation of reverse transcription of H1V-1: secondary structure of the HIV-1 RNA/tRNA3Lys (template/primer) // J. Mol. Biol. 1995. V. 247. P. 236-250.

179. Варфоломеев С.Д., Гуревич КГ. Биокинетика: практический курс. М.: ФАИР-ПРЕСС. 1999. С. 60-67.

180. Herries D.G., Mathias А.Р. Rabin B.R. The activc site and mechanism of action of bovine pancreatic ribonuclease // Biochem. J. 1962. V. 85. P. 127—134.

181. Автор глубоко благодарен научному руководителю д.х.н. Т.С. Годовиковой за постоянную помощь и поддержку на всех этапах работы.