Взаимодействие тмРНК с рибосомой в процессе транс-трансляции тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

003444894

На правах рукописи

БУГАЕВА ЕЛИЗАВЕТА ЮРЬЕВНА

Взаимодействие тмРНК с рибосомой в процессе транс-трансляции

02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени

кандидата химических наук

2 4 ыОЛ 2008

Москва - 2008

003444894

Работа выполнена на Кафедре химии природных соединений Химического факультета Московского Государственного Университета имени М В Ломоносова и в Стокгольмском университете (Швеция)

Научные руководители доктор химических наук, профессор,

член-корреспондент РАН Донцова Ольга Анатольевна кандидат химических наук, старший научный сотрудник Шпанченко Ольга Валерьевна;

Официальные оппоненты

доктор химических наук, ведущий научный сотрудник Туннцкая Вера Леонидовна; кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Гонгадзе Георгий Михайлович.

Ведущая организация Институт Биоорганической Химии

им ММ Шемякина и Ю А Овчинникова РАН, г Москва

Защита состоится 30 сентября 2008 г в 17 00 на заседании совета Д 501 001.41 по химическим наукам при Московском Государственном Университете имени M В Ломоносова по адресу 199992, Москва, Ленинские горы, д 1,стр 40, МГУ, Лабораторный корпус "А", аудитория 501

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М В Ломоносова

Автореферат разослан 20 июня 2008 г

Ученый секретарь Совета, кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Транспортно-матричная РНК впервые обнаружена в клетках Е coli более 30 лет назад, но ее функция была установлена только в 1996 году тмРНК содержит элементы как мРНК, так и тРНК Матричная часть тмРНК кодирует пептид, являющейся сигналом узнавания специфическими протеазами (tag-пептид) тРНК-подобная часть тмРНК может бьггь аминоацилирована В аминоацилированном состоянии тмРНК взаимодействует с рибосомой, в которой синтез белка блокирован деградированной мРНК, не содержащей сигнала терминации тмРНК входит в такие заблокированные рибосомы, полипептидная цепь переносится на молекулу тмРНК, после чего трансляция продолжается по матричной части тмРНК, завершающейся стоп-кодоном, на котором рибосома может терминировать с помощью обычных клеточных механизмов Синтезированный при участии тмРНК неполноценный белок несет tag-пептид, что приводит к его быстрому гидролизу специфическими протеазами Таким образом, с помощью тмРНК клетка избавляется от потенциально опасных незавершенных пептидов и поврежденных мРНК и освобождает рибосомы для дальнейшего синтеза После открытия биологической роли тмРНК, структура и функции этой молекулы изучаются очень активно, однако детальных данных

0 механизме транс-трансляции пока нет Наши исследования были направлены на изучение взаимодействия тмРНК с рибосомой, а именно как такая большая и высокоструктурированная молекула проходит через рибосому в процессе синтеза tag-пептида

Данная работа посвящена исследованию механизма процесса транс-трансляции, и созданию модели его протекания

Цель работы

1 Определить состав и соотношение компонентов комплексов рибосомы с тмРНК, заблокированных на различных этапах транс-трансляции

2 Определить структуру комплекса тмРНК с рибосомой на стадии элонгации транстрансляции с помощью криоэлектронной томографии

3 Проследить за изменениями в структуре тмРНК и ее контактов с другими компонентами тмРНК-рибосомных комплексов, остановленных на различных этапах транс-трансляции

4 Предложить механизм прохождения тмРНК через рибосому в процессе транстрансляции

Научная новизна и практическая значимость работы

В ходе данной работы впервые удалось выделить комплексы тмРНК с рибосомой, отражающие различные этапы прохождения тмРНК через рибосому Для выделения комплекса был использован аффинный домен, расположенный на месте псевдоузла 3 в тмРНК Успешное выделение комплекса возможно только в том случае, если этот домен расположен на поверхности рибосомы Показано, что белок 8трВ, который, как предполагалось ранее, необходим на стадии инициации транс-трансляциии, входит в состав элонгационного и терминационного комплексов, что говорит о его важности для протекания процесса транс-трансляциии

Показано, что при облучении УФ-светом тмРНК формирует ряд сшивок как с рРНК, так и с белками, причем в основном эти сшивки образуются белками ЗОБ субчастицы рибосомы

Методом криоэлектронной томографии было продемонстрировано, что состоящая из псевдоузлов петля тмРНК может занимать различные положения на рибосоме, в пределах от «плеча» до вершины «головы» ЗОЭ субчастицы рибосомы, что указывает на ее конформационную подвижность в растворе Положения концов дашюй петли тмРНК на рибосоме соответствуют входу и выходу из канала мРНК, из чего следует вывод, что мРНК-подобная часть тмРНК располагается в канале мРНК

С помощью метода химического пробинга исследованы спектры модификаций нуклеотидов тмРНК в различных комплексах с рибосомой Показано, что структура и контакты тмРНК (за исключением мРНК-подобного домена (МЬЭ) и спирали 5) практически не изменяются в ходе транс-трансляции Спираль 5 стабилизируется или защищается при взаимодействии тмРНК с рибосомой Нуклеотиды, предшествующие открытой рамке считывания (А79-84, А8б) защищаются рибосомой и сохраняют контакт до стадии терминации на природном стоп-кодоне Изменения последовательности в М1Л) тмРНК влияют на реакционную способность нуклеотидов в спирали 2, что предполагает возможность существования третичного контакта между этими областями

На основании полученных данных мы предложили схему прохождения тмРНК через рибосому в ходе транс-трансляции, которая послужила базой для создания компьютерной модели В ходе моделирования минимизация энергии с дистанционными ограничениями привела к организации псевдоузлов 2, 3( 4 и шпильки 5 тмРНК вокруг головы ЗОЭ субчастицы рибосомы выше "выступа" Спираль 2 и псевдоузел 1 расположились во внутреннем пространстве рибосомы Сравнение полученных моделей со структурой, полученной с помощью метода криоэлектронной томографии, позволило

заключить, что петля вокруг головы 30S субчастицы рибосомы сформирована псевдоузлами 2, 3 и 4

Апробация работы Материалы диссертации докладывались на следующих конференциях встреча международных исследовательских школ, Мерида, Мексика, 22-25 июня, 2005 г, международная конференция «тРНК-2005», Бангалор, Индия, 2-7 декабря 2005 г, международная конференция "Функции РНК в генной регуляции" Роскофф, Франция, 3-7 мая, 2006 г, 8-я международная конференция по молекулярной биологии ИМБ им В А Энгельгардта «РНК-белковые взаимодействия», Московская обл, Россия, 19-24 августа 2006 г, XV международная научная конференция для студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2008», Московский Государственный Университет, Москва, Россия, 8-12 апреля, 2008 г

Структура и объем работы Диссертационная работа изложена на 123 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, материалы и методы, выводы и приложение Материал иллюстрирован 45 рисунками и 2 таблицами Библиографический указатель включает 166 цитированных работ

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1 Выделение комплексов транспортно-матричной РНК с рибосомой

Выделение тмРНК-рибосомных комплексов для последующего исследования с использованием различных биохимических и структурных подходов проводили с помощью аффинной хроматографии

В качестве аффинного эпитопа мы выбрали РНК-аптамер, специфичный к стрептавидину, он был введен вместо псевдоузла 3 в молекулу тмРНК Мы предположили, что этот псевдоузел находится на поверхности комплекса и должен быть доступным для взаимодействия на всех этапах шранс-трансляции Мутантная тмРНК, несущая алтамер к стрептавидину, сохраняла функциональную активность в тесте т vivo

Мы использовали штамм Escherichia coli SKZ1, в котором ген ssiA, кодирующий гмРНК, был заменен геном, кодирующим хлорамфеникол-ацстилтрансферазу Кроме того,

данный штамм содержит ген термочувствительного фактора терминации RF2 Для использования термочувствительного RF2 для остановки транс-трансляции стоп-кодон UAA был заменен на UGA, который узнается только фактором RF2 Так же были заменены нуклеотиды, окружающие стоп-кодон на наименее благоприятный для терминации контекст GAC CCA UGA А Перемещение стоп-сигнала GAC CCA UGA А по матричной области тмРНК позволяет остановить процесс m/гаяс-трансляции на более ранних этапах, а именно, на 2,4 и 5 кодонах мРНК-подобной части тмРНК В итоге были созданы 4 плазмиды, кодирующие тмРНК со стрептавидиновым аптамером и измененным стоп-кодоном, которые получили название pGEMstra 2, pGEMstra 4, pGEMstra 5 и pGEMstra 11, соответственно

Для подтверждения того, что внесенные в штамм SKZ1 изменения не нарушили возможность протекания процесса транс-трансляции, а именно, тагирования белков тмРНК, мы использовали тмРНК с мРНК-подобной частью, кодирующей lag-пептид, содержащий 6 остатков гистидина (His6) вместо последних 6 аминокислот, закодированную на плазмиде pGEMtm-stra-6His Клетки Е coli штаммов Х91 с инактивировапным геном ssrA и SKZ1 с инактивированным геном ssrA и термочувствительньш RF2 были трансформированы плазмидой pGEMtm-stra-6His Анализ суммарного клеточного белка показал, что тагирование белков происходит одинаково в обоих штаммах, подтверждая, что тмРНК нормально функционирует в штамме SKZ1

Для выделения комплексов клетки штамма SKZ1 трансформировали плазмидами, несущими мутантные тмРНК, и выращивали до оптической плотности 0,3 при температуре 37"С в присутствии необходимых антибиотиков Затем повышали температуру до 42°С В этих условиях эффективность терминации резко снижалась из-за термочувствительности RF2 и неблагоприятного контекста вокруг стоп-кодона в тмРНК, что позволяло блокировать комплекс

Клетки осаждали центрифугированием, получали S30 экстракт и с помощью ультрацентрифугирования через сахарозную подушку осаждали фракцию рибосом Фракцию рибосом, содержащих тмРНК, выделяли с помощью аффинной хроматографии на стрептавидип-сефарозе Элюцию рибосом, содержащих тмРНК, проводили с помощью биотина

Анализ РНК, входящих в состав выделенных комплексов

Анализ РНК, входящих в состав выделенных тмРНК-рибосомных комплексов, проводили с помощью гель-электрофореза в денатурирующих условиях. Выделенные комплексы, наряду с полосами, соответствующими рибосомным 16S, 23S и 5S РНК, содержали дополнительную полосу, по подвижности схожую с тмРНК. Нозерн-блот анализ с использованием DIG-содержащей пробы, комплементарной тмРНК, показал, что эта полоса действительно соответствует тмРНК. Таким образом, при связывании со стрептавидин-сефарозой действительно происходит выделение комплекса тмРНК с рибосомой. Полученный результат свидетельствует о том, что стрептавидиновый аптамер (а также, вероятно, и псевдоузел 3) экспонирован на поверхности тмРНК-рибосомного

комплекса и сохраняется неизменной свою структуру.

Для оценки стехиометрии выделенных тмРНК-рибосомных комплексов проводили количественный анализ РНК, входящих в состав комплексов, с помощью гель-электрофореза в денатурирующих условиях. ПААГ окрашивали бромистым этидием и фотографировали, используя программу "Gel" (Рис. 1). Интенсивность полос, соответствующих 5S рРНК и тмРНК, в каждой дорожке была оценена с помощью программы IraageQuant 5.0.link. Известно, что интенсивность окраски бромистым этидием пропорциональна длине РНК, что позволяет соотнести сигнал на геле с количеством РНК. Подсчитанное соотношение тмРНК к 5S рибосомной РНК составило 3:1. Поскольку тмРНК в 3 раза длиннее, чем 5S рРНК (363 и 120 нуклеотидов, соответственно), можно утверждать, что содержание тмРНК в выделенных комплексах составляло около 100%.

Исходя из конструкции плазмид, используемых в эксперименте, при остановке транс-трансляции на стадии терминации в Р участке рибосомы должна находиться тРНКРго. Для определения природы тРНК, содержащейся в выделенных комплексах, был

комплексы

"1

у у <р # # ^ #

- imRNA

- 5S RNA

Рис. 1. Анализ РНК комплексов, выделенных с использованием тмРНК со стоп-кодоном во 2, 4, 5 и II положениях (дорожки подписаны

соответственно), в 8% ПААГ, содержащем 7М мочевину. Положение 5Э рРНК и тмРНК показано стрелками.

проведен Нозерн-блот анализ с использованием DIG-меченпых олигодезоксирибонуклеотидов, комплементарных последовательности тРНКРго Было показано, что тмРНК-рибосомные комплексы, остановленные на 2-ом, 4-ом, 5-ом и 11-ом положениях ORF действительно содержат тРНКРга

Таким образом, разработанная система выделения тмРНК-рибосомных комплексов позволяет останавливать /мраяс-трансляцшо на определенных этапах прочтения ORF тмРНК и получать комплексы, содержащие рибосомы и тмРНК в соотношении 1 1 Принципиальная возможность такого выделения является доказательством того, что псевдоузел 3 тмРНК находится на поверхности рибосомы на всех этапах транстрансляции

Анализ белкового состава выделенных комплексов

Анализ белкового состава выделенных комплексов проводили с помощью гель-электорфореза по Лэммли Анализ полос, соответствующих белкам, выделенным из тмРНК-рибосомных комплексов, свидетельствует о присутствии рибосомных белков во всех выделенных комплексах Кроме того, в белковом профиле четырех изучаемых нами комплексов появляется дополнительная полоса Электрофоретическая подвижность данного белка позволила нам предположить, что это SmpB (small protein В) С помощью MALDI масс-спектрометрического анализа, проведенного в сотрудничестве с доктором Маркусом Калкумом из Бекмановского исследовательского института (США), было доказано, что этот белок действительно является SmpB

Количество SmpB было оценено с помощью Вестерн-блот анализа для комплексов, содержащих тмРНК со стоп-кодонами во 2, 4, 5 или 11 положениях (Рис 2, дорожки подписаны соответственно) Визуализацию белков проводили с помощью антител против белка SmpB и рибосомного белка S3 Белок SmpB (дорожки 1-5) и суммарный рибосомный белок S30 субчастицы (дорожки 6-10), нанесенные на гель в количествах от 0,025 до 0,4 пмоль, были использованы для построения калибровочного графика зависимости интенсивности сигнала на рентгеновской пленке от количества белка в пробе Использование этого графика позволило нам оценить количество белка SmpB и рибосомного белка S3 в комплексах, содержащих тмРНК со стоп-кодонами в положениях 2, 4, 5 или 11, и установить, что одна рибосома связывает одну молекулу SmpB во всех изученных комплексах

комплексы

<у ъ- <о ^ ^ ^ ^

SmpB

S3

1 2 3 4 5

6 7 8 9 10

Рис. 2. Анализ соотношения количества белка SmpB и рибосомного белка S3 в комплексах рибосом с тмРНК-со стоп-кодоном во 2, 4, 5 или 11 положениях. Белки SmpB и S3 в составе различных комплексов (дорожки подписаны соответственно). 0.4, 0.2, 0.1, 0.05 и 0.025 пмоль очищенного белка SmpB (дорожки 1 -5) и 0.025,0.05, 0.1, 0.2 и 0.4 пмоль суммарного белка 30S (дорожки 6 - 10).

Таким образом, в нашей работе мы показали, что SmpB остается связанным с тмРНК-рибосомным комплексом до конца процесса транс-трансляции. Стехиометрия комплекса SmpB-тмРНК-рибосома равна 1:1:1 на всех стадиях транс-тртсляти от этапа, когда тРНК-подобный домен (TLD) тмРНК находится в Е сайте рибосомы, до терминашш транс-тртсляшт на природном стоп-кодоне.

Исследование комплексов тмРНК с рибосомой методом ковалентного

Для того, чтобы выявить контакты тмРНК с рибосомой, необходимо использование биохимических подходов. Одним из подходов, который позволяет зафиксировать контакты между тмРНК и рибосомой, является химическое сшивание (метод, основанный на формировании сшивок при облучении образца УФ-светом). Для выбора оптимального времени экспозиции УФ-светом комплекса тмРНК с рибосомой был проведен пробный эксперимент. Раствор уридина подвергали облучению УФ-светом (254 нм) при разном времени экспозиции, и по спектрам поглощения оценивали степень фотолиза. Было установлено, что двукратное уменьшение поглощения по сравнению с необлученным образцом наблюдается при времени экспозиции равном 2 минутам.

Раствор комплекса, помещенный на лед, облучали УФ-светом (254 нм) в течение 2 минут. Половину облученного образца обрабатывали протеиназой К (10 мг/мл) для

сшивания

доказательства белковой природы сшивки, поскольку известно, что в этих условиях возможно образование РНК-РНК сшивок. Необлученный образец, облученный, и облученный и обработанный протеиназой К, осаждали, и продукты сшивания анализировали с помощью Нозерн-блотинга в присутствии DIG-олигодезоксирибонуклеотида, комплементарного тмРНК (Рис. 3), и Вестерн-блотинга с использованием антител на рибосомные белки.

Видно, что при облучении тмРНК-рибосомного комплекса появляется ряд дополнительных полос (сравнить дорожки 2 и 3, Рис. 3) с меньшей электрофоретической подвижностью, которые соответствуют сшивкам, часть из которых исчезает после обработки протеиназой К (сравнить дорожки 3 и 4, Рис. 3). Таким образом, нам удалось обнаружить 5 сшивок тмРНК с белками. Был проведен Вестерн-блот анализ с использованием антител на рибосомные белки 30S и 50S субчастиц, и оказалось, что только белки малой субчастицы рибосомы формируют сшивки с тмРНК. В данном эксперименте нам удалось выявить 5 сшивок с помощью Нозерн-блот анализа, тогда как Вестерн-блот показал только 4, что дает нам возможность предположить, что одну из сшивок тмРНК формирует с белком SmpB,

Полученные результаты хорошо согласуются с предложенной в нашей лаборатории гипотезой о прохождения тмРНК через рибосому в ходе транс-траясляцяш и известной структурой пре-инициаторного тмРНК-рибосомного комплекса, в которых видно, что основные контакты тмРНК происходят именно с 30S субчастицей рибосом.

Исследование комплексов тмРРЖ с рибосомой методом химического

пробинга

Одним из методов исследования рибонуклеопротеидных комплексов, позволяющим исследовать контакты компонентов комплекса между собой, а также

Рис. 3. Нозерн-блот анализ тмРНК со стоп-кодоном в четвертом положении, образовавшей сшивку с компонентами рибосомы. Дорожки 1, 5 -тмРНК; выделенная из ЗОЭ экстракта. Дорожка 2 - нсоблу-ченный комплекс; дорожка 3 - облученный образец, дорожка 4 - облученный образец, после обработки протеиназой К. Стрелки показывают положение РНК-белковых сшивок.

изменения в структуре РНК, вызванные комплексообразованием, является метод химического пробинга Выделенные нами из клеток тмРНК-рибосомные комплексы, в которых транс-трансляция была заблокирована на разных этапах прочтения ORF, позволяют изучить взаимодействие тмРНК с рибосомой от стадии, когда тРНК-подобная часть тмРНК все еще связана с Е сайтом рибосомы до терминации на стоп-кодонс, закодированном в ORF тмРНК

Каждый из четырех выделенных комплексов рибосомы с тмРНК-2, тмРНК-4, тмРНК-5 или тмРНК-11, соответствующих различным этапам трансляции мРНК-подобной части тмРНК, был обработан DMS, СМСТ или кетоксалем Как контроль мы использовали соответствующие свободные тмРНК, выделенные из клеток с помощью аффинной хроматографии

мРНК-подобиая часть тмРНК, предшествующий регион и спираль 5. Наибольшее число эффектов было найдено в районе MLD тмРНК и прилегающих к нему участков - области перед «resume-кодоном» и спирали 5 (Рис 4,5 и 6) Именно здесь наблюдались сильные изменения доступности нуклеотидов тмРНК для модифицирующих реагентов в различных рибосомных комплексах по сравнению со свободной тмРНК в растворе Сравнение между собой спектров модификации для разных комплексов выявило также существенные изменения реакционной способности нуклеотидов тмРНК при переходе от комплекса, остановленного на 2-ом кодоне ORF, к комплексу, заблокированному на природном стоп-кодоне (Рис 4)

Цепь РНК в комплексе с тмРНК-2, остановленном на втором кодоне ORF тмРНК, наиболее защищена от модификации по сравнению с другими комплексами (Рис 4 и 5, Л) Из 51 нуклеотида в области, начинающейся с -1 кодона ORF до конца спирали 5 тмРНК, 27 нуклеотидов стали менее доступны действию модифицирующих агентов при формировании комплекса с тмРНК-2 Нуклеотиды U88, ДОЗ, U105, U110-112, U119-120, U123, U131-132 и А92, А95-97, А102-103, А106, AI 13, AI 16, А121-122, А124-125, С126, А133, А135 тмРНК-2, доступные для модификации СМСТ и DMS, соответственно, в растворе (Рис 5, А, линии tm в панечях СМСТ и DMS), защищаются от модификации в большей (например, U93) или меньшей (например, А124) степени, когда молекула тмРНК становится компонентом комплекса с рибосомой (Рис 5, А, линии С в панелях СМСТ и DMS)

Pro стоп

tmRNA-2 A GUC CCA UjU AAC Q A A AAC UAC GCU UUA GC A GCU UAA UAA CCU GCU UAG AGO Pro стол

tmRNA-4 A GUC flCAgACCCA L'SaAAC UAC GCU UUA GCA GCU UAA UAA CCU GCU UAG AGC Pro стоп

tmRNA-5 A GUC |]CA AAC ßAC CCA UjjA AAC GCU UUA GCA GCU UAA UAA CCU GCU UAG AGC

Pro стоп

tmRNA-11 A GUC EC A AAC GAC GAA AAC UAC GCU UUAjjAC CCA US А Аллеей GCU UAG AGC

Рис 4 Спектр модификаций нуклеотидов тмРНК в различных рибосомных комплексах по сравнению со свободной тмРНК в растворе Внизу рисунка выделена область мРНК-подобной части тмРНК с прилегающими районами (от 86 до 137 нуклеотида последовательности тмРНК), слева - нуклеотиды 3240 0325 Зеленый цвет обозначает уменьшение доступности действию модифицирующего агента нуклеотидов тмРНК в комплексе с рибосомой по сравнению с тмРНК в растворе, красный - увеличение, синий - без изменения, серый или черный - неспецифическое разрезание цепи РНК

В тоже время два нуклеотида, а именно, (394 и 099, показывают увеличение доступности для модифицирующего агента кетоксаля, когда тмРНК-2 находится в составе тмРНК-рибосомного комплекса (сравните линии С и 1ш в панели Ке^ Рис 5, А)

Перемещение стоп-кодона, окруженного специальной последовательностью, неблагоприятной для терминации, в положение 4-ого кодона О ИР ™РНК уменьшает количество нуклеотидов, защищенных в результате образования соответствующего тмРНК-рибосомного комплекса, до 20 (Рис 4 и 5, Б) Защищенные нуклеотиды в 3'-области описываемого района (1Л05, Ш10-112, и 120, Ш23, Ш31-132 и 92, АИЗ, А116, А121-122, А124-125, С126, А133) остаются, в основном, теми же, что и в комплексе с тмРНК-2

Однако, в 5'-области, последовательность которой была изменена, разница в спектре модификаций очевидна Нуклеотид 087 становится менее, а нуклеотиды 090,093 и 0100 - более доступными для модификации кетоксалем (Рис 5, Б, панель Ке1) Нуклеогид в положении 94, доступный для модификации в комплексе с тмРНК-2, становится защищенным в комплексе с тмРНК-4 (А94 на Рис 5, Б, панель ОМУ) Второй доступный для модификации в тмРНК-2 нуклеотид 099 в тмРНК-4 был изменен на Ш9, и его доступность для модифицирующего агента в комплексе и в растворе стала одинаковой (Рис 5, Б, панель СМСТ) Нуклеотид А98 приобретает защиту от модификации ПМБ в комплексе с тмРНК-4 (Рис 5, Б, панель ЭМЭ)

Смещение терминирующей последовательности по мРНК-подобнои части тмРНК (тмРНК-5) уменьшает количество нуклеотидов, защищаемых от модификации при образовании комплекса с рибосомой, до 15 (Рис 4 и 5, В)

Защиты нуклеотидов в положениях Ш05, А121-122, А124-125, и С126 исчезают В то же время защита 087 и усиление доступности для модификации нуклеотида й90 остаются теми же, что и в комплексе с тмРНК-4, 093 снова приобретает защиту, как в комплексе с тмРНК-2 (Рис 5, В, панель Кс1) Нуклеотиды в положениях 96 и 103 (оба в для тмРНК-5) становятся доступными для модификации кетоксалем в комплексе тмРНК с рибосомой (Рис 5, В, панель КеО Нуклеотиды в положениях 94, 97 и 102 (в тмРНК-5 А, А и и, соответственно) более защищены в тмРНК-рибосомном комплексе, чем в тмРНК-5 в растворе (Рис 5, В, панели БМЭ и СМСТ, соответственно)

Рис. 5. Модификации нуклеотидов в области 86С-137С для комплексов рибосомы с тмРНК-2 (А), -4 (Б), -5 (В) и -11 (Г). Ш - дорожки, соответствующие свободной тмРНК в растворе, С - дорожки, соответствующие комплексу. Панели ОМЭ, Ке1:, СМСТ относятся к образцам, обработанным соответствующими реагентами. ЫМ - ^модифицированный образец. Рамками выделена последовательность сигнала терминации. Стрелками обозначены эффекты, описанные в тексте.

Только 5 нуклеотидов защищены от модификации химическими реагентами в комплексе рибосомы с тмРНК-11 (Рис 4 и 5, Г), среди них нуклеотиды А86, А97, U120 и U131-132, упомянутые выше для предыдущих комплексов Изменения касаются G114, G121 и С126, которые становятся более доступными для модификации химическими реагентами, а также U128, который защищается в комплексе рибосомы с тмРНК-11 (Рис 5, Г)

Следует упомянуть, что некоторые из нуклеотидов в различных тмРНК были исключены из рассмотрения из-за неспецифического разрезания цепи РНК Мы не можем оцепить влияние образования комплексов с рибосомой на доступность модификации нуклеотидов С91, С98, А100-101 в тмРНК-2, С95-97, А101-102, С104 в тмРНК-4, С91, А92, С99-100 в тмРНК-5, и С91, С109, U105, U112, Cl 19, G129 в тмРНК-11

Нуклеотиды А79-А84 и А86 в последовательности тмРНК, располагающейся между псевдоузлом 1 и «resume-кодоном», доступны для модификации DMS во всех изучаемых нами вариантах тмРНК в растворе, что проиллюстрировано на рис 6 Однако доступность данных нуклеотидов во всех тмРНК-рибосомных комплексах уменьшается

(Рис 4 и б, линии, обозначенные DMS тмРНК С), указывая на защиту данной

области от модификации Этот эффект можно объяснить взаимодействием тмРНК с рибосомой, причем при прохождении MLD тмРНК через рибосому в ходе транстрансляции эти контакты не изменяются Таким образом, можно предположить, что, связавшись со своим сайтом взаимодействия на рибосоме на начальном этапе транстрансляции, данный район тмРНК продложает с ним

Рис б Модификации нуклеотидов 68U-90C DMS для комплексов рибосомы с тмРНК-2, -4, -5, -11 С - дорожки, взаимодействовать до стадии соответствующие комплексу, tm - тмРНК в растворе Т, G, С, А -дорожки, соответствующие последовательности тмРНК терминиции Стрелками обозначены эффекты, обсуждаемые в тексте

2 4 5 11 С tm С tm С tm С tm Т G С А

А 79 _^ ЧР- 4ЩГ Iф 9- ' 4*

А 80 _^ " w W

А 81 _ Ж*"*-1*" ^ •»В* Щ0 X

А 82 _f.

А 83 _> *ч >

А и i^-mtt * - *Ж '*(► * ^ wft

А 86 —► •V хт m r ^

G

и

С 90

Согласно полученным результатам, спираль 5 тмРНК неустойчива в растворе, и ее конформация, по-видимому, стабилизируется в комплексах тмРНК с рибосомой, хотя подобный эффект может возникать и в результате прямой защиты тмРНК рибосомой. Стоит отметить, что существование данной спирали тмРНК подтверждено не для всех организмов.

Как видно из Рис. 4, цепь РНК в районе МЫ) тмРНК подвержена неспсцифическим разрывам, причем в молекуле тмРНК-11 в наименьшей степени, вероятно потому, что природное расположение стоп-кодона обеспечивает оптимальное взаимодействие данной тмРНК с рибосомой, влияя таким образом на ее стабильность.

Характерные изменения в доступности действию модифицирующих реагентов нуклеотидов стоп-кодона (в иОА нуклеотид О экспонируется во всех комплексах, тогда как нуклеотид и защищается в комплексах рибосомы с тмРНК 2, 5, 11) можно объяснить взаимодействием его с компонентами рибосомы.

В триплете БАС (кодон в положении -2 по отношению к стоп-кодону) последовательности тмРНК экспонируется нуклеотид й в комплексах рибосомы с тмРНК 4, 5, 11 и защищается нуклеотид А в комплексах рибосомы с тмРНК 2, 4, 5. Известно, что аминокислота, кодируемая этим кодоном, наряду с соседней с 3-стороны, определяет

эффективность трстс-

трансляции, вероятно за счет определения

продолжительности остановки

трансляции на стоп-кодоне до

узнавания его фактором

терминации. Возможно, этот

процесс требует особой растворе. Панели БМЯ и СМСТ относятся к образцам,

обработанным соответствующими реагентами. Т, б, С, А -конформации данного дорожки, соответствующие последовательности тмРНК. Стрелками

обозначены эффекты, обсуждаемые в тексте.

триплета или/и его

А

СМСТ тмРНК

1 2 4 5 П1 С йт С 1Л1 С (т С й Т О С А

; ** ты с

. . ч* А

"" " :■■ " - ' * ...у ' с „

Ш(

ОМ Б тмРНК

2 4 5 11 С № С (т С йл С Т в С А

.. ' ' С 332

А 334 -> ж" -'Г зМь -да

С 335—► ж , » 1

Рис. 7. Модификации нуклеотидов в области тРНК-подобной части тмРНК для комплексов рибосомы с тмРНК-2, -4, -5, -11. С - дорожки, соответствующие комплексу, йп - тмРНК в

непосредственного взаимодействия с компонентами трансляции

тРНК-подобная часть тмРНК. Для изучения 5'- и З'-концевых участков тмРНК были использованы праймеры, комплементарные нуклеотидам 56-73 и 346-363 последовательности тмРНК Доступность нуклеотидов в положениях U16, U17 (Рис 4 и Рис 7, А) и А334 (Рис 7, Б) уменьшается во всех четырех комплексах тмРНК с рибосомой по сравнению со свободными тмРНК в растворе Нуклеотид С335 становится более доступным для модификации DMS (Рис 7, Б), когда тмРНК участвует в образовании комплекса с рибосомой

Изменения реакционной способности этих нуклеотидов при обработке модифицирующими агентами в составе комплексов могут быть объяснены взаимодействием тмРНК с белком SmpB

Доступность нуклеотидов РНК для модифицирующих реагентов в положениях А334-С335 и U16-U17 тмРНК Е coll изменяется во всех исследованных рибосомных комплексах, следовательно, белок SmpB остается связанным с тмРНК-рибосомным комплексом на всех стадиях транс-тршсямщп и занимает при этом свой канонический сайт связывания на TLD тмРНК

Спираль 2 и псевдоузел 1 Связывание тмРНК с рибосомой привело к изменениям доступности некоторых нуклеотидов в спирали 2 и псевдоузле 1 тмРНК для модифицирующих агентов (Рис 4 и 8) Нуклеотиды G29 (Рис 8, A), U60 (Рис 8, В), A3Q9, A316 и А323 (Рис 8, Е) стали более доступными для модификации нуклеотидспецифическими реагентами во всех изученных комплексах В тоже время нуклеотиды U46 (Рис 8, Б), U65, U68 (Рис 8, В), 301, А302, А305 (Рис 8, Г), U311 (Рис 8, Д) и A319 (Рис 8, Е) защищаются от модификаций при образовании комплексов тмРНК с рибосомой Интерес вызывают некоторые эффекты в спирали 2, которые зависят от природы тмРНК Нуклеотиды G324 и G325 были доступны для модификации кетоксалем в тмРНК-4 и тмРНК-5 в растворе (Рис 4 и 8, Е), но становятся защищенными от модификации при формировании тмРНК-рибосомных комплексов

Тот факт, что изменение нуклеотидной последовательности в MLD тмРНК приводит к изменению спектра модификаций в спирали 2, прилегающей к TLD тмРНК, позволяет предположить их пространственную сближенность в структуре молекулы тмРНК в растворе При формировании комплексов с рибосомой разница в модификации этих нуклеотидов исчезает - они полностью защищены от действия кетоксаля во всех тмРНК-рибосомных комплексах

Kethoxal

П

ТмРНК

A 290 A 291 A 292

CMCT

tmPHK

1 2 4 5 11 С tm С tm С trn С tm T G С A

¿fcST ^ u2e

.«и u , rfi U

~ *** G

^ ■ v ' : - - -ftjte = ....... ■ _______ ■ **fe A 32

DMS tmPHK

1 2 4 Г ÎP С tm С tm С tm С tm T G С A . - - . , .... —" А2э°

► «»-■- T • " ■ -S»- A

ï - „...'** Ao

..... ?

Г- - «*» . ■ -i ...... U

' 43» ■ G

'Ы » . - i- i

2 4 5 11 С tm С tm С tm С tm T G С A

и 300

■да- a

- и 306

U«-

B

U 60-

U BU »-

Д

U 34 ■

■^■'"».«ii.S^

. „ Зктк «w ям . — -..., - À

■ ; ■ - ■ '

-Si. .. . -Л

» ««t Vf

""" 2SW ;

m

- ■ ■

G 57

G

U

U 60

A 70

A

A

A 73

A 309

DMS

Kethoxal

2 4 5 11 2 4 5 11 '

С tm С tm С tm С tm С tm С tm С tm С tm T G С A

*» -

tmPHK

Аэгз * Озм . G зге .

Ази .

AÎB -

5' й- '.

'S . • -Vf • ■ Щ(£х - '

.•и»; ■

■Л. -.•..-. .... - - .- !? V ' - ii/Я -Р"«

-.'• • у " - srV-'f" ."'•; -

- m-.-:

•

•V ч-Г:/-:-, " v-

Рис. 8. Модификации иуклеотидов в области спирали 2, псевдоузлов 1 и 4 тмРНК для комплексов рибосомы с тмРНК-2, -4, -5, -11. С - дорожки, соответствующие комплексу, 1т - тмРНК в растворе. Панели ЭМБ, Ке&оха! и СМСТ относятся к образцам, обработанным соответствующими реагентами. Т, О, С, А -дорожки, соответствующие последовательности тмРНК. Стрелками обозначены эффекты, обсуждаемые в тексте.

Псевдоузел 2. Нуклеотид G156 становился более доступным для модификации кетоксалем во всех исследуемых нами комплексах тмРНК с рибосомой (Рис. 4 и 9). Следует отметить, что вне TLD и MLD тмРНК увеличение доступности нуклеотидов

действию модифицирующих агентов при образовании тмРНК-рибосомных комплексов (Рис 4) происходит в петлях (G29, Gl 56, А309, A316, А323) или на границе петель (U60, причем комплементарный ему А73 модифицируется и в растворе, и в комплексах, следовательно, эта нуклеотидная пара не является стабильной) Можно предположить, что взаимодействие с рибосомой фиксирует эти нуклеотиды в конформации, предпочтительной для модификации Формирование тмРНК-рибосомных комплексов приводит к защите от модификаций некоторых нуклеотидов в спиралях тмРНК, возможно, за счет стабилизации пары, например, для U46-A306 Не исключено и возникновение новых контактов с компонентами трансляции или внутри самой тмРНК, например, U65, U311 и A319 защищаются в комплексах, в то время как А51,

комплементарный U65, не меняет своего поведения и модифицируется в растворе и в комплексах с равной эффективностью, a G43 и С35, комплементарные, соответственно, U311 и A319, не модифицируется ни в растворе, ни в комплексе Аналогичным образом можно объяснить и появление защит нуклеотидов в одноцепочечных участках РНК, например, U68, А290-292, А301-302

В местах районах тмРНК (например, С37, U42 и С139) в области, соединяющей TLD и MLD, происходили неспецифические разрывы цепи РНК даже в отсутствие модифицирующих агентов, возможно, из-за повышенной лабильности связи

Таким образом, согласно данным, полученным с помощью метода химического пробинга, стр)ктура и контакты тмРНК (за исключением MLD и спирали 5) практически не изменяются в ходе транс-трансляции, что хорошо согласуется с предложенной ранее в нашей лаборатории моделью прохождения тмРНК через рибосому в ходе трансляции ORF тмРНК

Kethoxal

'2 а 5 11 ' tmRNA-4 С Im С Im С tm С » Т G С А

G isit-

Рис 9 Модификации кетоксалем нуклеотидов ) области псевдоузла 2 тмРНК для комплексов зибосомы с тмРНК-2, -4, -5, -И С - дорожки, соответствующие комплексу, йп - тмРНК в растворе Г, й, С, А - дорожки, соответствующие последовательности тмРНК Стрелками обозначены эффекты, обсуждаемые в тексте

Исследование комплекса тмРНК с рибосомой методом криоэлектронной томографии

Выделение комплексов тмРНК с рибосомой, остановленных на определенных стадиях транс-трансляции, позволило нам изучить пространственную организацию элонгационного тмРНК-рибосомного комплекса методом криоэлектронной томографии. На сегодняшний день были опубликованы модели пре-инициаторного и инициаторного тмРНК-рибосомных комплексов, полученные с помощью крио-ЭМ.

В нашей работе, проведенной совместно с доктором Лейфом Исакссоном из Стокгольмского Университета (Швеция), мы исследовали комплекс тмРНК с рибосомой, в котором шранс-трансляция была остановлена на 4 кодоне мРНК-подобной части тмРНК. Для визуализации комплекса мы использовали метод криоэлектронной томографии. Данный метод не дает столь высокого разрешения, как крио-ЭМ, но позволяет получить информацию о каждой замороженной частице.

Рис. 10. Реконструкция структуры трех индивидуальных частиц, использованных при реконструкции комплекса тмРНК с рибосомой, остановленного на четвертом кодоне MLD таРНК, представляющих три различных положения петли тмРНК, состоящей из псевдоузлов, на рибосоме. Плотность, соответствующая 30S рибосомной субчастице, окрашена в светло-серый цвет, 50S - в голубой, а тмРНК - в розовый.

Для реконструкции мы использовали приблизительно 200-300 частиц, причем, в пул рассматриваемых отбирались только те частицы, которые состоят из двух субчастиц. В контрольном эксперименте были получены изображения пустых рибосом, и

«вычитание» из общей электронной плотности комплекса плотности, относящейся к 708 рибосоме, позволило нам определить плотность, соответствующую тмРНК (Рис. 10). Дополнительная плотность, соответствующая тмРНК, выглядит как петля над «плечом» ЗОБ субчастицы рибосомы и, вероятно, сформирована псевдоузлами.

Эта петля может занимать различные положения на рибосоме, в пределах от «плеча» до вершины «головы» ЗОЭ рибосомной субчастицы (Рис. 10), что свидетельствует о ее подвижности в растворе.

Разрешение некоторых частиц (Рис. 10) позволяет увидеть, что положение концов данной петли тмРНК на рибосоме соответствует входу и выходу из канала мРНК. При сравнении моделей структуры комплексов в пре-инициаторном и элонгационом состоянии (Рис. 11) видно, что общий вид петли, состоящей из псевдоузлов, а также положение одного из ее концов рядом со входом в канал мРНК совпадают. Другой конец петли в элонгационном комплексе находится рядом с выходом из канала мРНК, свидетельствуя о том, что мРНК-подобная часть тмРНК располагается в канале.

£f-Ty~8fflpS-WfiNA

LI slal

I

mRNA tunnel entrance

Рис. 11. Сопоставление моделей структуры комплексов тмРНК с рибосомой в пре-инциаторном состоянии (слева) и на стадии трансляции ORF тмРНК (справа). Плотность, соответствующая 30S рибосомной субчастице, окрашена в светло-серый цвет, 50S - в темно-серый, а тмРНК - в черный.

Компьютерное моделирование процесса прохождения тмРНК через рибосому в ходе транс-трансляции

На основании полученных в работе данных мы предложили схему прохождения тмРНК через рибосому в ходе транс-трансляции На базе этой схемы совместно с доктором А В Головиным из НИИ ФХБ им А H Белозерского МГУ им M В Ломоносова (Москва, Россия) были созданы компьютерные модели структуры различных тмРНК-рибосомных комплексов При создании стартовой модели для оптимизации положения псевдоузлов 2, 3, 4 и шпильки 5 тмРНК нами была построена кольцевая модель тмРНК и проведена минимизация энергии с дистанционными ограничениями на TLD и MLD, взятыми из структуры рибосомы с тРНК и мРНК Полученная структура была помещена в 70S рибосому, используя информацию о положении тРНК и мРНК Минимизация энергии с дистанционными ограничениями на псевдоузлы 2, 3, 4 и шпильку 5 тмРНК привела к организации этих элементов вокруг головы 30S субчастицы рибосомы выше "выступа" Подобный подход не сработал по отношению к спирали 2 и псевдоузлу 1, так как кольцевая структура выходила за пределы доступного пространства внутри рибосомы Соответствующий сегмент тмРНК был случайным образом расположен в заданном пространстве внутри рибосомы

Наложение дистанционных ограничений привело к самоорганизации этого сегмента во внутреннем пространстве рибосомы При оптимизации явным способом учитывалось присутствие тРНК Таким образом в случае положения TLD в Р участке рибосомы случайным образом заполнялась ниша в Е сайте рибосомы При положении TLD в А участке рибосомы случайным образом заполнялось пространство, соответствующее району вхождения тРНК в рибосому

Полученные модели представлены на рисунке 12 и 13 При сравнении этих моделей со структурой, полученной с помощью метода криоэлектронной томографии, видно хорошее совпадение положения петли, сформированной псевдоузлами, вокруг головы 30S субчастицы рибосомы Это позволяет заключить, что дополнительная электронная плотность, выявленная при реконструкции структуры комплекса рибосомы с тмРНК-4, образована псевдоузлами 2, 3 и 4

Рис. 13. Компьютерная модель комплекса рибосомы с тмРНК, при положении TLD тмРНК в А участке рибосомы. тмРНК показана черным цветом, 30S и 50S субчастицы рибосомы - серым. А - вид со стороны 50S субчастицы. Б - вид со стороны А участка рибосомы.

Таким образом, в ходе данной работы впервые удалось выделить комплексы тмРНК с рибосомой, отражающие различные этапы прохождения тмРНК через рибосому, исследовать их с помощью широкого спектра биохимических и структурных подходов и предложить модель их пространственной организации.

Рис. 12. Компьютерная модель структуры комплекса рибосомы с тмРНК, при положении TLD тмРНК в Р участке рибосомы. тмРНК показана черным цветом, 30S и 50S субчастицы рибосомы серым. А вид со стороны 50S субчастицы. Б - вид со стороны А участка рибосомы.

Полученные результаты позволяют сделать выводы о структуре и стехиометрии изученных комплексов, охарактеризовать детали взаимодействия цепи тмРНК с рибосомой и проследить за их изменениями в ходе трансляции ORF тмРНК

ВЫВОДЫ

1 Во всех выделенных тмРНК с рибосомой, в которых терякс-трансляция остановлена на различных этапах, присутствует белок SmpB Стехиометрия комплексов рибосома-тмРНК-SmpB равна 1 1 1 на всех стадиях транс-трансляции Белок SmpB занимает канонический сайт связывания с тРНК-подобньм доменом тмРНК

2 Псевдоузел 3 тмРНК находится на поверхности рибосомы на всех этапах /иранс-трансляции

3 Псевдоузлы 2, 3 и 4 образуют петлю на поверхности 70S рибосомы Эта петля подвижна в растворе и может занимать различные положения от «плеча» до вершины «головы» 30S субчастицы рибосомы Положения концов данной петли тмРНК на рибосоме соответствуют входу и выходу канала мРНК, предполагая размещение в нем мРНК-подобной части тмРНК

4 Структура и контакты тмРНК, за исключением мРНК-подобного домена и спирали 5, практически не изменяются в ходе транс-трансляции Спираль 5 стабилизируется или защищается при взаимодействии тмРНК с рибосомой Спектр модификаций нуклеотидов мРНК-подобного домена изменяется по мере прохождения тмРНК через рибосому в ходе транс-трансляции

5 Изметтения последовательности в мРНК-подобном домене тмРНК влияют на реакционную способность нуклеотидов в спирали 2, что предполагает существование третичного контакта между этими областями

6 Полученные данные позволили предложить механизм прохождения тмРНК через рибосому в ходе транс-трансляции

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Shpanchenko OV, Zvereva MI, Ivanov PV, Bugaeva EY, Rozov AS, Bogdanov Kalkum M, Isaksson LA, Nierhaus KH, Dontsova OA Stepping transfer messenger through the nbosome J Biol Chem 2005 May 6, 280 (18) 18368-74

2. Bugaeva EY, Shpanchenko OV, Felden B, Isaksson LA, Dontsova OA One SmpB molecule accompanies tmRNA during its passage through the nbosomes FEBS Lett 2008 Apr 30, 582(10) 1532-1536

3 0V Shpanchenko, MI Zvereva, E Y Bugaeva, A S Rozov, A A Bogdanov, Nierhaus, L A Isaksson, M Kalkum, О A Dontsova Mutations in Ribosomal Affect Different Stages of the Translation 2005 Meeting of International Research Scholars Merida, Mexico, June 22-25, 2005 Program and Abstracts, p 39

4 Rozov, Alexey S , Bugaeva, Elizaveta Y., Ivanov, Pavel V , Zvereva, Maria I, Shpanchenko, Olga V , Dontsova, Olga A and Bogdanov, Alexey A Study of trans-translation mechanism using site-directed mutagenesis 21st International tRNA Workshop Bangalore, India, December 2-7,2005 Poster Abstracts, p 167

5 Olga V Shpanchenko, Мала I Zvereva, Elizaveta Yu. Bugaeva, Alexey A Bogdanov, Knud H Nierhaus, Leif A Isaksson, Markus Kalkum ,01ga A Dontsova How does tmRNA pass through the nbosome during fram-translation "Multiple functions of RNA m gene regulation"Roscoff, France May 3-7,2006 Poster Abstracts, p 125

6 Бугаева Е.Ю., Зверева M Э, Шпанченко О В, Донцова OA и Богданов А А Взаимодейтвие тмРНК с рибосомой на различных стадиях транс-трансляции 8-ая Международная Конференция Энгельгардта по Молекулярной Биологии "РНК-белковые взаимодействия" Конференц-центр Буран, Московская область, Россия, Август 19-24, 2006, стр 59

7 Бугаева Е.Ю., Шпанченко О В , Донцова О А Одна молекула SmpB сопровождает тмРНК, при прохождении сквозь остановленные рибосомы XV Международная Научная Конференция для студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2008» Московский Государственный Университет имени Ломоносова, Москва, Россия Апрель 8 - 12, 2008

Отпечатано в копицентре « СТ ПРИНТ » Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус www sfnnnt ru e-mail zakaz@stpnnt ru тел 939-33-38 Тираж 100 экз Подписано в печать 18 06 2008 г

Содержание

Список сокращений

Введение

Обзор литературы тмРНК

Общие сведения о тмРНК

Вторичная структура тмРНК

Процессинг тмРНК

Модификация оснований тмРНК

Аминоацилирование тмРНК

Белок SmpB

Общие сведения о SmpB

Пространственная организация SmpB

Взаимодействие белка SmpB с тмРНК

Взаимодействие SmpB и тмРНК с рибосомой

Транс-трансляция

Модель процесса тиранс-трансляции

Причины появления свободного А сайта в транслирующих рибосомах

Распознавание «арестованных» рибосом и свободного А сайта 43 Переключение на матричную область, узнавание кодона продолжения синтеза

Элонгация и терминация

Деградация белка и мРНК

Биологическая роль /ядонс-трансляции

Материалы и методы

Реактивы и биопрепараты

Буферы и растворы

Трансформация клеток Escherichia coli 57 Приготовление компетентных клеток Escherichia coli для трансформации с помощью теплового шока

Трансформация с помощью теплового шока 58 Введение мутаций в ген, кодирующий тмРНК. Сайт-направленный мутагенез

Анализ активности мутантных молекул тмРНК с помощью „генетической системы"

Выделение комплекса тмРНК с рибосомой

Выделение суммарной РНК комплекса

Окрашивание ПААГ

Выделение суммарного белка комплекса

Окрашивание ПААГ-SDS Кумасси R

Масс-спектрометрический анализ белков

Диализ

УФ-сшивание тмРНК с рибосомой

Приготовление зонда для гибридизации с тмРНК

Нозерн-блот анализ

Переосаждение антител

Определение концентрации белка по методу Брэдфорда

Вестерн-блот анализ

Выделение мутантных тмРНК

Химический пробинг

Крио-электронная томография

Компьютерное моделирование

Результаты и обсуждение

Выделение комплексов транспортно-матричной РНК с рибосомой

Анализ РНК, входящих в состав выделенных комплексов

Анализ белкового состава выделенных комплексов 79 Исследование комплекса тмРНК с рибосомой методом ковалентного сшивания 83 Исследование комплексов тмРНК с рибосомой методом химического пробинга 87 Исследование комплекса тмРНК с рибосомой методом крио-электронной томографии

Компьютерное моделирование процесса прохождения тмРНК через рибосому в ходе транс-трансляции

Выводы

выводы

1. Во всех выделенных тмРНК с рибосомой, в которых транс-трансляция остановлена на различных этапах, присутствует белок SmpB. Стехиометрия комплексов рибосома-тмРНК-SmpB равна 1:1:1 на всех стадиях транс-трансляции. Белок SmpB занимает канонический сайт связывания с тРНК-подобным доменом тмРНК.

2. Псевдоузел 3 тмРНК находится на поверхности рибосомы на всех этапах транстрансляции.

3. Псевдоузлы 2, 3 и 4 образуют петлю на поверхности 70S рибосомы. Эта петля подвижна в растворе и может занимать различные положения от «плеча» до вершины «головы» 30S субчастицы рибосомы. Положения концов данной петли тмРНК на рибосоме соответствуют входу и выходу канала мРНК, предполагая размещение в нем мРИК-подобной части тмРНК.

4. Структура и контакты тмРНК, за исключением мРНК-подобного домена и спирали 5, практически не изменяются в ходе транс-трансляции. Спираль 5 стабилизируется или защищается при взаимодействии тмРНК с рибосомой. Спектр модификаций нуклеотидов мРНК-подобного домена изменяется по мере прохождения тмРНК через рибосому в ходе транс-трансляции.

5. Изменения последовательности в мРНК-подобном домене тмРНК влияют на реакционную способность нуклеотидов в спирали 2, что предполагает существование третичного контакта между этими областями.

6. Полученные данные позволили предложить механизм прохождения тмРНК через рибосому в ходе транс-трансляции.

1. Lee, S.Y., Bailey, S.C. and Apirion, D. (1978) Small stable RNAs from Escherichia coli: evidence for the existence of new molecules and for a new ribonucleoprotein particle containing 6S RNA. J Bacteriol, 133, 1015-23.

2. Inouye, M. and Delihas, N. (1988) Small RNAs in the prokaryotes: a growing list of diverse roles. Cell, 53, 5-7.

3. Jain, S.K., Gurevitz, M. and Apirion, D. (1982) A small RNA that complements mutants in the RNA processing enzyme ribonuclease P. J Mol Biol, 162, 515-33.

4. Keiler, K.C., Shapiro, L. and Williams, K.P. (2000) tmRNAs that encode proteolysis-inducing tags are found in all known bacterial genomes: A two-piece tmRNA functions in Caulobacter. Proc Natl Acad Sci USA, 97, 77/8-83.

5. Jacob, Y., Seif, E., Paquet, P.O. and Lang, B.F. (2004) Loss of the mRNA-like region in mitochondrial tmRNAs of jakobids. RNA, 10, 605-614.

6. Komine, Y., Kitabatake, M., Yokogawa, Т., Nishikawa, K. and Inokuchi, H. (1994) A tRNA-like structure is present in lOSa RNA, a small stable RNA from Escherichia coli. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 91, 9223-9227.

7. Komine, Y. and Inokuchi, H. (1991) Physical map locations of the genes that encode small stable RNAs in Escherichia coli. J Bacteriol, 173, 5252.

8. Chauhan, A.K. and Apirion, D. (1989) The gene for a small stable RNA (lOSa RNA) of Escherichia coli. Mol Microbiol, 3, 1481-5.

9. Moore, S.D. and Sauer, R.T. (2005) Ribosome rescue: tmRNA tagging activity and capacity in Escherichia coli. Mol. Microbiol., 58, 456-466.

10. Hallier, M., Ivanova, N., Rametti, A., Pavlov, M., Ehrenberg, M. and Felden, B. (2004) Pre-binding of small protein В to a stalled ribosome triggers trans-translation. J Biol Chem, 279, 25978-85.

11. Karzai, A.W., Susskind, M.M. and Sauer, R.T. (1999) SmpB, a unique RNA-binding protein essential for the peptide-tagging activity of SsrA (tmRNA). EMBO J., 18, 3793-3799.

12. Hong, S.J., Tran, Q.A. and Keiler, K.C. (2005) Cell cycle-regulated degradation of tmRNA is controlled by RNase R and SmpB. Mol Microbiol, 57, 565-75.

13. Hanawa-Suetsugu, K., Takagi, M., Inokuchi, H., Himeno, H. and Muto, A. (2002) SmpB functions in various steps of trans-translation. Nucleic Acids Res, 30, 1620-1629.

14. Keiler, K.C. and Shapiro, L. (2003) TmRNA is required for correct timing of DNA replication in Caulobacter crescentus. J. Bacteriol., 185, 573-80.

15. Oh, B.K. and Apirion, D. (1991) lOSa RNA, a small stable RNA of Escherichia coli, is functional. Mol. Gen. Genet., 229, 52-56.

16. Zwieb, С., Wower, I. and Wower, J. (1999) Comparative sequence analysis of tmRNA. Nucleic Acids Res, 27, 2063-71.

17. Williams, K.P. and Bartel, D.P. (1996) Phylogenetic analysis of tmRNA secondary structure. Rna, 2, 1306-10.

18. Felden, В., Himeno, H., Muto, A., McCutcheon, J.P., Atkins, J.F. and Gesteland, R.F. (1997) Probing the structure of the Escherichia coli lOSa RNA (tmRNA). Rna, 3, 89-103.

19. Felden, В., Himeno, II., Muto, A., Atkins, J.F. and Gesteland, R.F. (1996) Structural organization of Escherichia coli tmRNA. Biochimie, 78, 979-83.

20. Gaudin, C., Zhou, X., Williams, K.P. and Felden, B. (2002) Two-piece tmRNA in cyanobacteria and its structural analysis. Nucleic Acids Res, 30, 2018-24.

21. Sharkady, S.M. and Williams, K.P. (2004) A third lineage with two-piece tmRNA. Nucleic Acids Res, 32,4531-8.

22. Lin-Chao, S., Wei, C.L. and Lin, Y.T. (1999) RNase E is required for the maturation of ssrA RNA and normal ssrA RNA pepti de-tagging activity. Proc Natl Acad Sci USA, 96, 1240611.

23. Li, Z., Pandit, S. and Deutscher, M.P. (1998) 3' exoribonucleolytic trimming is a common feature of the maturation of small, stable RNAs in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A, 95,2856-61.

24. Ray, B.K. and Apirion, D. (1979) Characterization of 10S RNA: a new stable rna molecule from Escherichia coli. Mol Gen Genet, 174, 25-32.

25. Felden, В., Atkins, J.F. and Gesteland, R.F. (1996) tRNA and mRNA both in the same molecule. Nat Struct Biol, 3, 494.

26. Suddath, F.L., Quigley, G.J., McPherson, A., Sneden, D., Kim, J.J., Kim, S.H. and Rich, A. (1974) Three-dimensional structure of yeast phenylalanine transfer RNA at 3.0angstroms resolution. Nature, 248, 20-4.

27. Tamura, K., Asahara, H., Himeno, H., Hasegawa, T. and Shimizu, M. (1991) Identity elements of Escherichia coli tRNA(Ala). J Mol Recognit, 4, 129-32.

28. Kealey, J.T. and Santi, D.V. (1994) High-level expression and rapid purification of tRNA (m5U54)-methyltransferase. Protein Expr Purif, 5, 149-52.

29. Nurse, K., Wrzesinski, J., Bakin, A., Lane, B.G. and Ofengand, J. (1995) Purification, cloning, and properties of the tRNA psi 55 synthase from Escherichia coli. Rna, 1, 102-12.

30. Cusack, S., Hartlein, M. and Leberman, R. (1991) Sequence, structural and evolutionary relationships between class 2 aminoacyl-tRNA synthetases. Nucleic Acids Res, 19, 3489-98.

31. Francklyn, C. and Schimmel, P. (1989) Aminoacylation of RNA minihelices with alanine. Nature, 337, 478-81.

32. Beuning, P.J., Yang, F., Schimmel, P. and Musier-Forsyth, K. (1997) Specific atomic groups and RNA helix geometry in acceptor stem recognition by a tRNA synthetase. Proc Natl Acad Sci USA, 94, 10150-4.

33. Shi, J.P. and Schimmel, P. (1991) Aminoacylation of alanine minihelices. "Discriminator" base modulates transition state of single turnover reaction. J Biol Chem, 266, 2705-8.

34. Hou, Y.M. and Schimmel, P. (1988) A simple structural feature is a major determinant of the identity of a transfer RNA. Nature, 333, 140-5.

35. McClain, W.H. and Foss, K. (1988) Changing the identity of a tRNA by introducing a G-U wobble pair near the 3' acceptor end. Science, 240, 793-6.

36. Nameki, N., Tadaki, Т., Muto, A. and Himeno, H. (1999) Amino acid acceptor identity switch of Escherichia coli tmRNA from alanine to histidine in vitro. J Mol Biol, 289, 1-7.

37. Barends, S., Wower, J. and Kraal, B. (2000) Kinetic parameters for tmRNA binding to alanyl-tRNA synthetase and elongation factor Tu from Escherichia coli. Biochemistry, 39, 2652-8.

38. Barends, S., Karzai, A.W., Sauer, R.T., Wower, J. and Kraal, B. (2001) Simultaneous and functional binding of SmpB and EF-Tu-TP to the alanyl acceptor arm of tmRNA. J. Mol. Biol., 314, 9-21.

39. Corvaisier, S., Bordeau, V. and Felden, B. (2003) Inhibition of transfer messenger RNA aminoacylation and trans-translation by aminoglycoside antibiotics. J Biol Chem, 278, 14788-97.

40. Miczak, A., Chauhan, A.K. and Apirion, D. (1991) Two new genes located between 2758 and 2761 kilobase pairs on the Escherichia coli genome. J. Bacteriol., 173, 3271-3272.

41. Wower, J., Wower, I.K., Kraal, B. and Zwieb, C.W. (2001) Quality control of the elongation step of protein synthesis by tmRNP. J Nutr, 131, 2978S-82S.

42. Withey, J.H. and Friedman, D.I. (2003) A salvage pathway for protein structures: tmRNA and trans-translation. Annu Rev Microbiol, 57, 101-23.

43. Baumler, A.J., Kusters, J.G., Stojiljkovic, I. and Heffron, F. (1994) Salmonella typhimurium loci involved in survival within macrophages. Infect. Immun., 62, 1623-1630.

44. Wower, J., Zwieb, C.W., Hoffman, D.W. and Wower, I.K. (2002) SmpB: a protein that binds to double-stranded segments in tmRNA and tRNA. Biochemistry, 41, 8826-8836.

45. Barends, S., Bjork, K., Gultyaev, A.P., de Smit, M.H., Pleij, C.W. and Kraal, B. (2002) Functional evidence for D- and T-loop interactions in tmRNA. FEBS Lett., 514, 78-83.

46. Sundermeier, T.R., Dulebohn, D.P., Cho, H.J. and Karzai, A.W. (2005) A previously uncharacterized role for small protein В (SmpB) in transfer messenger RNA-mediated trans-translation. Proc Natl Acad Sci USA, 102, 2316-21.

47. Jacob, Y., Sharkady, S.M., Bhardwaj, K., Sanda, A. and Williams, K.P. (2005) Function of the SmpB tail in transfer-messenger RNA translation revealed by a nucleus-encoded form. J. Biol. Chem., 280, 5503-5509.

48. Dong, G., Nowakowski, J. and Hoffman, D.W. (2002) Structure of small protein B: the protein component of the tmRNA-SmpB system for ribosome rescue. EMBO J., 21, 18451854.

49. Someya, T. et al. (2003) Solution structure of a tmRNA-binding protein, SmpB, from Thermus thermophilus. FEBS Lett., 535, 94-100.

50. Dulebohn, D.P., Cho, H.J. and Karzai, A.W. (2006) Role of conserved surface amino acids in binding of SmpB protein to SsrA RNA. J Biol Chem, 281, 28536-45.

51. Hallier, M., Desreac, J. and Felden, B. (2006) Small protein В interacts with the large and the small subunits of a stalled ribosome during trans-translation. Nucleic Acids Res, 34, 1935-43.

52. Shimizu, Y. and Ueda, T. (2002) The role of SmpB protein in trans-translation. FEBS Lett, 514, 74-7.

53. Nameki, N. et al. (2005) Interaction Analysis between tmRNA and SmpB from Thermus thermophilus. J Biochem (Tokyo), 138, 729-39.

54. Ivanova, N., Lindell, M., Pavlov, M., Holmberg Schiavone, L., Wagner, E.G. and Ehrenberg, M. (2007) Structure probing of tmRNA in distinct stages of trans-translation. RNA, 13, 713-722.

55. Bessho, Y. et al. (2007) Structural basis for functional mimicry of long-variable-arm tRNA by transfer-messenger RNA. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 104, 8293-8298.

56. Gutmann, S., Haebel, P.W., Metzinger, L., Sutter, M., Felden, B. and Ban, N. (2003) Crystal structure of the transfer-RNA domain of transfer-messenger RNA in complex with SmpB. Nature, 424, 699-703.

57. Metzinger, L., Hallier, M. and Felden, B. (2005) Independent binding sites of small protein В onto transfer-messenger RNA during trans-translation. Nucleic Acids Res, 33, 2384-94.

58. Konno, Т., Kurita, D., Takada, K., Muto, A. and Himeno, H. (2007) A functional interaction of SmpB with tmRNA for determination of the resuming point of trans-translation. Rna, 13, 1723-31.

59. Stagg, S.M., Frazer-Abel, A.A., Hagerman, P.J. and Harvey, S.C. (2001) Structural studies of the tRNA domain of tmRNA. J. Mol. Biol., 309, 727-735.

60. Ivanova, N., Pavlov, M.Y., Bouakaz, E., Ehrenberg, M. and Schiavone, L.H. (2005) Mapping the interaction of SmpB with ribosomes by footprinting of ribosomal RNA. Nucleic Acids Res., 33, 3529-3539.

61. Kurita, D., Sasaki, R., Muto, A. and Himeno, H. (2007) Interaction of SmpB with ribosome from directed hydroxyl radical probing. Nucleic Acids Res, 35, 7248-55.

62. Kurita, D., Konno, Т., Takada, K., Muto, A. and Himeno, H. (2007) Molecular mechanism of trans-translation. Nucleic Acids Symp Ser (Oxf), 43-4.

63. Valle, M., Gillet, R., Kaur, S., Henne, A., Ramakrishnan, V. and Frank, J. (2003) Visualizing tmRNA entry into a stalled ribosome. Science, 300, 127-30.

64. Nissen, P., Kjeldgaard, M., Thirup, S., Polekhina, G., Reshetnikova, L., Clark, B.F. and Nyborg, J. (1995) Crystal structure of the ternary complex of Phe-tRNAPhe, EF-Tu, and a GTP analog. Science, 270, 1464-1472.

65. Wimberly, B.T., Brodersen, D.E., demons, W.M., Morgan-Warren, R.J., Carter, A.P., Vonrhein, C., Hartsch, T. and Ramakrishnan, V. (2000) Structure of the 30S ribosomal subunit. Nature, 407, 327-339.

66. Yusupov, M.M., Yusupova, G.Z., Baucom, A., Lieberman, K., Earnest, T.N., Cate, J.H. and Noller, H.F. (2001) Crystal structure of the ribosome at 5.5 A resolution. Science, 292, 883896.

67. Valle, M., Sengupta, J., Swami, N.K., Grassucci, R.A., Burkhardt, N., Nierhaus, K.H., Agrawal, R.K. and Frank, J. (2002) Cryo-EM reveals an active role for aminoacyl-tRNA in the accommodation process. EMBO J., 21, 3557-3567.

68. Valle, M. et al. (2003) Incorporation of aminoacyl-tRNA into the ribosome as seen by cryo-electron microscopy. Nat. Struct. Biol., 10, 899-906.

69. Knudsen, В., Wower, J., Zwieb, C. and Gorodkin, J. (2001) tmRDB (tmRNA database). Nucleic Acids Res, 29, 171-2.

70. Stark, H., Rodnina, M.V., Wieden, II.J., Zemlin, F., Wintermeyer, W. and van Heel, M. (2002) Ribosome interactions of aminoacyl-tRNA and elongation factor Tu in the codon-recognition complex. Nat. Struct. Biol., 9, 849-54.

71. Haebel, P.W., Gutmann, S. and Ban, N. (2004) Dial tm for rescue: tmRNA engages ribosomes stalled on defective mRNAs. Curr Opin Struct Biol, 14, 58-65.

72. Kaur, S., Gillet, R., Li, W., Gursky, R. and Frank, J. (2006) Cryo-EM visualization of transfer messenger RNA with two SmpBs in a stalled ribosome. Proc Natl Acad Sci USA, 103, 16484-9.

73. Sundermeier, T.R. and Karzai, A.W. (2007) Functional SmpB-ribosome interactions require tmRNA. J Biol Chem, 282, 34779-86.

74. Gillet, R., Kaur, S., Li, W., Hallier, M., Felden, B. and Frank, J. (2007) Scaffolding as an organizing principle in trans-translation. The roles of small protein В and ribosomal protein SI. J. Biol. Chem., 282, 6356-6363.

75. Karzai, A.W. and Sauer, R.T. (2001) Protein factors associated with the SsrA.SmpB tagging and ribosome rescue complex. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 98, 3040-3044.

76. Moore, S.D. and Sauer, R.T. (2007) The tmRNA system for translational surveillance and ribosome rescue. Annu. Rev. Biochem., 76, 101-124.

77. Tu, G.F., Rcid, G.E., Zhang, J.G., Moritz, R.L. and Simpson, R.J. (1995) C-terminal extension of truncated recombinant proteins in Escherichia coli with a lOSa RNA decapeptide. J Biol Chem, 270, 9322-6.

78. Keiler, K.C. and Sauer, R.T. (1996) Sequence determinants of C-terminal substrate recognition by the Tsp protease. J. Biol. Chem., 271, 2589-2593.

79. Keiler, K.C., Waller, P.R. and Sauer, R.T. (1996) Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA. Science, 271, 990-993.

80. Withey, J. and Friedman, D. (1999) Analysis of the role of trans-translation in the requirement of tmRNA for lambdaimmP22 growth in Escherichia coli. J. Bacteriol., 181, 2148-2157.

81. Gottesman, S., Roche, E., Zhou, Y. and Sauer, R.T. (1998) The ClpXP and ClpAP proteases degrade proteins with carboxy-terminal peptide tails added by the SsrA-tagging system. Genes Dev., 12, 1338-1347.

82. Herman, C., Thevenet, D., Bouloc, P., Walker, G.C. and D'Ari, R. (1998) Degradation of carboxy-terminal-tagged cytoplasmic proteins by the Escherichia coli protease HflB (FtsH). Genes Dev, 12, 1348-55.

83. Ivanov, P.V. et al. (2002) How does tmRNA move through the ribosome? FEBS Lett, 514, 55-9.

84. Abo, Т., Inada, Т., Ogawa, K. and Aiba, H. (2000) SsrA-mediated tagging and proteolysis of LacI and its role in the regulation of lac operon. EMBO J., 19, 3762-3769.

85. Yamamoto, Y., Sunohara, Т., Jojima, K., Inada, T. and Aiba, II. (2003) SsrA-mediated trans-translation plays a role in mRNA quality control by facilitating degradation of truncated mRNAs. RNA, 9, 408-418.

86. Ueda, K., Yamamoto, Y., Ogawa, K., Abo, Т., Inokuchi, H. and Aiba, H. (2002) Bacterial SsrA system plays a role in coping with unwanted translational readthrough caused by suppressor tRNAs. Genes Cells, 7, 509-19.

87. Abo, Т., Ueda, K., Sunohara, Т., Ogawa, K. and Aiba, H. (2002) SsrA-mediated protein tagging in the presence of miscoding drugs and its physiological role in Escherichia coli. Genes Cells, 7, 629-638.

88. Roche, E.D. and Sauer, R.T. (1999) SsrA-mediated peptide tagging caused by rare codons and tRNA scarcity. EMBO J., 18, 4579-4589.

89. Roche, E.D. and Sauer, R.T. (2001) Identification of endogenous SsrA-tagged proteins reveals tagging at positions corresponding to stop codons. J Biol Chem, 276, 28509-15.

90. Collier, J., Binet, E. and Bouloc, P. (2002) Competition between SsrA tagging and translational termination at weak stop codons in Escherichia coli. Mol Microbiol, 45, 74554.

91. Hayes, C.S., Bose, B. and Sauer, R.T. (2002) Proline residues at the С terminus of nascent chains induce SsrA tagging during translation termination. J Biol Chem, 277, 33825-32.

92. Sunohara, Т., Abo, Т., Inada, T. and Aiba, H. (2002) The C-terminal amino acid sequence of nascent peptide is a major determinant of SsrA tagging at all three stop codons. Rna, 8, 1416-27.

93. Hayes, C.S., Bose, B. and Sauer, R.T. (2002) Stop codons preceded by rare arginine codons are efficient determinants of SsrA tagging in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA, 99, 3440-5.

94. Li, X., Yokota, Т., Ito, К., Nakamura, Y. and Aiba, H. (2007) Reduced action of polypeptide release factors induces mRNA cleavage and tmRNA tagging at stop codons in Escherichia coli. Mol. Microbiol., 63, 116-126.

95. Hayes, C.S. and Sauer, R.T. (2003) Cleavage of the A site mRNA codon during ribosome pausing provides a mechanism for translational quality control. Mol. Cell, 12, 903-911.

96. Sunohara, Т., Jojima, K., Tagami, H., Inada, T. and Aiba, H. (2004) Ribosome stalling during translation elongation induces cleavage of mRNA being translated in Escherichia coli. J. Biol. Chem., 279, 15368-15375.

97. Sunohara, Т., Jojima, K., Yamamoto, Y., Inada, T. and Aiba, H. (2004) Nascent-peptide-mediated ribosome stalling at a stop codon induces mRNA cleavage resulting in nonstop mRNA that is recognized by tmRNA. RNA, 10, 378-86.

98. Collier, J., Bohn, C. and Bouloc, P. (2004) SsrA tagging of Escherichia coli SecM at its translation arrest sequence. J. Biol. Chem., 279, 54193-54201.

99. Li, X., Hirano, R., Tagami, H. and Aiba, H. (2006) Protein tagging at rare codons is caused by tmRNA action at the 3' end of nonstop mRNA generated in response to ribosome stalling. RNA, 12, 248-255.

100. Li, X., Yagi, M., Morita, T. and Aiba, H. (2008) Cleavage of mRNAs and role of tmRNA system under amino acid starvation in Escherichia coli. Mol Microbiol, 68, 462-73.

101. Garza-Sanchez, F., Janssen, B.D. and Hayes, C.S. (2006) Prolyl-tRNA(Pro) in the A-site of SecM-arrested ribosomes inhibits the recruitment of transfer-messenger RNA. J. Biol. Chem., 281, 34258-34268.

102. Asano, K., Kurita, D., Takada, K., Konno, Т., Muto, A. and Himeno, H. (2005) Competition between trans-translation and termination or elongation of translation. Nucleic Acids Res., 33, 5544-5552.

103. Ivanova, N., Pavlov, M.Y., Felden, B. and Ehrenberg, M. (2004) Ribosome rescue by tmRNA requires truncated mRNAs. J. Mol. Biol., 338, 33-41.

104. Yusupova, G.Z., Yusupov, M.M., Cate, J.H. and Noller, H.F. (2001) The path of messenger RNA through the ribosome. Cell, 106, 233-241.

105. Jenner, L. et al. (2005) Translational operator of mRNA on the ribosome: How repressor proteins exclude ribosome binding. Science, 308, 120-123.

106. Ivanova, N., Pavlov, M.Y. and Ehrenberg, M. (2005) tmRNA-induced release of messenger RNA from stalled ribosomes. J. Mol. Biol., 350, 897-905.

107. Williams, K.P., Martindale, K.A. and Bartel, D.P. (1999) Resuming translation on tmRNA: a unique mode of determining a reading frame. EMBO J., 18, 5423-33.

108. Lim, V.I. and Garber, M.B. (2005) Analysis of recognition of transfer-messenger RNA by the ribosomal decoding center. J. Mol. Biol., 346, 395-8.

109. O'Connor, M. (2007) Minimal translation of the tmRNA tag-coding region is required for ribosome release. Biochem Biophys Res Commun, 357, 276-81.

110. Sauer, R.T. et al. (2004) Sculpting the proteome with AAA(+) proteases and disassembly machines. Cell, 119, 9-18.

111. Weber-Ban, E.U., Reid, B.G., Miranker, A.D. and Horwich, A.L. (1999) Global unfolding of a substrate protein by the HsplOO chaperone ClpA. Nature, 401, 90-93.

112. Kim, Y.I., Burton, R.E., Burton, B.M., Sauer, R.T. and Baker, T.A. (2000) Dynamics of substrate denaturation and translocation by the ClpXP degradation machine. Mol. Cell, 5, 639-648.

113. Wiegert, T. and Schumann, W. (2001) SsrA-mediated tagging in Bacillus subtilis. J. Bacteriol., 183,3885-3889.

114. Farrell, C.M., Grossman, A.D. and Sauer, R.T. (2005) Cytoplasmic degradation of ssrA-tagged proteins. Mol. Microbiol., 57, 1750-1761.

115. Bohn, C., Binet, E. and Bouloc, P. (2002) Screening for stabilization of proteins with a trans-translation signature in Escherichia coli selects for inactivation of the ClpXP protease. Mol. Genet. Genomics, 266, 827-831.

116. Baker, T.A. and Sauer, R.T. (2006) ATP-dependent proteases of bacteria: recognition logic and operating principles. Trends Biochem Sci., 31, 647-653.

117. Flynn, J.M., Levchenko, I., Seidel, M., Wickner, S.H., Sauer, R.T. and Baker, T.A. (2001) Overlapping recognition determinants within the ssrA degradation tag allow modulation of proteolysis. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 98, 10584-10589.

118. Levchenko, I., Grant, R.A., Wah, D.A., Sauer, R.T. and Baker, T.A. (2003) Structure of a delivery protein for an AAA+ protease in complex with a peptide degradation tag. Mol. Cell, 12, 365-372.

119. Flynn, J.M., Levchenko, I., Sauer, R.T. and Baker, T.A. (2004) Modulating substrate choice: the SspB adaptor delivers a regulator of the extracytoplasmic-stress response to the AAA+ protease ClpXP for degradation. Genes Dev, 18, 2292-301.

120. Levchenko, I., Seidel, M., Sauer, R.T. and Baker, T.A. (2000) A specificity-enhancing factor for the ClpXP degradation machine. Science, 289, 2354-2356.

121. Lessner, F.H., Venters, B.J. and Keiler, K.C. (2007) Proteolytic adaptor for transfer-messenger RNA-tagged proteins from alpha-proteobacteria. J. Bacteriol., 189, 272-275.

122. Dougan, D.A., Reid, B.G., Horwich, A.L. and Bukau, B. (2002) ClpS, a substrate modulator of the ClpAP machine. Mol. Cell, 9, 673-683.

123. Ito, К. and Akiyama, Y. (2005) Cellular functions, mechanism of action, and regulation of FtsH protease. Annu. Rev. Microbiol, 59, 211-231.

124. Herman, C., Prakash, S., Lu, C.Z., Matouschek, A. and Gross, C.A. (2003) Lack of a robust unfoldase activity confers a unique level of substrate specificity to the universal AAA protease FtsH. Mol. Cell, 11, 659-669.

125. Choy, J.S., Aung, L.L. and Karzai, A.W. (2007) Lon protease degrades transfer-messenger RNA-tagged proteins. J Bacteriol, 189, 6564-71.

126. Mehta, P., Richards, J. and Karzai, A.W. (2006) tmRNA determinants required for facilitating nonstop mRNA decay. Rna, 12, 2187-98.

127. Richards, J., Mehta, P. and Karzai, A.W. (2006) RNase R degrades non-stop mRNAs selectively in an SmpB-tmRNA-dependent manner. Mol. Microbiol., 62, 1700-1712.

128. Okan, N.A., Bliska, J.B. and Karzai, A.W. (2006) A Role for the SmpB-SsrA system in Yersinia pseudotuberculosis pathogenesis. PLoS Pathog, 2, e6.

129. Muto, A., Fujihara, A., Ito, K.I., Matsuno, J., Ushida, C. and Himeno, H. (2000) Requirement of transfer-messenger RNA for the growth of Bacillus subtilis under stresses. Genes Cells, 5, 627-35.

130. Julio, S.M., Heithoff, D.M. and Mahan, M.J. (2000) ssrA (tmRNA) plays a role in Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. J. Bacteriol., 182, 1558-1563.

131. Braud, S., Lavire, C., Bellier, A. and Mazodier, P. (2006) Effect of SsrA (tmRNA) tagging system on translational regulation in Streptomyces. Arch. Microbiol., 184, 343-352.

132. Huang, C., Wolfgang, M.C., Withey, J., Koomey, M. and Friedman, D.I. (2000) Charged tmRNA but not tmRNA-mediated proteolysis is essential for Neisseria gonorrhoeae viability. EMBO J., 19, 1098-1107.

133. Hutchison, C.A., Peterson, S.N., Gill, S.R., Cline, R.T., White, O., Fraser, C.M., Smith, H.O. and Venter, J.C. (1999) Global transposon mutagenesis and a minimal Mycoplasma genome. Scicnce, 286, 2165-2169.

134. Shin, J.H. and Price, C.W. (2007) The SsrA-SmpB ribosome rescue system is important for growth of Bacillus subtilis at low and high temperatures. J Bacteriol, 189, 3729-37.

135. Munavar, H., Zhou, Y. and Gottesman, S. (2005) Analysis of the Escherichia coli Alp phenotype: heat shock induction in ssrA mutants. J. Bacteriol., 187, 4739-4751.

136. Ranquet, C., Geiselmann, J. and Toussaint, A. (2001) The tRNA function of SsrA contributes to controlling repression of bacteriophage Mu prophage. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 98, 10220-5.

137. Billington, S.J., Johnston, J.L. and Rood, J.I. (1996) Virulence regions and virulence factors of the ovine footrot pathogen, Dichelobacter nodosus. FEMS Microbiol Lett, 145, 147-56.

138. Ebeling, S., Kundig, C. and Hennecke, H. (1991) Discovery of a rhizobial RNA that is essential for symbiotic root nodule development. J. Bacteriol., 173, 6373-6382.

139. Keiler, K.C. and Shapiro, L. (2003) tmRNA in Caulobacter crescentus is cell cycle regulated by temporally controlled transcription and RNA degradation. J. Bacteriol., 185, 1825-1830.

140. Hong, S.J., Lessner, F.H., Mahen, E.M. and Keiler, K.C. (2007) Proteomic identification of tmRNA substrates. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 104, 17128-17133.

141. Bugaeva, E.Y., Shpanchenko, O.V., Felden, В., Isaksson, L.A. and Dontsova, O.A. (2008) One SmpB molecule accompanies tmRNA during its passage through the ribosomes. FEBS Lett, 582, 1532-6.

142. Shpanchenko, O.V. et al. (2005) Stepping transfer messenger RNA through the ribosome. J Biol Chem, 280, 18368-74.

143. Nowotny, P., Nowotny, V., Voss, H. and Nierhaus, K. (1988) Preparation and activity measurements of deuterated 50S subunits for neutron-scattering analysis. Meth. Enzymol., 164, 131-147.

144. Krutchinsky, A.N., Kalkum, M. and Chait, B.T. (2001) Automatic identification of proteins with a MALDI-quadrupole ion trap mass spectrometer. Anal Chem, 73, 5066-77.

145. Kalkum, M., Lyon, G.J. and Chait, B.T. (2003) Detection of secreted peptides by using hypothesis-driven multistage mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci USA, 100, 2795-800.

146. Bradford, M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 72, 24854.

147. Moazed, D., Stern, S. and Noller, H. (1986) Rapid chcmical probing of conformation in 16S ribosomal rRNA and 30S subunits using primer extension. J. Mol. Biol., 187, 399-416.

148. Moazed, D. and Noller, H.F. (1986) Transfer RNA shields specific nucleotides in 16S ribosomal RNA from attack by chemical probes. Cell, 47, 985-94.

149. Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J. and McDowall, A.W. (1984) Cryo-electron microscopy of viruses. Nature, 308, 32-6.

150. Lindahl, E., Hess, B. and van der Spoel, D. (2001) Gromacs 3.0: A package for molecular simulation and trajectory analysis. J. Mol. Mod., 7, 306-317.

151. Van Der Spoel, D., Lindahl, E., Hess, В., Groenhof, G., Mark, A.E. and Berendsen, H.J. (2005) GROMACS: fast, flexible, and free. J Comput Chem, 26, 1701-18.

152. Srisawat, C. and Engelke, D.R. (2001) Streptavidin aptamers: affinity tags for the study of RNAs and ribonucleoproteins. Rna, 7, 632-41.

153. Jurica, M.S., Licklider, L.J., Gygi, S.R., Grigorieff, N. and Moore, M.J. (2002) Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis. RNA, 8, 426-39.

154. Leonov, A.A., Sergiev, P.V., Bogdanov, A.A., Brimacombe, R. and Dontsova, O.A. (2003) Affinity purification of ribosomes with a lethal G2655C mutation in 23 S rRNA that affects the translocation. J. Biol. Chem., 278, 25664-25670.

155. Nameki, N., Tadaki, Т., Himeno, H. and Muto, A. (2000) Three of four pseudoknots in tmRNA are interchangeable and are substitutable with single-stranded RNAs. FEBS Lett, 470, 345-9.

156. Bjornsson, A. and Isaksson, L.A. (1996) Accumulation of a mRNA decay intermediate by ribosomal pausing at a stop codon. Nucleic Acids Res, 24, 1753-1757.

157. Mukherjee, S., Shukla, A. and Guptasarma, P. (2003) Single-step purification of a protein-folding catalyst, the SlyD peptidyl prolyl isomerase (PPI), from cytoplasmic extracts of Escherichia coli. Biotechnol. Appl. Biochem., 37, 183-186.

158. Tate, W., Greuer, B. and Brimacombe, R. (1990) Codon Recognition in Polypeptide Chain Termination : Site Directed Crosslinking of Termination Codon to Escherichia coli Release Factor-2. Nucleic Acids Res., 18, 6537-6544.