Электрохимические реакции пероксидазы тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.05 ВАК РФ

Фридман, Вадим Анатольевич АВТОР
кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ
1999 ГОД ЗАЩИТЫ
   
02.00.05 КОД ВАК РФ
Диссертация по химии на тему «Электрохимические реакции пероксидазы»
 
 
Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Фридман, Вадим Анатольевич, Москва

Российская Академия наук Институт электрохимии им. А.Н. Фрумкина

Фридман Вадим Анатольевич Электрохимические реакции пероксидазы

(02.00.05 - Электрохимия)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор

1 ¿рМ^ эд р уарасевич

кандидат химических наук, старший научный сотрудник

В.А. Богдановская

Москва 1999

Оглавление

Введение.........................................................3

ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Биоэлектрокаталитические и окислительно-восстановительные реакции ферментов на углеродных материалах.................................5

1.1. Общие представления о структуре и свойствах ферментов............7

1.2. Способы иммобилизации ферментов в электрохимических системах. . . 8

2. Биоэлектрокаталитические реакции в условиях непосредственного обмена электронами между электродом и активным центром фермента (реакции прямого биоэлектрокатализа)................................9

3. Пероксидаза и её функции в электрокатализе........................15

3.1. Строение и краткая характеристика физико-химических и ферментативных свойств пероксидазы...........................................16

3.2. Биоэлектрокатализ пероксидазой на твердых электродах.............19

3.3. Окислительно-восстановительные превращения пероксидазы на электродах............................................................21

4. Механизм биоэлектрокатализа.....................................23

Заключение.......................................................25

ЧАСТЬ 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Методы электрохимических измерений............................27

2. Электроды и электродные материалы..............................28

3. Реагенты и рабочие растворы.....................................31

4. Иммобилизация ферментов.......................................32

ЧАСТЬ 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. Редокс-превращения гемсодержащих соединений

1. Редокс-превращения пероксидазы.................................35

2. Редокс-превращения микропероксидазы МП-11......................42

Глава 2. Электрокатализ иммобилизованной пероксидазой

1 .Биоэлектрокаталитическое восстановление Н202 пероксидазой, иммобилизованной на углеродном электроде........................50

1.1. Влияние концентрации пероксида водорода, скорости вращения электрода и рН раствора на скорость электрокаталитической реакции.......51

1.2. Влияние ингибиторов и активаторов фермента на скорость

электровосстановления Н2О2........................................58

1.1. Анализ кинетической схемы реакции.............................63

2. Электрокаталитическое восстановление кислорода пероксидазой, иммобилизованной на сажевом электроде............................66

1. Биоэлектрокатализ пероксидазой, соиммобилизованной с >1-метилпирролом.................................................73

2. Электровосстановление пероксида водорода пероксидазой,

иммобилизованной в Нафион.......................................87

Выводы....................................................... 92

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.........................................94

Введение

Перспективы использования ферментов в электрохимии обусловлены высокой каталитической активностью белковых макромолекул и высокой специфичностью их действия. Разработанные методы сопряжения ферментативных и электрохимических реакций позволяют использовать ферменты в электрохимических процессах. Прежде всего, это возможность осуществлять с высокими скоростями такие важные в практическом отношении реакции, как электровосстановление пероксида водорода и молекулярного кислорода. В этом плане наиболее интересны обнаруженные в конце 70-х годов реакции прямого биоэлектрокатализа, протекающие в условиях непосредственного обмена электронами между электродом и активным центром белкового катализатора. Перечень ферментов, в присутствии которых наблюдаются подобные реакции, заметно пополняется в последние годы, однако механизм реакции остаётся предметом дискуссий.

Целью настоящей работы являлось изучение закономерностей био-электрокаталитических реакций в системе электрод - активный центр фермента - субстрат для гемсодержащего фермента пероксидазы, адсорбированного на углеродных электродах (сажа, пирографит) и встроенного в полимерные плёнки.

Непосредственный перенос электрона между электродом и активным центром фермента (в отсутствие субстрата) является, по-видимому, необходимым условием для реализации прямого биоэлектрокатализа. В этом случае на циклических вольтамперных кривых (ЦВА) должна наблюдаться характерная картина редокс-превращения простетических групп белковых катализаторов. Первая глава экспериментальной части настоящей работы по-

священа изучению редокс-превращений пероксидазы и её модели микро-пероксидазы на углеродных электродах.

Механизму самой реакции пероксидазного электрокатализа (чрезвычайно важной в практическом отношении) посвящена вторая глава. Подробно анализируется влияние различных экспериментальных факторов на скорость восстановления пероксида водорода и кислорода пероксидазой, адсорбированной на углеродном электроде, на основе чего предлагается возможная схема реакции и механизм переноса электрона между электродом, активным центром пероксидазы и субстратом.

Эффективность функционирования ферментных электродов повышается во многих случаях в результате иммобилизации белковых катализаторов в полимерные плёнки. По этой причине следующий этап диссертационной работы заключался в исследовании реакции восстановления пероксида водорода пероксидазой, соиммобилизованной с электропроводным (полиметил-пиррол) и неэлектропроводным (Нафион) полимерами.

Часть I. Обзор литературы.

1. Биоэлектрокаталитические и окислительно-восстановительные реакции ферментов на углеродных материалах.

Основной задачей электрокатализа является интенсификация электрохимических реакций в условиях, максимально приближенных к равновесным. Значительная эффективность в этом направлении достигнута с использованием ферментов - катализаторов белковой природы. Данная область научных исследований получила название биоэлектрокатализа.

Углеродные материалы широко используются в качестве электропроводящей подложки для иммобилизации (привязывания) ферментов [1,66]. Это обусловлено такими свойствами углеродных электродов, как широкий спектр состава поверхностных групп (хиноновые, карбоксильные, лактоно-вые), по которым происходит адсорбция белков, а также гидрофобно-гидрофильных характеристик электродной поверхности [2]. Привлекательность физико-химических свойств различных углеродных материалов открывает перспективы для применения их в качестве основы ферментных электродов (в особенности одноразовых) для анализа различных субстратов [5]. Углеродные электроды широко используются и в фундаментальных работах, посвященных исследованию электрохимических превращений белков и ферментов, что позволяет получить более детальную информацию о кинетике ферментативных окислительно-восстановительных реакций [1,3,6]. Небольшие по размеру редокс-протеины можно рассматривать как модельные белки для некоторых ферментных молекул, электрохимические реакции которых во многих случаях затруднены [84,86,87,90]. Однако в некоторых ра-

ботах удалось непосредственно зафиксировать редокс-превращения ряда ферментов на циклических вольтамперных кривых (ЦВА), о чем будет сказано далее.

Многие ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции (их называют оксидоредуктазы) [4,6] ускоряют биэлектрохи-мические реакции окисления (восстановления) с участием медиаторов (низкомолекулярных переносчиков электронов между электродом и активным центром белкового катализатора).

Как удалось установить в 70 ~ 90-е годы, некоторые из подобных ферментов катализируют электрохимические реакции соответствующих субстратов и в отсутствие медиаторов. Было высказано предположение, что в данных реакциях, которые называют реакциями безмедиаторного электронного переноса между электродом, активным центром фермента и субстратом (реакциями прямого биоэлектрокатализа), электрод непосредственно обменивается электронами с активным центром фермента. Впервые эти реакции были исследованы именно на углеродных электродах [1,3,11-15].

Авторы некоторых публикаций полагают, что прямой электронный перенос возможен в том случае, когда в результате взаимодействия фермента с поверхностью электрода формируется комплекс, подобный по своему строению промежуточному комплексу белкового катализатора и одного из субстратов ферментативного катализа. В этом случае возможно электрохимическое восстановление (окисление) второго субстрата [1,3,4]. Данное условие как раз реализуется на углеродной поверхности. Функциональные кислородсодержащие группы углеродного электрода обеспечивают не только адсорбционное привязывание ферментов, но и ,по-видимому, необходимое для реализации прямого электронного переноса микроокружение ферментной глобулы. [1,3-5,31].

1.1. Общие представления о структуре и свойствах ферментов.

Ферменты представляют собой катализаторы белковой природы [1]. Белки - это высокомолекулярные соединения, состоящие из а - аминокислот, связанных пептидными связями. Полипептидная цепь определяет первичную структуру белка. Помимо первичной, белки имеют вторичную, третичную и иногда четвертичную структуру. Вторичная структура определяется специфической укладкой локальных участков полимерной цепи в пространстве. Наиболее характерной для белков является а - спираль, которая поддерживается за счёт образования водородных связей. Третичная структура определяется свёртыванием полипептидной цепи в компактную сферическую глобулу. Полипептидные цепи стремятся свернуться таким образом, чтобы во внутренней части молекулы находилось как можно больше гидрофобных боковых цепей аминокислот, что предохраняет их от термодинамически невыгодного контакта с водной средой. В больших белковых молекулах имеется в ряде случаев не одна, а несколько полипептидных цепей, которые в результате взаимодействия укладываются в четвертичную структуру.

Помимо белковой глобулы (апофермента), ферменты содержат небелковую часть - простетическую группу, состоящую из ионов металлов или низкомолекулярных органических редокс-соединений. Из простетической группы и фрагментов полипептидной цепи формируется активный центр белка. Перенос электрона в белковых молекулах протекает с окислением или восстановлением активных центров. Простетическая группа гемсодержащих белков (цитохром С, пероксидаза, каталаза) представляет собой порфирин железа [72]. Большая группа флавопротеинов содержит в активном центре флавинадениндинуклеотид (ФАД).

1.2. Способы иммобилизации ферментов в электрохимических системах.

Под иммобилизацией понимают способ "привязывания" ферментов к носителю (в данном случае к электроду). Иммобилизация за счет сил физической и химической адсорбции представляет собой наиболее простой метод, широко используемый в случае углеродных электродов. Однако данный способ имеет тот недостаток, что в процессе работы часть белка десорбиру-ется с поверхности, особенно если проводить исследования с вращающимися электродами или в проточном растворе. Для предотвращения вымывания с поверхности сорбента используют иммобилизацию белков в полимерные, в том числе электрохимическими методами осаждённые пленки. В условиях катодной поляризации (которая, как правило, не инактивирует фермент) применяют соосаждение фермента с гелем ПВС (поливинилового спирта) и с акриламидом [1,4]. Используют и другой способ - после обычной адсорбционной иммобилизации белки "сшивают" глутаровым альдегидом [1,4,5 ], покрывают поверхность электрода ионообменными мембранами или растворами ионообменных полимеров Naflon (Нафион - сополимер тетрафторэтиле-на и перфторалкилвинилового эфира) [77, 78] и Eastman AQ (полистер-сульфоновая кислота) [7,8,31].

Широко распространенным методом иммобилизации белков является привязывание к поверхности электрода через модификаторы. В качестве модифицирующих агентов используют дипиридил , пурин, метилвиологен [1]. Основные требования, которые предъявляют к модифицирующим агентам, заключаются в том, что они должны иметь две функциональные группы, одна из которых образует прочную связь с поверхностью электрода, а вторая взаимодействует с белковой глобулой. В последнее десятилетие широко используют водорастворимые производные карбодиимида для ковалентного привязывания амино- (или карбоксильных) групп белковых молекул к кар-

боксильным (или, соответственно, аминогруппам), предварительно синтезированным на поверхности электрода [49,52,60].

Опубликовано ряд работ, в которых использовали электрохимическую иммобилизацию ферментов в электропроводные полимерные пленки (полипиррол и его производные, полианилин, и т.д.) [9, 10, 39 -41, 82, 87, 88, 90, 91]. Варьируя параметры электрохимической полимеризации и применяя различные допирующие агенты, можно синтезировать непосредственно на электроде пленку определенной толщины и структуры, а путем соосаждения ферментов с мономерами, устойчивыми в нейтральной среде (пиррол и его производные), обеспечить эффективное встраивание белка в полимерную матрицу. В этом случае ферментная глобула как бы "обволакивается" со всех сторон цепями электропроводного полимера что, по мнению ряда авторов, способствует переносу заряда между электродом и активным центром включенного в полимер белка [26,40].

2. Биоэлектрокаталитические реакции в условиях непосредственного обмена электронами между электродом и активным центром фермента (реакции прямого биоэлектрокатализа).

Еще в 1978 году было показано, что фермент лакказа (медьсодержащая п-фенолоксидаза), адсорбированная на сажевом электроде, катализирует электровосстановление молекулярного кислорода в отсутствие медиатора [11]. Позже на углеродном электроде были обнаружены и редокс-превращения ионов меди активного центра фермента [12]. Другой медьсодержащий фермент - тирозиназа также ускоряет реакцию восстановления кислорода. [13].

Цитохром b2 (фермент, содержащий флавинмононуклеотид и гем) ускоряет электроокисление лактата на оргметаллическом (электронпроводящее органическое соединение) и углеродном электродах [4,6].

В 1980 году опубликована статья [14], посвященная прямому электроокислению молекулярного водорода гидрогеназой - ферментом, содержащим в активном центре железосерный кластер.

Сажевый электрод с адсорбированной пероксидазой из хрена катализирует безмедиаторное электровосстановление пероксида водорода, что было впервые показано в 1979 году в работе [15]. Аналогичные результаты были получены в 1989 году с цитохром С пероксидазой, адсорбированной на пирографите [81].

В 1989 году [16] обнаружен эффект безмедиаторного переноса электрона между п-крезолметилгидроксилазой (ферментом, содержащем в активном центре гем и ФАД, и катализирующем процессы бактериального метаболизма п-крезола) и краевой плоскостью пирографитового электрода. Рост анодного тока окисления п-крезола наблюдается в присутствии промоторов - положительно заряженных катионов и органических молекул (полиаминов и аминогликозидов) в объеме раствора. Положительно заряженные ионы промотора концентрируются во внешней плоскости Гельм-гольца и уменьшают отталкивающее влияние электрода на отрицательно заряженную ферментную глобулу. В присутствии органических промоторов белок претерпевает на электроде квазиобратимые редокс-превращения вблизи окислительно-восстановительного потенциала гем-содержащей субьединицы (0,04 В), определенного в обьеме раствора потенциометриче-ским титрованием редокс-медиатором. (Здесь и далее потенциалы приведены по насыщенному хлорсеребряному электроду (Ag/AgCl) при рН=7). К этой величине близок и потенциал полуволны Е ш окисления п-крезола

(0,03 В). Обобщив полученные экспериментальные данные, а также исходя из известной ранее схемы ферментативного катализа п-крезолметил-гидроксилазой, авторы [16] предложили механизм электрохимической реакции: субстрат вначале окисляется на флавинадениндинуклеотиде (ФАД), после чего происходит быстрая передача электрона на гем, который затем электрохимически окисляется на поверхности электрода. Аналогичные результаты получены этими же авторами на пирографите с другим флавогемо-вым ферментом - флавоцитохромом С552, который катализирует электроокисление гидросульфидов [17]. Здесь, как и в предыдущем случае, на электроде зафиксированы редокс-превращения, близкие к редокс-потенциалу гемсодержащей субьединицы и к потенциалу полуволны окисления субстрата.

В работе [18] описываются электрохимические свойства и электрокаталитическая активность другого фермента - метиламин дегидрогеназы, катализирующего электроокисление метиламина на пирографите и модифицированном золотом электроде. Кофактор фермента имеет хиноидную структуру , и его р�