Исследование каталитического окисления арахидоновой и линолевой кислот по 5-липоксигеназному пути тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ именн М. В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи ЛАГУТИНА Ирина Олеговна

ИССЛЕДОВАНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКОГО ОКИСЛЕНИЯ АРАХИДОНОВОИ И ЛИНОЛЕВОЙ КИСЛОТ НО 5-ЛИ ПОКСИ ГЕН АЗ НОМУ ПУТИ

(02.00.15 — химическая кинетика и катализ)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА 1990

Работа выполнена в секторе биокинстнки Межфакультет-cKoii научно-исследовательской лаборатории молекулярной биологии и биоорганической химии им. А. Н. Белозерского и на кафедре химической энзнмологии Химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Научный руководитель — доктор химических наук, профессор С. Д. Варфоломеев.

Научный консультант —старший научный сотрудник, кандидат химических наук Г. Ф. Судьина.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Б. И. Курганов, доктор химических наук, ведущий научный сотрудник Е. С. Чухрай.

Ведущая организация — Институт тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова.

Защита диссертации состоится «/3 » HOJLÖ'pJi- ■ ■ ■

1990 г. в «/6» часов на заседании специализированного совета Д.053.05.76 по химчиеским наукам при Московском государственном университете >по адресу: 119899, ГСП, Москва, Ленинокие горы, МГУ, химический факультет, кафедра химической энзимологии.

С диссертацией можно ознакомиться ¡в библиотеке химического факультета МГУ.

Автореферат разослан «21 » UhOJ)S..... 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета — кандидат химических наук

А. Кост

ОШЯ_^РАКОТИСТЖА_РАБОТЫЛ

„Акт^альность_П20блемнл Рост заболеваний, вызываемых нарушением иммунной системы, стал поистине проблемой 20 века. Это - различные аллергии, онкологические заболевания, это, наконец, СПИД. В последние годы стало известно, что важную роль в развитии аллер гических реакций и воспалительных процессов играют лейкотриены -продукты трансформации арахидоновой кислоты по 5-липоксигеназному пути. Лейкотриены оказывают влияние на развитие клеточного иммунитета и на продуцирование г-интерферона. Содержание лейкотриенов и других липоксигеназных метаболитов в крови здоровых людей, онкологических больных и больных аллергией значительно различается. Большое внимание привлекает поиск новых эффективных лекарственных противоаллергических и противоопухолевых препзратов, однако не менее важно понимание механизма регуляции патологичеких процессов в организме. 5-липоксигеназа - фермент, инициирующий первую стада в каскаде реакций, ведущих к образованию лейкотриенов и других физиологически активных вешеств. К настоящему времени имеется мало данных по кинетическим закономерностям ферментативного катализа 5-липоксигеназой. Исследование 5-липоксигенззы из клубней картофеля, создание кинетической схемы действия этого фермента является актуальным для понимания механизма действия 5-липоксигеназ из различных источников, а также всего класса липоксигеназ. С другой стороны, 5-липоксигенаэу растительного происхождения можно использовать в технологических целях для получения продуктов ферментативной трансформации полиненасыщенных жирных кислот.

_Целью_работы_;. является выделение и исследование 5-липокси-геназы из клубней картофеля, выяснение кинетических закономерностей и создание кинетической модели действия данного фермента, разработка • условий препаративного биосинтеза 5-гндроксиэйкозатетраеновой кислоты.

_Н§Цчная_новизна_вабдтц^ Впервые получены данные по кинетическому механизму ферментативного катализа 5-липоксигеназой из клубней картофеля. Предложена кинетическая модель действия фермента. Разработаны условия получения 5-нете.

_Пв§кТ32§0кая_значимдсть:. Проведенное исследование может оказать большую помощь в понимании механизма действия 5-липоксигеназ и использовано для сравнительного анализа поведения различ-

еых шлоксигеназ. Данная работа вносит свой вклад в понимание регуляции патологических процессов в организме. Установленные в работе кинетические закономерности и механизм каталитического действия 5-лилоксигенэзы могут быть использованы в лекционных курсах по кинетике действия многосайтовых ферментов. Разработанные оптимальные условия биосинтеза 5-нете могут быть использованы для получения его в лабораторных условиях.

_Апробация_работы:. Результаты работы докладывались на международном симпозиуме "Synthesis and research of prostaglandins" , Таллин, октябрь 20 - 23, i986;_ на международном симпозиуме "Chemical physics of enzyme catalysis." , ТаЛЛИН, сентябрь 21 -24, 1987 ; на iv Всесоюзной кон$еренции по синтезу и исследованию простагландинов от 11-12 октября, Минск - 1989г.

Публикации;. По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

_Ст£уктуЕа_и_объем_вабдтн.1 Диссертация состоит из введения, литературного обзора / i глава /, описания материалов и методов / 2 глава /, результатов эксперимента и их обсуждения /з глава /, выводов. Общий объем работы составляет 11$ страниц машинописного текста, включая29 рисунков, 3 схемы, 3 таблицы и библиографию из /б/ ссылки.

В главе i изложены литературные данные о ферментах класса липоксигеназ и приведены, ингибиторы данных ферментов, а также проанализирован ряд аспектов каталитического действия липоксигеназ.

В главе z описаны метода определения активности 5-липокси-

*

геназы, очистка фемента, приведены методики кинетических исследований и математической обработки данных. Указана методика получения, выделения и очистки 5-нете.

В главе з представлены экспериментальные данные по выделению и очистке фермента , регуляции активности s-липоксигеназы под действием температуры, по кинетике действия картофельной 5-липок-сигеназы. Предложена кинетическая схема действия картофельной 5-лшюксигеназы, и проведен ее анализ в равновесно-стационарном режиме. В этой же главе проведено обсуждение полученных результатов. Приведены данные по биосинтезу 5-нете.

МЕТОДИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ.

В работе использовалась 5-липоксигеназа картофельных клубней. Выделение гомогенных препаратов фермента проводилось с использо-

вашем хроматогрзфических методов фракционирования белков и быстрой хроматографии под давлением.

I.ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА 5-ЛМОКСИГЕНАЗН ИЗ КЛУШЕИ КАРТОФЕЛЯ.

5-липоксигеназа - минорный белок в цитозолыюм экстракте картофельных клубней. С учетом высокой лабильности 5-липоксигена-зы, разработан процесс очистки фермента, состоящий из небольшого числа быстрых и высокоэффективных стадий. Данные по очистке картофельной 5-липоксигеназы приведены в таблице 1.

Таблица 1. Очистка 5-липоксигеназы из клубней картофеля.

Стадия очистки Суммарный Специфическая Степень Выход белок, мг активность. очистки % мкмоль/мин.мг

I.Гомогенизация, фракционирование сульфатом аммония, диализ

400

1,74

100

2.Хрома тография 58,5 на гидроксиапа -

тите

3.Хроматография 2,16 На ОЕАЕ-Тоуореаг!

10,6

141

6,1

13,3

89,1

43,7

4.1ая гах: нопо.р 0.41

5.2ая ррьс мопо р 0,21

357# 237 #

2,51

21 7,1

,1 Меаду стадиями з,4 и 5'произошло уменьшение активности фермента з процессе диализа и при хранении.

Очистка фермента до гомогенного состояния была достигнута после двухкратного хроматофокусирования методом грьс на колонке иопо-р в градиенте рн (5,9-4,0). Активные фракции выходили при рн 4,5, соответствующем изоэлектрической точке фермента. Молекулярный вес 5-лшюксигеназы из клубней картофеля, определенный с по;.юяьп зпз - форезэ, составляет 94 ооо.

Получен гомогенпнй препарат фермента со специфической ак-

тивностью, значительно превышающей известную из литературы [1,2]*. Гомогенные препараты 5-лщюксигеназы' сохраняют активность в течение месяца при -70°с.

2^РЕГУЛЯЩЯ АКТИВНОСТИ 5-ЛЖЮКСИГЕНАЗЫ под действием

ТЩШАТУРи.

А^_Термошактивация_картофельной_5-:™

Исследование кинетики термической инактивации фермента показало, что процесс описывается кинетическими уравнениями первого порядка и характеризуется энергией активации 26,4 ± 1,з ккал/моль (но ± б kj/моль), предзкспоненциальный множитель равен о,52 ± о,оз мин-1. Из сравнения этой величины с известными параметрами для 5-лшгоксигеназы из лейкоцитов и is-липоксигеназц из сои следует, что растительная 5-липоксигеназа по термостаОильности занимает промежуточное положение между животной и соевой липоксигеназами [з,4]*.

окислеш!я_лшолеата_и_а2ахиадната_по2_

Получены экспериментальные данные по температурной зависимости скоростей образования первого и второго продуктов 5-лшюкси-геназной трансформации арахидоната. Первая реакция, реакция окси-

генирования, протекает путем встраивания молекулы кислорода в

* - - ~ • ■ ■ — *" -

1. Shimizu т., Radmark О., Samuelsson В. Enzyme with dual lipoxy genase activities catalyzes leukotriene A4 synthesis from arachi ■ donic acid // Proc.Natl.Acad.Sci USA. - 1984. - V.ai.- P.689-693,

2. Mullier E., Leblanc J.-P., Gererd J.-J., Rigaud M., Chottard J.-C. 5-L.ipoxygenase from potato tubers. Improved purification and physicochemical characteristics // Biochim. Biophys. Acta.

- 1987.- V.916. - P.13-23.

3. Rouzer C.A., Sainuelsson B. On the nature of the 5-lipoxygena-se reaction in human leukocytes: enzyme purification and requirement for multipla stimulatory factors // proc.Natl.Acad.Sci USA. - 1985. - V. 82. - P. 6040-6044.

4. Sekija J., Aoshima H., Kajiwara Т., Togo T. and Hatanaka A. Purification and some properties of potato tuber lipoxygenase and detection of linoleic acid radical in the enzyme reaction// Agric.Biol.Chem. - 1977,- V.41, No.5. - P.827-832.

активированный на ферменте по 5-ому положению субстрат. Взаимодействие арахидоната в фэрме активированного радикального интер -медиата с кислородом приводит к образованию 5 - гидропероксиэйко-эатетраеноата. Энергия активации первой стадии , определенная в интервале температур, где сохраняется линейность в координатах Аррениуса, составляет 5,2 ± 0,7 ккал/моль, т.е. близка к энергии активации диффузионных процессов. На основании этих данных были разработаны рекомендации по низкотемпературному биосинтезу оксикислот.

5-липоксигеназа катализирует также дегидратацию 5-нрете путем стереоспецифяческого отщепления атома водорода в положении с-ю параллельно с миграцией радикала и элиминированием он -фрагмента у 5-гидроперокси-группы. Реакция образования эпоксида - лейкотриена а4 - более чувствительна к температуре, нежели первая стадия реакции, и температурная зависимость скорости накопления второго продукта при действии 5-липоксигеназы на арахидонат характеризуется энергией активации 16,о ± о,з ккал/моль, откуда следует, что температура играет существенную регуляторную роль в накоплении двух последовательных продуктов окисления арахидоната.

Типичная кривая накопления продукта имеет вид, представленный на рисунке 1, и характеризуется наличием лаг-перида и квази -стационарного участка, дальнейший ход кинетической кривой описывает затухание процесса вследствие инактивации фермента. Реакция возобновляется при добавлении свежей порции фермента, но не инициируется добавлением новой порции субстрата.

Исследование 5-липоксигеназы позволяет отметить следующие характерные моменты кинетического поведения данного фермента. Наиболее детально было изучено окисление двух альтернативных субстратов 5-липоксигеназн - арахидоновой и линолевой кислот, хотя было такие показано, что фермент катализирует окисление и эйкоза-пентаеновой кислоты. Реакция ферментативного оксигенирования линолевой кислоты протекает с большей скоростью, чем арахидоновой (рис.1). В то же время скорость инактивации 5-липоксигеназн в реакции окисления арахидоновой кислоты намного выше, чем линолевой кислоты (на вкладке к рис.1).

Рис.1.Нинетвческие кривые накопления э-НРСШЕ (А) и 5-НРЕТЕ (В).

(9-НРОРЕ) - 9-гидроперокси--октадека-10-транс-1г~цис-диеноеат; (5-ИРЕТЕ) - (5Э)-транс-гидроперокси-6-хранс-8,11,14-цис-зйкозатетраеновая кислота.

Лаг-перид наиболее ярко выражен в реакции со свекеочищенными препаратам субстрата в реакционной смеси и полностью исчезает при добавлении небольшого количества продукта. Следует также отметить, что лаг-период уменьшается при увеличении концентрации фермента з-дшоксигеназы и, напротив, резко увеличивается при добавлении яероксидазы, катализирующей реакцию трансформации гидро-пероксипродукта в оксипроиэводное и сникающей.таким образом концентрацию продукта в реакционной смеси.

Экспериментально были получены зависимости начальной скорости реакции от концентраций лишлеата и арахвдоната, имеющие з-образшй вид (рис.2а, 2в). Концентрационная зависимость обнару-зила четко выраженный кооперативный характер, с коэффициентом Хилла, равным 2.17+0.12 для линолеата и 2.1110.05 для арахидоната, которые определяли б двойных логарифмических координатах ввиду неопределенности Кооперативный характер зависимости сохра-

нялся в присутствии неионного детергента луброла рх (рис.за, зв>, причем коэффициент Хилла практически не зависел от концентрации детергента ж был равен 1.91 ± 0.02 в присутствии о,ооз% и 2,05 % 0,02 в присутствии 0,01% луброла для лшолевой кислоты и 2.05 1 о,о4 з присутствии 0.005% и 2.01 ± о.оз в присутствии 0.01% луброла для арахидоновой кислоты, соответственно. Независимость коэффициента Хилла от концентрации детергента в растворе

Рис.2. Злвхсияость начальной аБахидоната (А) и линолеата (В)

А

т . зоо ио <00

скорости С*р*ентат*вного ошслекхя от хонцвктрацхи су6стра!Л.

'/«.шмь/мин-иг

у

/

гч

гоо

В

/

. 50 <00

«ршдоютм КИССОТА, Г«Ц

50 <00 ■ <50

лшевм кислота, мкп

Рис .3. Завнсикоеть начальной арахидоната (А) и линолеата присуетеик О.ОС5 (1) и 0.01 %

скорости ферхентаткшого окисл*шг. (В) от концентрации субстрата в ЬиЬго! РХ.

В \

КО 200 300

АрДШДСНОИ» КИСЛОГД, гхМ

V«, нма1ь/«ий иг

400

т

200

11)0

0 -

4«о гоо чоо

^нолевдя всюТА, МП

Рис .4. Звидасияость начальной скорости в«риентативхого охяс-лекхя линолеаой кислоты от концентрации субстрата а присуст-гии 5 ихМ арахидоната.

V», «пол/пи» иг

о го чо го »о (оо

ЛИНМРШ КИС/ОГА, Н«М

исключает гипотезу о кооперативном эффекте объемной и. поверх .-ностной концентрации субстрата в реакциях с 5-липоксигеназной картофельных клубней.

Вид концентрационной зависимости меняется, если в инкубационную смесь, содержащую в качестве субстрата линолевую кислоту, добавить арахидоновую кислоту в количествах, не позволяющих заметить образование продукта в отсутствие линолеата. При этом исчезает кооперативный характер концентрационной зависимости и данные линеаризуются в координатах Лайнуивера-Берка (рис.4) что позволяет определить 55,7 ± 5,1 мки.

Использование в реакции одновременно двух альтернативных субстратов обнаруживает еще ряд интересных моментов. В определенном диапазоне концентраций субстратов наблюдается активация ферментативного процесса, состоящая в том, что скорость в присутствии двух субстратов больше сукш скоростей с индивидуальными субстратами. Параллельно с увеличением скорости реакции происходит увеличение скорости инактивационных процессов (рис.5). Эти факты указывают на наличие механизмов взаимного влияния субстратов либо их продуктов в процессе катализа.

Рис .5 .Кинетические кривне ' Окисления сиеси ар&хидоко— вой (АЛ) и лкмолевой (1А) кислот• [ЬА]-25 кхН. [АА] -О (О), 25 (•), 37,5 (А) и 50 (и) икМ.

InV (нксдь/мин мг)

¿ргмя.мин

А. ЩКГ'ИЧБСКАЯ МОДЕЛЬ ДЕЙСТВИЙ Ь^ШОКСЩШЗЫ. ИЗ

КЛУбНЕИ КАРТОФЕЛЯ. . îîa основании экспериментальных данных, демонстрирувдих 1 ) ро.кь продукта п качестве активатора ферментативной реакции ;

2) "коуауюся" коопоратшюсть, которая снимается в определенных условиях;

3) Езатаодействш субстратов при одновременном добавлении к

ферменту:

4) четкую корреляцию скоростей реакции и инактивации -- нами ^редлокена кинетическая модель действия 5-липоксигепазы, как фермента с двумя центрами связывания, актив прущегося продуктами реакции и претерпевающего инактивацию в процессе реакции.

Кинетическая схема действия 5-липоксигеназы из клуСней картофеля.

И

1'

д1+1

•ЕРР

n ЕР

Л

—EPS

ESS«

1в

¡1

О)

—-

Рассматриваемая модель (схема 1) предполагает- наличие в молекуле фермента двух одинаковых мест, с которыми могут связываться и субстрат, и' продукт. Процесс активации фермента Е заключается в присоединении одной молекулы продукта к одному из центров связывания на ферменте. Предполагается, что центры взаимодействуют между собой, и после связывания молекулы продукта фермент способен с повышенной айляностью связывать субстрат.

Образование тройного комплекса EPS благоприятствует каталитической трансформации субстрата S. В фермект-продукт-субстратном комплексе происходит активация субстрата, например, пу'1-ем стере.оспецифического' отщепления атома еодорода с образованием радикального антермедаата Y1; далее происходит включение молекулы кислорода, причем аеиду стадией активации субстрата и стадией образования продукта Р в ферментном комплексе существует ряд промежуточных переходных состояний, которые обозначены V,, 72, ...Yj. Для учета иньктиеавди фермента в процессе реакции предусмотрена возможность ипактипацин каждс-й проые-ауточной формы Yi с константой скорости первого порядка Xj.

Продукт Р из кокглекса ер? диссоциирует с константой Kg. и на этом каталитический оксигеназныЯ цикл заканчивается.

При образовании ксмплексг между свободаоЗ форютП фермента и субстратом образуется каталитически неактивный комплекс S3 а, роз

Y

-мокно. ess при этом проявляется иигибируадее действие субстрата.

В условиях совместного присуствия дчух альтернативных субстратов каталитически активными являются тройные комплексы фермент- субстрат-продукт (sep или let, а также смешанные комплексы lep и sed), которые осуществляют конверсию субстратов в продукты в результате превращений через ряд промежуточных форм Y1 . ..Yj.

Анализ кинетической модели, представленной на схеме 1, проведен с учетом следующих допущений.

1. Образование с диссоциация комплексов фермента с s, L, Р и D является процессом существенно более быстрым, чем остальные стадии реакции, поэтому эти комплексы, совместно со свободной формой фермента Е, находятся в состоянии быстрого равновесия.

2. В реакции устанавливается стационарное состояние по отношению ко всем промежуточным формам фермента, за исключением необратимо инактивированпых (Y*).

3. Процессы необратимой инактивации являются существенно более медленными, чем процессы каталитических взаимопревращений, поэтому инактивация не наменяет соотношения между концентрациями промежуточных форм фермента, а только уменьшает общую концентрацию активных форм фермента.

4. Превращения в циклах Y1t Y2, ... Yj являются необратимыми:

Из математическбго анализа схемы могут быть получены алгебраические выражения, описывающие скорость ферментативной реакции.

V -

"ТВJ [SJ JL -V 4P] • <1)

dtP] "i [Е1о КГ

« 1 +

1+ Е-

Tq-+ TÇ -ft?]+ "W "içr

"57

i "1+1J Л1 где (Е]0-начальная концентрация фермента.

Б."КАЖУЩАЯСЯ КООПЕРАТГОНОСТЬ В РЕАКЦИЯХ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ОКСИГЕ -НИРОВАНИЯ ЛИНОЛЕВОИ И АРАХИДОНОВОИ КИСЛОТ 5-ЛШ0КСИГЕНА30И ИЗ ЩБНЕК^КАРТОФЕЛЯ. Скорость накопления продуктов оксигеназной реакции описыва ется уравнением 1. При начальной концентрации продукта Сje30= const начальная квазистационарная скорость реакции описывается функцией вида:

d[P] _ A IS]

~5Т ~ SТИТЛ''

г 1 1 1 1 Кр

с Ч1- «г? — — + -К- ТР1 '

1 1«н г з 1 'о

"1^0 Кр [Р)о ща А=—-3 -1+—-

т.е. тлеет место гиперболическая зависимость с коэффициентом Хил-да, равным 1. В соответствии с предложенной кинетической схемой концентрационная зависимость начальной скорости реакции от концентрации субстрата при постояшой начальной концентрации продукта не долгсна принимать э-образный вид. Зависимость начальной скорости реакции от концентрации субстрата принимает з-эбразный характер. когда начальная концентрация продукта пропорциональна концентращш субстрата. При этом проявляете? кооперативный характер совместного действия субстрата и продукта. Действительно, замена [р] в уравнении (1) на г [э] приводит к следующему выражение для начальной скорости реакции :

Ш г Ш

v

1+

^ * 1Г 1 р (3)

1+а 2 — 1 1 «1.!

Ш 7 ш+г 1§1+1£1 +у ш

1 р р з 2

которое в некотором диапазоне параметров линеаризуется з

координатах Я- - В этих условиях наблюдаемая зависимость

о [й]

начальной скорости реакции от концентрации субстрата подчиняется уравнению Хилла с коэффициентом г.

Расчеты, проведенные по уравнению (1), показал?, что в диапазоне концентраций г вблизи к , теоретическая зависимость начальной скорости реакции от концентрации субстрата описывается уравнением Хилла с коэффициентом э.

Активация фермента з присутствии двух альтернативных: субстратов возможна при наличии двух центров связывания на ферменте, в предположении об образовании новых смешанных интер'лздлатоз в реакции в присутствии двух субстратов. При исследоззнии каталитического оксигенирования линолевой (ь> к арахкдонозой ;'з) кислот четко обнаружился различный характер их взаимодействия »-ли-поксигеназой из картофельных клубней. Анализ кинетических данных, приведенных на рис 4 позволяет заключать, чте яерэксид зрзхидс-ната 5-нрете (р) обладает большей аффинностью связкьгния с ферментом. чем продукт окисления .тинолевой кислоте з-н?ссе (э) г процесс каталитического стереоспеци8ического оксигенирования ливо-

леата характеризуется большим числом оборотов фермента. Активация может быть обусловлена тем, что соотношение каталитических констант и констант связывания в смешанном комплексе l с ер (ьер) лучше, чем в комплексе l с ed (led).

Сравнение концентрационных зависимостей начальной скорости окисления арахидоната и константы инактивации фермента в процессе реакции показывает,что величина константы инактивации коррелирует с величиной начальной скорости (рис.б). Аналогичный эффект параллельного увеличения константы инктивации фермента в процессе реакции с ростом начальной скорости реакции наблюдается в случае одновременного щшсуствия двух субстратов (рис 5).

Математический анализ предложенной схемы приводит к уравнениям,; полностью соответствующим полученным зависимостям, т.е. в рамках предложенной кинетической схемы скорость накопления инактивированных форм фермента пропорциональна скорости окисления субстратов.

dt

(4)

£ в ¥

1 "1+1

Для рассматривавши модели отношение у^х (где у0- начальная скорость реакции, з а-наблюдаемая константа инактивации) не зависит от концентрации субстрата и продукта, а определяется только начальной концентрацией фермента и кинетическими константами. Это говорит в пользу того, что ферментные комплексы, находящиеся в состоянии быстрого' равновесия, не подвергаются инактивации, соизмеримой с инактивацией у-форм.

Рис.6.' Зависимость константы kin -1 МИН

инактивации фермента а про-

мессе реакции от концент- !,5

рации арахидоновой кислоты.

г

<.5 /ГЧ

1 / *

0,5 У

и

25 50 75 <00 <25

/рищокозм кю№, тН

аз

Механизм активации липоксигеназ гидропероксикислотами включает аллостерическое связывание гидропероксипроизводного с одним из центров связывания на ферменте. Такой механизм активации чувствителен к присутствию в среде фермента, снижающего концентрацию гидропероксикислот за счет конверсии в оксшшслоты. Перок-сидаза влияет на липоксигеназное окисление, действуя на пороговый уровень гидропероксикислоты и изменяя лаг-период, а также на стационарную скорость реакции окисления субстрата.

Кинетические кривые накопления продуктов липоксигеназной реакции в зависимости от концентрации пероксидазы в растворе меняют свою форму таким образом, что с увеличением концентрации пероксидазы растет лаг-период реакции и снижается стационарная скорость (РИС.7).

Рис.7. Зависимость скорости накопления продуктов окисления линолеата (А) и арахидонпта (В) (1) и лаг - периода .".ипокскгеиаг-ной реакции (2) от концентрации пероксидазы.

у ° нмоак/ЬИН

01 ОД 0,1

пероксиЗгнь, мг/мл

Т, пин

0

У л

0,2 0,3

пераксийа5л, !^.г/мд

Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата, имеющая кооперативный характер для 5-липоксигеназы из клубней картофеля, в присутствии пероксидазы меняет свой вид (рис.8), 9.МОСЩТЕЗ 5-ГИДРОКСИЭЖОЗАТЕТРАЕНОВОИ КИСЛОТЫ.

Использование 5-липоксигеназы из клубней картофеля для получения продуктов ферментативной трансформации полиненасыщенных

жирных кислот является важной прикладной задачей данного исследования.

Рис,0.Зависимость скорости

В результате проделанной работы были отработаны услови: биосинтеза 53-гидоокси-б-гаранс-8,11,14-1;ие- эйкозатетраеновой кислоты, отработаны условия хроматографического анализа к разделения липоксигеназных метаболитов арахвдоновой кислоты и были синтезированы препаративные количества 5-неге (до imt).

Существующая цена вещества 5Б-тдрокси-б-транс-а,и,14-цис-эйкозатетраеновой кислоты по каталогу фирмы sigma составляет 96$ за ол мг,

1.Выделена, очищена до гомогенного состояния и охарактеризована 5-липоксигеназа из клубней картофеля.

2.Исследована регуляция активности 5-липоксигеназы под действие?»} температуры.

3.Впервые получены данные по кинетическому механизму ферментативного катализа 5-липоксигеназой из клубней картофеля.

4.Предложена кинетическая модель действия фермента с двумя

накопления продуктов липокси-геназиой реакции от концентрации субстрата. Концентрация порокспдаэы (1) - 0, (2) -0,02 мг/мл, (3) - 0,06 мг/мл.

дрлхздиоеля кюкщгкМ

вывода.

центрами связывания для субстрата и продукта позволяющая объяснить все имеющиеся экспериментальные и литературные данные, 5.разработаны условия биосинтеза 5(з)-гидрокси-б-транс-8,11,14-цис- эйкозатетраеновой кислоты, хроматографического анализа и разделения липоксигеназных метаболитов арахидоновой кислоты и проведен синтез препаративных количеств 5-нете.

Основное содержание диссертации отражено в следующих пуОли кациях :

l.Sudyina G.F., Lagutina I.О., Mevkh А.Т. and Varfoloineev S.D. Biosynthesis of leucotrienes by leucocyte reaction of bovine blood. // Symposium on "Synthesis and research of prostaglandins". Abstracts. Tallin. 1986.- October 20-23. P. 75.

2. Sudyina G. and Lagutina I. 5-lipoxygenase of potato tubers : Unusial dependence of the rate of the reaction on temperature. // Symposium on "Chemical physics of enzyme catalysis".Program and Abstracts. Tallin. 1987.- September 21-24. P. 136.

3. Лагутина И.О., Судьияа Г.Ф.,Варфоломеев С.Д. "Кажущаяся кооперативность з катализируемом 5-липоксигеназой картофеля окислении линолеата и арахидоната." // Тезисы докладов iv Всесоюзной конференции. Минск 1989.- 11-12 октября, с. 112..

4. Лагутина И.О., Судьина Г.Ф., Варфоломеев С.Д. "Регуляция активности 5-лшюксигеназы из клубней картофеля под действием температуры." // БИОХИМИЯ. 1990. - Т. 55. N 4. С. 705-711.