Кинетические закономерности ферментативного синтеза моно-, ди-, и тригидроксипроизводных арахидоновой кислоты тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

Б ОД. московским государственный "университет

имени М.В. ЛОМОНОСОВА

. химическии факультет УДК 577.152.I . На правах рукописи

МИРЗОЕВА Ольга Константшовна

КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНОГО СИНТЕЗА MOHO-, ДИ-, И ТРИГИДР0КСИПР0ИЗВ0ДНЫХ АРАХИДОНОВОИ КИСЛОТЫ

02.00.15 химическая кинетика и катализ

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1994

Работа выполнена в секторе . биокинетики . Института Физико-Химической Биологии им. А.Н. Белозерского и на кафедре химической энзимологии Химического факультета МГУ им. 'М.В.Ломоносова .

Научные руководители: доктор химических наук, профессор С.Д. Варфоломеев кандидат химических наук, с.н.с Г.Ф. Судьина

Официальные оппоненты: доктор химических наук, в.н.с Е.С. Чухрай доктор химических наук, в.н.с. В,.П. Шевченко

^Ведущая организация: Институт Канцерогенеза Онкологического научного центра РАМН

Защита состоится „ " £ " года ~

в ~ -ft часов на заседании специализированного совета Д.053.05.76 по химическим наукам при Химическом факультете МГУ по адресу: 119899, .ГСП, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический, факультет, кафедра химической энзимологйи, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан " " 1994 года

Ученый секретарь совета, кандидат химических наук "/ '■' О.А. Кост

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние десятилетия особое место биохимии липидов занимает исследование метаболизма полиненасы-энных высших жирных кислот, в частности арахидоновой кислоты, родуктами этого метаболизма являются новые низкомолекулярные лорегуляторы, вещества с чрезвычайно высокой биологической хтивностью: лростагландины, гидроксикислоты, лейкотриены, липо-;ины, объединенные общим названием зйкозаноиды. Особое внимание ривлекли лшоксиш, недавно открытые полиоксигенированные произ-эдные арахидоновой 'кислоты, биологическое действие которых эвершенно отличается от действия остальных эйкозаноидов. Липок-дны стимулируют генерацию супероксиданиона в нейтрофилах челове-а,- активируют протеинкиназу С, ингибируют клеточную активность атуральных клеток-киллеров (Ж), обладают спазмогенной активнос-ью, стимулируют образование простациклина клетками эндотелия.

Широкий спектр биологического действия эйкозаноидов обуслов-квает актуальность исследований' процессов окисления полиеновых ислот, ферментов, участвующих в этих процессах, а также направ-знного воздействия на образование и биологические• эффекты йкозаноидов. Исследование физико-химических и кинетических войств ферментов синтеза эйкозаноидов - липоксигеназ (ьо) вляется важным для понимания механизма' регуляции патологических роцессов в организме. Огромное значение для выяснения каталити-еского механизма действия липоксигеназ, а также для разработки иотехнологического получения эйкозаноидов имеют работы с -фермен- -ами из растительных источников, в частности 5-ьо злаков и 15-ьо ои, которые в силу большей доступности пригодны к широкомасштаб-_ ому практическому использованию.

Цель работы. Целью работы является изучение кинетических акономерностей биосинтеза липоксигенззных метаболитов арахидо-овой кислоты - моногидроксикислот и липоксинов, а также некоторое путей активации и ингибирования липоксигеназ.

Научная новизна работы. К настоящему времени идентифицирован яд липоксигеназ из растительных и животных источников, получены иохимические характеристики этих ферментов, исследованы пути иосинтеза различных эйкозаноидов, в т.ч. липоксинов. В данной аботе впервые получена в лиофилизованном виде 5-лшоксигеназа из

ячменя, выяснены некоторые особенности кинетического поведе данного фермента. Предложен препаративный путь биосинтеза мс гидроксиэйкозатетраеиовых кислот и липоксшов с использоваь растительных лкпоксигеяаз. Синтезирован и впервые охарактеразс как антиоксидантный липоксигеназный ингибитор один из компоне! прополиса - фенэтиловый эфир кофейной кислоты, впервые пол} новый липоксигеназнкй ингибитор - ы,ы'-дициклогексил-о-{3,4-гидроксициннамоил) изомочевина, исследован механизм действия < веществ.

Практическая значимость. Разработанные оптимальные услс биосинтеза моногидроксикислот и липоксинов и методика' их дете! могут быть использованы в лабораторных условиях. Предложении работе "механизм ингибирования - липоксигеназ производным кофе! кислоты, ^активным компонентом прополиса, вносит вклад в пониме действия ряда лекарственных препаратов. Моногидроксикислс полученные в данной работе, переданы в Институт педаатрш детской хирургии МЗ России н в НИИ Медицинской радиологии Армении для медико-биологических исследований.

45Ш0§Ция_работа. Результаты работы были дологены на Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимология", ■ Москва, 1991г; на Международном симпозиуме "Modern enzymoiogy, Prot: and Trends", Санкт-Петербург, июнь 1992г;. на .22й Мендунаро; конференции febs, Стокгольм, июль 1993; на курсах ] "Biomembrans and Signal Transduction", Утрехт, февраль 1994; I Международной Конференции "Prostaglandins-and Related Corapounc Флоренция, июнь 1994.; на Международном симпозиуме по биоа липидов, Санкт-Петербург, октябрь 1994.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы з ста: 5 тезисов, 1 статья принята в печать.

Объем_работы. .Диссертация состоит из введения, oö; литературы (8 разделов), описания материалов и мето, результатов и их обсуждения (5 разделов), выводов и cm цитируемой литературы (158 наименований). Работа излокена не страницах машинописного текста, включает 21 рисуиок и э таблш

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Литературный обзор.

В обзоре литературы первая часть отведена описанию ключ!

зрментов синтеза-липоксинов и других зйкозаноидов - липоксигена-. зм, изложены известные на сегодняшний день данные о каталитичес-зм механизме действия этих ферментов. Далее обсуждаются пути юсинтеза и биологическое действие основных продуктов липоксиге-эзных реакций - моно- и дагидроксикислот, лейкотриенов, липокси-зв. Последняя глава посвящена обзору липоксигеназных ингибито-)в, различающихся как по химической структуре, так и по механиз-1 ингибирукщего действия.

Методическая часть.

В главе "Материалы и Методы" приведены методики "выделения, шстки, определения активности и исследования кинетического дей-гвия 15-липоксигеназы сои и 5-липоксигеназы ячменя. Описаны разиньте способы биосинтеза лшоксинов, с участием липоксигеназ как з растительных, так и из животных источников (нейтрофилов, лей-)Цитов, тромбоцитов). Приведена методика определения количества 5разующихся липоксигеназных метаболитов с помощью обращенно-ззовой высокоэффективной .жидкостной хроматографии. (ВЭЖХ) с де-;кцией по УФ поглощению и по радиоактивности. В данной главе зкже описано измерение скорости образования активных форм кисло-)да методом люминол-усиленной хемилюминесценцш при исследовании шяния_ липоксигеназных ингибиторов на респираторный взрыв в ней-юфилах человека.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ Поиск оптимальных источников 5- и 15- липоксигеназ.

Поскольку наиболее доступными для препаративного биотехноло-гческогЬ пути получения липойсинов являются растительные фермен-I,. было начатб исследование способов выделения,' очистки и лиофй-1зации 15-липоксигеназы сои и 5-липоксигеназы злаков. После фобования различных сортов сои был выбран сорт "Лучезарная", >держащий наиболее активную 15-лшюксигеназу, которая была выде-¡на, очищена, получена в лиофилизованном виде и использована в' ¡боте для синтеза is-hete (15-гидроксизйкозатетраеновой кислоты) липоксинов. Помимо этого, препарат полученной нами 15-ьо был ¡редан в Институт Молекулярной Генетики для разработки биотехно-»гического синтеза [3h]-i5(S)hete, необходимой для медико-юлогических исследований.

Фермейт 5-липоксигеназа ячменя^ впервые выделенный только в

1391г, остается практически неизученным. Нам удалось после очист ки повысить специфическую активность почти в юо раз и получит Фермент в лиоФилизовашом виде (шел).

а о

5 10 15 20 25 30 35 40. 45

-номер фракции

5 10 15 20 25

номер фракции

Рис. 1. Хроматограмма очистки 5-липоксигеназы ячменя: (1) - очистка грубого экстракта на колонке с СМ-целлюлозой (26 120 мм), уравновешенной 0.-07 М натрий-ацетатным буфером рН 4.8 Элюцию вели со скоростью 2 мл/мин с линейным градиентом 0.07 0.7 М ацетата натрия; (2) - очистка активного препарата после СМ целлюлозы на колонке с ДЕАЕ-сефарозой (16 х 200 мм), уравновешен ной 20 мМ натрий-фосфатным буфером рН 6.8 с линейным градиента NaCl 0-0.3 М.

Полиакриламидный гель-электрофорез с додецил сульфато: натрия показал достаточно высокую степень очистки полученных нам препаратов is-lo сои (приблизительная молек. масса 90 кДа) и s-l< ячменя (приблизительная молек. масса 63 кДа). Положение практи чески единственной полосы 5-липоксигеназы полностью соответствуе1 положению полосы инактивированной формы этого фермента на элек трофореграмме, опубликованной в работе ван Арля [van Aarie p.g.m

et al. // FEBS. 1991. V. 280. P.159-162].

Кинетические кривые накопления продуктов окисления линолево: и арахидоновой кислот под действием 5-липоксигеназы ячмен. (рис.2) похожи друг на друга, однако реакция ферментативное оксигенирования линолевой |Кислоты протекает с большей скоростью чем с арахидоновой кислотой. Ферлент шактиЕируется в процесс* реакции как с одним, так и с другим субстратом. Обработку полу

[енных кинетических кривых осуществляли путем построения графиков ¡ависимости логарифма текущей скорости реакции (V) от времени >е акции,

Р,

1Т. ел.

Я)

0.075

0.050

0.025 -

т Я

,я а" в а 7 ' а Гг

Г о у' _ в а т

и' * *

в.

: V V

V1

Л V-

0.000 о

а

эпт. ед. 0.15

0.10

0.05

время, мин

(2)

10

время, мин

15

чп

т

0.00«*

О 2

4 & 3

время, мин

4 6 8

время, мин

Рис.2 Типичные кинетические кривые взаимодействия 5-ьа ячменя с

арахидоновой (1), и линолевой кислотой (2). (а) - накопление продукта во времени, (б) - зависимость .логарифма текущей скорости реакции от времени. Условия: реакционная среда- 50 мМ натрий-фосфатный буфер рн 6.8, (1)-(•) 5, IV) ю, (V) 15, (О) 25, (•) 50 МКМ арахидоновой КИСЛОТЫ, С^ =2380 нг/мл; (2) - ( • } 5, (С)

10, (▼) 20, (О ) 30 МКМ линолевой КИСЛОТЫ, С-Ц =170 нг/мл.

-10

V

Исследование кинетики лшюксигеназного окисления

^ • в присутствии "двух субстратов

■ Исследование кинетики действия фермента в смеси нескольких . субстратов является одним из подходов к характеристике его специфичности и определению количества активных центров с целью выяснения механизма катализа данным ферментом.

Равенство коэффициентов^экстинкции для 5-нрете и 9-нроое дает возможность осуществлять детекцию суммарной -концентрации продуктов лшюксигеназного окисления в случае совместного, присутствия арахидоновой и линолевой кислоты в _реакционной смеси. Эксперименты по совместному окислению двух, субстратов под действием 5-лидоксигеназы представлены на рис.за. Данные выражены в - виде зависимости отношения скорости реакции с двумя субстратами к сумме скоростей реакций с каждым субстратом отдельно (у^/БитУ) от концентрации арахидоновой кислоты при различных концентрациях линолевой кислоты. Использование в реакции одновременно _двух •альтернативных субстратов обнаружило ряд интересных моментов. Е определенном диапазоне концентраций субстратов (5-ю мкЫ линолевой и ю-50 мкЫ арахидоновой кислоты) наблюдалась активация ферментативного процесса, состоящая в том, что скорость накопления продуктов в присутствии двух субстратов была больше суммы скоростей с индивидуальными субстратами (У23/зитУ > 1). При дальнейше!-увеличении концентраций обоих субстратов наблюдается обратньй эффект - ингибирование суммарной скорости ферментативной реакцш

(У25/ЗитУ < 1).

Сравнение кинетического поведения 5-ьо ячменя и 15-ьо сои I 2х-субстратной реакции показало, что эти два фермента ведут себз абсолютно по-разному. При катализе соевой 15-липоксигеназо! эффекта активации не наблюдалось, отношение У23/зитУ было близкс к единице (рис.зб).

Основываясь на полученных данных по активации можно предположить, что 5-1,0 имеет два центра связывания субстрата и продукта, и что в катализе 5-лишксигеназой образуется промежуточны: тройной комплекс, который в присутствии двух субстратов моне быть гетерогенным и более активным.

2.5 2.0

1.0

n n i—

""о

• - 5 MXM LA •v - ID МКМ LA. T - 15 MKM LA." D - SO нк!г] LA-'

□ . ?

20 40

SO 100 120

IAA], MKM

IAA) , MKH

tc. 3. Кинетика действия (a)- 5-lo ячменя, (6)- is-lo сои в [учае совместного окисления арахидоновой и линолевой кислот. 1Висимость отношения скорости реакции с двумя субстратами к ■мме скоростей реакций с каждым субстратом отдельно (v2S/sumv)

• концентрации арахидоновой кислоты- при различных концентрациях нолевой кислоты.

Исследование различных путей биосинтеза липоксинов.

Существует несколько путей, позволяющих пройти все стадии шоксигеназного окисления арахидоновой кислоты, вплоть до ¡поксинов, это либо действие уникальной липоксигеназы с широкой бстратной специфичностью - i5-lo,~ либо действие нескольких локсигеназ.

• 5™?б§_^Ш9КС1Шов_по2_5ействием_1 __сои

В. результате- длительных инкубаций фермента с арахидоновой :слотой образуется сложная смесь различных продуктов окисления йхидоновой кислоты - от моно-HETEs до три-HETEs (рис. 4*). Все и продукты имеют четко различающиеся физико-химические характе-:стики. Moho-hete имеют спектр поглощения е максимумом--на 235, -HETE В зависимости ОТ структуры на 242 И 279 нм, а Три-НЕТЕ вют абсолютно характерный спектр с максимумом на З01 и плечами 287 и 316 нм, благодаря наличию в молекуле тетраеновой руктуры (рис. 4B).

В реакции образуется несколько изомеров липоксинов, которые зделяются ВЭЖХ. Процедура экстракции, восстановления трифенил-сфином и хроматографии полученных продуктов биосинтеза позволя-. выделить липоксины группы айв (рис.ча), которые после сбора повторной хроматографии разделяются каждый на два пика ис.46). Основываясь на результатах хроматографического поведе-

.0

1.5

irí-HETES d¡-METIS NETEs

235 нм

20

20 мин

0.150

ISO 300

jso

0.500

300

^JrtUMQ tanHbl, MM

г. п. IIIJJKX Ii оПрнщонпоп фпзо продуктов инкубация прахидоиоиой кислоты с 15-л1шоксигсиазой па колопио С18 Zorbax 5 мкм Г>ох<1,0 мм) и гпадиоптпом режиме от 30 до 100% пцотоиптрнла с 0,1%-поп уксусной кислотой, рП 5,0. Липоксииопмо пики помочены .....,„ д п. / _ „minimum xwmiiTornmbiin лшюксшюпых фракций Л (I) и И (II) на колонко 018 ЛНох 5 мкм (250X4,0 мм) n nao-

ния и спектрального анализа (рис.4В), пики 1 и з на хроматограм мах РИС. 4 б. соответствуют 14(3) ,14(К)-8Е(а11-Е)-ЬХВ4 И 6(Б),6(11)-11Е(а11-Е) - ЬХА4 изомерам, ПИКИ 2 И 4 - липоксину В4 и липоксину а4, соответственно.

2). Конверсия. арахщоновой_шслота_в_липоксины различными типами

клеток_крови.

Сравнение количества липоксинов, образующихся при использовании в качестве источника ферментативной активности клеток крови, указывает на то, что межклеточная кооперация различных типов клетокь содержащих разные липоксигеназы, резко увеличивает выход тригидрокситетраеновых метаболитов арахидоновой кислоты (рис.5). Что интересно, эндогенный . синтез преобладает над экзогенным в присутствии значительных количеств добавленного в инкубационную среду арахидоната - 50 мкМ (рис.6). По-видимому, в концентрированной суспензии клеток, где присутствуют и нейтрофилы, и тромбоциты, количество освобождаемого клетками арахидоната может быть довольно велико.

2

500

250

75-НЕТЕ+ Тромбоциты* Тромбоциты* нейтродины лейкоциты гранулоциты

Рис.5. Сравнение суммарного выхода липоксинов а4 и в4 в суспензиях с различным составом. (1) Инкубация 15-нете с полиморфноядер-ными лейкоцитами. Синтез стимулировали добавлением 5 мкм кальциевого ионофора а23187 и юо мкм 15-нете. (2) Инкубация арахидоновой кислоты со смешанной суспензией тромбоцитов и гранулоцитов. Синтез стимулировали добавлением 5 мкм кальциевого ионофора А23187 и 50 мкм арахидоновой кислоты. (3) Инкубация арахидоновой кислоты со смешанной суспензией тромбоцитов и лейкоцитов, полученных совместным осаждением из крови. Синтез стимулировали добавлением 5 мкм кальциевого ионофора А23187 и 50 мкм арахидоновой кислоты. Длительность всех инкубаций - зо мин при 37 с. Выход липоксинов снормирован на количество клеток, полученных из 2о мл крови.. Сумму липоксинов определяли ВЭЖХ в обращенной фазе.

а

Рис.б. ВЭЖХ в осЗращенной фазе продуктов инкубации (37°с, зо мин) арахидоновой кислоты со смешанной суспензией тромбоцитов и гранулоцитов при стимуляции 5 МКМ кальциевым ионофором А23187 и 50 мкм арахидоновой кислотой, с добавлением 4 мкс! 14с-арахидоновой кислоты. Хроматографию вели в градиентном режиме от зо% эцетонитрила до юо% ацетонитрила с о.-1% уксусной кислотой, рн 5_.б. Детектировали по УФ-поглощению-на 301 нм (а) и по радиоактивности (б). Липоксиновые пики помечены буквами айв.

0 ■ 20 мин

Подбор оптимальных условий, биосинтеза липоксинов.

Лшоксины, полученные из животных клеток, идентичны липокси-нам, полученным с применением растительных ферментов. Биотехнологическое значение мржет иметь метод биосинтеза липоксинов с использованием растительных липоксигеназ. Поэтому мы занялись оптимизацией синтеза липоксинов с помощью соевой 15-1,0, а также разработкой метода синтеза липоксинов в двух-ферментной системе, с использованием выделенных нами 5- и 15-липоксигеназ.

Из литературы и из данных, полученных в нашей лаборатории.с 5-ьо картофеля, известно, что реакция образования моно-гидроксипроизводных идет практически с одинаковой скоростью прк низких (0-4°С) и высоких (20-30°С) температурах, т.е. имеет низкую энергию активации. Дальнейшее окисление и трансформаци? промежуточных пероксидов заметны только при повышению температурах, т.е. реакция образования липоксинов включав1: стадии, совершенно по-разному зависящие от температуры.

• Нами были получены экспериментальные данные по синтез} липоксинов, когда через 2 часа инкубации при низкой температуре после максимального накопления 15-нрете, мы следили за образова-

шеи липоксинов после повышения температуры до комнатной. Процесс Зиосинтеза липоксинов чувствителен к изменению целого ряда усло-зий^инкубации: концентрации, фермента,. субстрата, длительности спсубации (рис.7 (а,б,в)), рН среда.

2.5 2.0 1.5 1.0

0.5

0.0

-1-Г—-1-1- ---Т- а

- -

- ■

» 1 1

600 МКГ/МЛ

мкМ

1.5 2 2.5 з время, часы '

Рис. 7. Зависимость выхода липоксинов при окислении арахидоновой кислоты соевой 15-лшюксигеназой: (а) от концентрации фермента в инкубационной смеси, (б) от концентрации субстрата - арахидоновой кислоты, (в) от длительности, инкубации при комнатной температуре после 2-х часовой инкубации на льду. Выход определяли как степень превращения субстрата в липоксины.

Исследование синтеза липоксинов в одноферментной системе с 15-липоксигеназой сои при различных рН обнаружило тот факт, что смещение величины рН в более кислую область приводит к существенному увеличению количества лшоксинов (рис.8а). Т. о., при рН не оптимальном для синтеза моно- нетеб, синтез три-нетеб идет с большей эффективностью.

Далее, исследовались закономерности накопления шпдксшов в

я

двухферментной системе, с использованием 5-ьо и 15-и 5-липоксигеназу добавляли в реакционную смесь при рН, оптимальш для-образования 5-нрете, рН 6.8 - 7.2. Мы'обнаружили, что щ последовательном добавлении двух липоксигеназ, 5-ьо ячменя' 15-1.0 сои к арахидоновой кислоте образование липоксинов протекае с большей эффективностью, чем при действии толы 15-липоксигеназы (рис.8б) и позволяет повысить степень конвера арахидоновой кислоты в липоксины до 5%.

V . /о

400

300

250

' 200

150

а

Шк

рН=7.2 рН=7.6 рН=8.7 1 2 1-2

рН=7.2 рН = 6.8

Рис.. 8. (а) - Действие рН на образование липоксинов при окислени арахидоновой кислоты соевой 15-липоксигеназой. Выход липоксино выражен в % по отношению к выходу, полученному при рН=8.7. (б) - Образование липоксинов из арахидоновой. кислоты при действи 15-липоксигеназы сои (1) и при совместном действи 5-лшюксигенаэы ячменя и 15-липоксигеназы сои- (2). Результат; выражены как процент конверсии арахидоновой кислоты в липоксины.

Иссле5дващ1е_новщ_^дксетеназщх_щ;иб^ Учитывая тот факт, что продуктами липоксигеназной трансфор мации полиненасыщенных высших жирных кислот являются физиологиче ски активные вещества, нас интересовали не только пути активацн их синтеза, но и ингибирования, что актуально с медицинской точк зрения. Кроме того, исследование механизма ингибирования в ряд случаев помогает выяснению механизма ферментативной реакции.

■ Известно, что цитостатическая активность прополиса во много: связана с компонентом, являющимся по химической структуре фенэти-ЛОВЫМ Эфиром кофейной КИСЛОТЫ [СгипЪегдег v. е1 а1 /, Ехрег1епиа. 1988. V. 44. Р. 230-232]. БЫЛО Интересно ВЫЯСНИТЬ

является ли это природное вещество эф£екторои липоксигеназн. Дхя этой работы мы синтезировали и исследовали действнз двух производных кофейной кислоты (СА) по карбоксильной грушэ: фенэтилэзс-ГО Эфира (САРЕ) И n,n'- ДШИКЛОГеКСНЛ о- (3,4- дигидроксг-шшнамоил) изомочеЕННы (dchcu) .. Фенэтиловый э{ир ко}ейно2 кислс-ты, полученный нами, имел природную ирамс-конфигурацив, как z природное соединение, выделенное из прополиса.

Оба соединения, cape и dchcu, ингибировали образование оксг-генированных метаболитов линолевой и арахидоновой кг слот сод действием 5—и 15-лшгоксигеЕаз. Действуюсая концентрация ингибитогэ cape при взаимодействии с нейтрофилами человека- была сушественнэ нине, чем при взаимодействии с б-лшоксигеназой, выделенной~ Ез ячменя'(рис.9,lo). , 4

Рис.э. ВЭЖХ липоксигеназшгпродуктов, образующихся при стимуляции нейтрофи-лов человека (з.б х ю /мл) кальциевым ионофэром А23187 (s мкМ) в присутствии: (Б) 2 мкМ cape; (А) эквивалентного обьема (1мкл/1Ш1 инкубации) этанола (контроль). Ингибитор добавляли к клеткам за i мин до стимуляции ионофэром. Хроматографию продуктов осуществляли в градиентном режиме: о-зо мин -линейный градиент от 2о до 90% элюэнта В. Состав элюэнтоз: метанол/ вода/ трифторуксусная кислота/ триэтиламин в соотношении: А - 50/ 50/ ол/ 0.025, В - юо/ о/ ол/ 0.025. Детекцию вели от О ДО 23 МИН при 280 НМ, ДЗЛее при 235 нм. На хроматограмшэ указаны Бремена удерживания стандартов-, простагландина в2 (pgb2j, лейкотрзена в4 (Ltb4),

б-гранс-изомеров лейкотриенз в4,

ч-гвдрокси-лейкотриеза в4 (20-oh-ltb4)

и 5-гидроксиэйкозатетраеЕЗВОй кислоты (5-НЕТЕ).

Было тахзе обнаружено, что при ззаимохзйствиз с еэткзщ cape проявляет более высокую ингибирущую активность, чем кофейная кислота, - при том, что 2 мкМ САРЕ полеостыо ингибиругт CZEH-

тез лигоксигеназных метаболитов в нейтрофилах человека (рис.9), кофейная кислота в концентрации г мкМ практически не оказывает ингибируквдего действия (данные не приведены). Это связано,' по-вгдимому, с тем, что гидрофобные производные кофейной кислоты легче проникают через клеточную мембрану, чем кофейная кислота. Используя (сдектрофотометрический метод, мы исследовали кинетику действия производных кофейной кислоты на 5-lo ячменя. Инкубация cape и dchcu с 5-липоксигеназой приводила к быстрой потере ферментативной активности, - оба соединения проявляли сильное инги-бирувдее действие уже через i мин инкубации. Концентрационные зависимости■ падения остаточной ферментативной активности {%) при взаимодействии кофейной кислоты и ее производных с 5-ш (рис. 9) демонстрируют тип полного ингиСирования: зависимости линейны, и при больших концентрациях ингибиторов ферментативная активность уменьшается практически до нуля. Ингибируицая активность возрастает в ряду: са < dchcu < cape. Оба исследуемых соединения действуют обратимо - при разбавлении инкубационной смеси фермента с ингибиторами в ю раз активность фермента возвращалась к первоначальной.

Рис. ю. Зависимость процента остаточной ферментативной активности 5-липоксигеназы ячменя в- реакции с линолевой кислотой от концентраций ингибиторов са, cape и dchcu. Вещества в различных концентрациях прибавляли к ферменту за i минуту до инициирования реакции субстратом.

Механизм действия ингибиторов мы анализировали, используя графический метод, предложенный Иошино [Yoshino М. // Biochem. J.

1987. v. 248. р. 815-820) - построение ззвисимости скорости

реакции от концентрации ингибитора в координатах: v/(vo- v) от

[i], где v и vo - скорости реакции в присутствии и в отсутствие гисЗитора. соответственно (рис. и). . .

0.1 --fcaps]

0.2 1/мкМ

линалевая кислота, м*М с. 11. (а) зависимость скорости реакции s-lo ячменя с линолеЕой слотой от концентрации ингибитора cape в координатах Иошино: (vo~v) от [II при различных.концентрациях субстрата: (i)- 4о,

)- 50, (з-у- 75, (4)- 100 mkíí линолввой кислоты;

) .зависимость тангенса наклона прямых, приведенных на рис. а, от концентрации субстрата - линолевой кислоты.

В координатах Иошино мы получили пучок прямых, пересекающих-в начале координат, -с наклоном, уменьшающимся с увеличением нцентрации субстрата. Для реакции, протекающей по схеме хаэлиса-Ыентен, такой вид зависимости означает полное бесксн-рентное шгибирование, когда, ингибитор не способен связываться свободным ферментом, а только с фермент-субстратным комплек-и. Мы предложили следующую простейшую схему " взаимодействия разводных кофейной кислоты с липоксигеназой (Схема 1): фермент разует комплекс с субстратом, субстрат в тако*м комплексе оксидируется при взаимодействии с молекулой о, ингибитор могзт ^соединяться на любой стадии.

E

-»ES

Схема i.

Ki

к. 1

ET<-r^ESI

->esoo

Ki

-»esooi

P

На этой схеме e

"1 2 активная форма липоксигеназы, р - продукты

реакшш, к,, к„, к ' к ' к., к.', к." - константы диссоциации

1 \ 2. 1 4 л. * I А

фермент-лигандных комплексов, к и к - константы скорости распада •комплексов ебоои ебоох соответственно.

Уравнение для скорости реакции в соответствии с данной схемой мы выводили в предположении о быстро устанавливающихся равновесиях между ферментом и комлексами фермента с эффекторами.-

V {1+(К2/[02П (1+К1/[31)} (К^/[1]+к'/к)

(1+К^(К2/[02])(1/К^+(1/К.)(К1/[Б)))}-(к/к){1+(К2/[021)(1+Кг/

Учитывая вид экспериментальных данных в координатах Иошино -пучок прямых, проходящих через начало координат при- постоянно! концентрации кислорода, можно предположить, что в схеме 1, описывающей экспериментальные данные, к1=»>, к1 =о, к =о, что соответствует полному бесконкурентному механизму ингибирования (рис.11). С учетом упрощений угол наклона прямых описывается следующей функцией:

{1+([5]/к1)-и+[02]/к2)} Ъд а =-—-——;—К .

([Б]/к1)([02]/к2+к£ /К.

График зависимости tg а от концентрации субстрата (рис, иб), полученный на основании экспериментальных данных рис..на, ' позволяет оценить величину константы ингибирования к1 , принимая, 'что К1"=К1'. Для САРЕ к/'35 8 МКМ (РИС.116), ДЛЯ ОСНС1 (данные не показаны) к^'з н мкМ.

Построение экспериментальных данных в координатах Диксона (1/у от [I]) и Лайнуивера-Берка (1/у от 1/[Б]) (рис. 12) дает серию параллельных прямых как,для саре,_ так и для оснси, что также ' подтвервдает бесконкурентный механизм ингибирования.

Согласно обобщенному анализу, проведенному Вржещом П.В [Вржещ П.В. // Биохимия. 1988. Т. 53. С. 1704-1711], серия параллельных прямых в координатах 1/у от а/[в] реализуется' в том случае, если все взаимодействующие с ингибитором формы фермента несвязны по направлению реакции с пунктом ввода субстрата и форм; фермента, взаимодействующая с субстратом, не взаимодействует ' ингибитором. Две промежуточные формы фермента несвязны, если : механизме ферментативной реакции находится участок, соединявши эти формы и имеющий хотя^ бы одну необратимую стадию ферментативных взаимопревращений. Приложение этого анализа к эксперименталь

ffij.t данным, полученным в данной работе для 5-липоксигеназы ячме-1я, позволяет предположить, что в механизме, реакции, приведенной ta схеме I,. видимо^ присутствует. ере одна стадия - необратимое гревращение в активном тройном ферлент-субстратном комплексе. ;корее всего, необратимой является стадия?, следующая после присо-

¡динешя кислорода, esoo ---- esoo , приводящая фактически к

>бра2ованил комплекса, из которого отщепляется продукт. Используя shbo,i3 из анализа обобщенной кинетической .схемы, и с учетом вида зшетичееких кривых, полученных для ингибирования 5-липоксигеназы юд действием cape и dchcu, мы можем сделать вывод, что ингибитор ¡заимодействует именно с окисленной активированной формой зермент-субстратного комплекса и, по-видимому, стабилизирует свя->анный с ферментом гидропероксирадикал, препятствуя образования [родукта - гидропероксианцона.

>ис. 12. Зависимость скороди ферментативной реакции >т концентрации субстрата ¡ координатах Лайнуивера-Зерка в присутствии (•) i, ) Ю, (<г ) 15,. (а) Ю мкМ ингибитора cape.

10 15 20 25 X

1/s

Мы обнаружили способность cape и dchcu ингибировать реакции 1бразования активных форм кислорода как клетками (на примере рес-ирэторного взрыва в нейтрофилах), так и в бесклеточной фермента-■ивнсй системе"ксантин-ксантиноксидаза. Рис.13 иллюстрирует инги-¡иругсую активность производных кофейной кислоты при действии их ta лшинол-зависимув хемилюмиЕэсценцшо нейтрофилов, индуцированию добавлением стимула - 12-миристат-1з-ацетата форбола (рма> . 'ис.14 демонстрирует ингибируюшую активность cape и dchcu, а таксе nb-за и кофейной кислоты, при действии их на лшннол-усиленнув :емилшинесиенцию, сопряженную с образованием супероксидрэдикалоз i фер;.!ентативной системе ксантин- ксантиоксидаза . Ингибзрующая :поссбность в ферментативной системе возрастает в ряду: са <

dchcu < cape, что коррелирует с антилипоксигеназной активностью

перечисленных соединений

' "У'?-- , 60

в ы

S

=г а-

s 2

время, мин

Рис. 13. Действие cape и dchcu на люминол-усиленную хемилюминес-ценци^) рма-стимулированных нейтрофилов человека. Клетки (2хю /мл) стимулировали o.s нг/мл рма и через 2 минуты добавляли ю мкМ cape (кривая 2), dchcu (кривая з) или равный объем (6 мкл) этанола (кривая i).

г

■з i 03

о

80

60

НОС«.. 5 мкМ

OCHCU 5 мкМ СА. 30 мкМ САРЕ.БмкМ "

9 12 15

время, мин

18 21

24

Рис. 14. Действие cape, dchcu, са и ndga на люминол-усиленную хе-милшинесценцшо ферментативной системы ксантин - ксантиноксидзза. Спиртовой раствор ингибитора или з мкл этанола (контроль) добавляли за ю секунд до инициирования реакции ксантиноксидазой

(x0d).

Механизм полного бесконкурентного ингибироваЕия 5-липоксигеназы под действием, cape и dchcu сочетается с неспецифическими антиоксидантными свойствами этих соединений. Можно предположить, что ингибиторы с такими антиоксидантными свойствами связываются с активными прсмзБуточвыми ¡£ермент-лигандными комплексами, захватывая радикальные интермедиа ты. По механизму реакции, предложенному для 1-5-LO [Gardner H.W. // Biochim. Biophys. Acta. 1991. v. 1084. p. 221-239], такими интермедиатами, приводящими к гидропероксидным продуктам, являются пероксильные и пента-диенильные радикалы, связанные с ферментом. Основываясь на этом механизме, мы можем предположить, что антиоксидантные ингибиторы блокируют перенос электронов ыегду ионом зэлеза в активном центре фермента и активированной молекулой субстрата на ферменте и пре- ■ пятствуют восстановлению пероксильных радикальных комплексов до продукта •- пероксида жирной кислоты.

Т.о., полученные наш производные кофейной кислоты являются ингибиторами липоксигеназ с антиоксидантным характером действия. Антиоксидантная и- антилипоксзгеназная активность cape монет обусловливать противовоспалительное действие прополиса.

ВЫВОДЫ

1. Получены каталитические формы двух ферментов, 5-липоксигеназы ячменя и 15-липоксигеназы сои в виде лиофшшзованных препаратов, пригодных для биотехнологических целей.

2. С использованием полученных в работе 5-дипбк'сигеназы ячменя и 15-липоксигеназы сои синтезированы и выделены в хроматографически чистом виде:

5(3)-гидрокси-б-гранс-8, .11,14- цис-эйкозатетраеновая кислота (5-НЕТЕ), 153-гидрокси-5,8,11-цис-13-транс- эйкозатетраеновая кислота (15-HETE), 5s, 6r, 155-трзгидр0кси-7,9,13-ТрЭНС- 11-ЦИС-эйкозатетраеновая кислота (липоксш а4), 53,14к,153-тригидрокси-6,10,12-транс-8-цис-эйкозатетразновая кислота (липоксин з4), пригодных для исследования действия данных биологически активных соединений на организм человека.

3. Исследовано влияние рН среды на (биосинтез лшоксинов в одно-ферментной системе, с 15-липоксигеназой сои (рН оптимум 8.7), а также в двух-фермёнтной системе, в присутствии is-lo сои и 5-ш

ячменя (pH оптимум 6.8). Обнаружено, что снижение pH инкубаци ной смеси до. pH 6.8 при использовании is-липоксигеназы сои, . также комбинация двух ферментов _ приводит к увеличению вых' липоксинов на 80 - 100 %.

4. При исследовании кинетических закономерностей дейст 5-липоксигеназы ячменя обнаружено, что в области низких (5 -мкЫ) концентраций субстратов, линолевой и арахидоновой кисло скорость их окисления в смеси в 1.5 - 2 раза больше суммы скор тей окисления индивидуальных субстратов.

5. Обнаружено, что активный компонент прополиса, фенэтиловый si кофейной кислоты (cape), а также промежуточный продукт в синт этого эфира, n, 11'-дициклогексил-о-(з,4-диг:идрокси- циннамо: изомочевина (dchcu), являются ингибиторами 5- и 15-лшгоксигенг

6. Исследован механизм действия обнаруженных, ингибиторов на липоксигеназу ячменя. Показано, что оба соединения быстро и об; тимо ингибируют 5-липоксигеназу по бесконкурентному механизму.

7. Исследована физиологическая активность полученных произвол кофейной кислоты и обнаружено, что они ингибируют липоксигеназную активность в нейтрофилах человека. Показано, ' данные соединения подавляют респираторный взрыв в нейтрофп человека, а также генерацию супероксид-аниона в . бесклеточ ферментативной системе кса'нтин- ксантиноксидаза, что указывает антиоксидантные свойства полученных ингибиторов.

5£32ВШ§_Р§зультаты_|тссертацш_излдже

1. Судьина Г.Ф., Мирзоева O.K., Щукин И.А.,. Шевченко В.Е., Во; сова P.C., Мягкова Г.И., Варфоломеев С.Д. Липоксины: исследова:

__различных путей биосинтеза. //-Биохимия. 1991. Т.56. С.772-779

2. Mirzoeva -O.K., Sud'ina G.F., Shevchenko V.E.,' Schukin I.. Vorisova R.S., Myagkova G.I., Varfolomeev S.D." pH-Regulation lipoxin biosynthesis. // In: "Modern enzymology, Problems , Trends", Ed. by Xurganov V.l., Kochetkov S.M.-, Tishkov V.l. № Science Publisher. 1993.

3. Sud'ina, G.F., Mirzoeva,. O.K., Pushkareva, M.A., Korshunov, G.A., Surobatyan, N.V. and Varfolomeev, S.D. Caffeic ac: phenetyl ester as a lipoxygenase inhibitor with antioxidai properties. // FEBS Letters. 1993. V.329. P.21-24.

4. Судьина Г.Ф., Мирзоева O.K., Щукин И.А., Шевченко В.Е

• г

Борисова Р.С., Мягкова Г.И., Варфоломеев С.Д. Изучение путей биосинтеза липоксинов - группы медиаторов липидной природы. // Тезисы, .докладов vn Всесоюзного симпозиума . "Инженерная энзимология". 1991.. Москва. С. 74-75. ■ ■

5. Mirzoeva O.K., Sud'ina, G.F., Pushkareva, M.A., Sumbatyan N.V. and Korshunova G.A. The \ anti-lipoxigenase and anti-respiratory burst action of caffeic acid phenethyl ester known as cytostatic compound. Abstracts of the 22nd FEBS Meeting, p.205, Stockholm, 1993.

6. Sud'ina G.F., Mirzoeva O.K., Pushkareva M.A., Vrzheshch P.V. Activation of the 5-lipoxygenase in the presence of two alternative substrates. Abstr. of the 9th Int. Conference on Prostaglandins and Belated Compounds, p.65, Florence, 1994.

7. Shevchenko V.E.-, Shukiri~I.A., Mirzoeva O.K., Sud'ina G.F. pH -Regulation of lipoxins biosynthesis. Abstr. 9th Int. Conference on Prostaglandins and Related Compounds, p.71, Florence, 1994.

8. Mirzoeva O.K., Pushkareva M.A., Sud'ina G.F. Caffeic acid lipophilic derivatives as lipoxygenase- inhibitors with antioxidant properties. Abstr. of the 9th Int. Conference on Prostaglandins and Related Compounds, p.74, Florence, 1994.

Сщсок_использхемых_сокращений! * _ - lo - липоксигеназы, hete - гидроксиэйкозатетраеновая кислота, . Н-РЕТЕ- гидропёроксиэйкозатетраеновая кислота, . hpod- гидропероксиоктадекадиеновая кислота, ndga- нордигидрогваяретовая кислота