Клонирование и экспрессия кальцийсвязывающего белка -Р26 из фоторецепторов сетчатки быка тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ НЮОРГАНИЧЕСКОИ ХИМИИ raí. академиков М.М.ШЕМЯКИНА и Ю.А.ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

СУСЛОВ Олег Николаевич

КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ КАЛЬЦИЙСВЯЗЫВАИЦЕГО БЕЛКА - Р26 ИЗ ФОТОРЕЦЕПТОРОВ СЕТЧАТКИ БЫКА

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 19ЭЗ

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии наук

Научный руководитель - доктор химических наук',

профессор Н.Г.Абдулаев

Официальные оппонента:

доктор биологических наук - С.М. Деев кандидат биологических наук - Г.Р. Каламкаров .

Ведущая организация: Институт биофизики клетки РАН, г. Пущино, Московская область.

Защита диссертации состоится 1993г. в

10 часов на заседании специализированного совета Д 002.35.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биоорганической химии имени академиков М.Ы.Шеыякина и Ю.А. Овчинникова РАН по'- адресу: 117871, ГСП-7 Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической 'химии имени академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

1993г.

В.А.Несмеянов

Актуальность проблемы. Изучение молекулярных механизмов функционирования системы трансдукции светового сигнала в фоторэцепторных клетках сетчатки является одной из важнейших задач молекулярной биологии и биохимии.

В последнее десятилетие во многих лабораториях получены экспериментальные данные, вскрывающие молекулярные основы зрительного возбуждения. По мере понимания механизма передачи зрительного сигнала внимание обращается и на пути, которыми трансдукция модулируется. Зрительная система позвоночных работает в диапазоне освещенностей, перекрывающем 12 порядков. Частично эта способность обеспечивается механизмами адаптации на уровне фоторецепторов.- Существуют два основных проявления адаптации к повышению фоновой освещенности -десенситизация и выход из насыщения. Это дает возможность фоторецептору приспособить свою чувствительность в соответствие с интенсмзностью окрукающего освещения.

Считается, что процесс адаптации обеспечивается обратной связью посредством ионов кальция, концентрация которых в цитоплазме при освещении падает. Снижение внутриклеточной концентрации ионов кальция происходит в результате закрытия цШФ-зависимых каналов в плазматической мембране НСП и непрерывной работы Ш+/К+,Са2+-обмешшка. Накопленные данные показывают, что такое снижение концентрации кальция переключает механизм обратной связи щгацессов темнового восстановления и световой адаптации. Электрофизиологические и биохимические исследования показывают, что концентрация кальция влияет на гуанилатциклазу фоторецепторов таким образом, что при снижении' внутриклеточного уровня кальция

происходат увеличение синтеза цГМФ. Кроме того, кальциевой обратной связью, по-видимому, можно объяснить кинетику ответа при действии фона, а также отличие в быстродействии между палочками и колбочками.

Фосфодиэстераза цГМФ (ФДЭ) также чувствительна к внутриклеточной концентрации кальция. Было показано, что кальций в физиологических пределах' регулирует световую активацию ФДЭ сетчатки лягушки. Чувствительность и гуанилатциклазы, и ФДЭ к уровню кальция опосредуется .растворимыми белками с молекулярной массой 26 кДа, обнаруженными в сетчатках быка и лягушки.

Цель работы. Данная работа проводилась в рамках осуществляемых в ИБХ имени академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН комплексных структурно-функциональных исследований белков светочувствительных систем.

Целью настоящей работы являлось клонирование, dnpeделение первичной структуры кальцийсвязывавдего белка с молекулярной ■ массой 26 кДа из сетчатки быка (обозначаемый в дальнейшем как Р26), с последующей экспрессией.

Научная новизна и практическая ценность работы. Клонирована кДНК, кодирующая белок с молекулярной массой 26 кДа йз НСП сетчатки быка . После определения -первичной структуры -белка Р2б' и соответствующей кДНК были сосредоточены усилия на изучении структурных основ-функционировайия этого белка. Удалось экспрессировать в клетках Е.соК химерный белок, • состоящий из фрагмента белка А, последовательности, специфично расщепляемого энгвротаптидазой, и белка Р26.

Дубликации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи, результата исследований докладывались на VIII симпозиуме ФРГ-СССР "Химия пептидов и белков" (ФРГ, 1991).

Объем работы. Диссертация изложена на 9$ страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (/¿¿ссылок).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Введение

Ранее в лаборатории был выделен белок Р26 из наружных сегментов палочек сетчатки быка. Попытки секвенирования выделенного белка были безуспешны из-за того, что его Г^-конец оказался блокированным; как было показано, . Н-конец белка ацилирован меристиновой кислотой. Для фрагментации Р26 использовали его расщепление по остаткам метионина бромцианом и прстеолиз клострипаином.

Фрагменты бромцианового ращепления, а также пептиды после протволиза клострипаином очищали методом ВЗЖХ на колонках с обращенной фазой. В результате были определены полные и частичные аминокислотные последовательности восьми пептидов, содержащие в сумме около 60Ж голипептидаой цепи; все они подчеркнуты на рис.2. Некоторые из этих пептидов сложили

основой для синтеза олигодезоксирибонуклеотидных зондов.

2. Определение последовательности кДНК, кодирующей Р26, и ее структурный анализ.

Олигодезоксирйбонузуюотвды следующих последовательностей:

1. 5' -AACACCAAGTTCACCGAGGAGGAGCT-3'

2. 5*-CACCTCCCCGAGGACGAGAACACCCC-3*, соответствующие пептидам:

1. Asn-Ihr-Lys-Plie-Ihr-Glu-Glu-Glu-Ieu

2. His-Leu-Pro-GIu-Asp-Glu-Asn-Thr-Pro,

были синтезированы на основании частоты встречаемости кодонов в ^клонированных ранее кДНК нескольких известных белков НСП сетчатки быка и использовались в качестве гибридизационных зондов для скрининга библиотеки кДНК в бактериофаге A.ZAP.

Для идентификации рекомбинантных бактериофагов К был выбран наиболее часто применяемый метод гибридизации Iii situ фаговых бляшек (Benton, Davis, 1977).

Дня моноклонизации потенциальных позитивных клонов проводили несколько последовательных циклов гибридизации, выкол зоны агара с фагами, дающими положительный сигнал; элвдию фагов из агара, после чего запускали процедуру excision с целью конвертации вставки в плазмидный вектор' pBluescript, снятие реплик и их последукщущ гибридизацию с соответствующим зондом.

С целью получения общей информации «.о структуре вставок выделенную ДНК клонов подвергли гидролизу' эндонуклеазой рестрикции IcoR I. Фрагменты ДНЦ разделяли в 0.7S6 агарозном

геле и переносили на нитроцеллюлозный фильтр по методу Southern, для последующей гибридизации с олитодозоксирибо ~ нуклеотидными зондами, меченными с помощью С7~32Р]-АТР и полинуклеотидшшазы фага Т4.

Среда IxIO6 клонов библиотеки были найдены пять клонов, давшие положительный сигнал гибридизации. Три из них: pSKP26-2(~), pSKP26-4(-) и pSKP26-5(-) использовались для определения нуклеотидаых последовательностей клонированных вставок (рис. I).

Е

_I

300 П.О.-

рЕвиб-г(-)

pSKF26-4(~)

pSW26-5(-)

Рис Л. Локализация вставок из выделенных клонов на рестрйктной карте кДНК Р26 и стратегия определения нуклеотидной последовательности. Черным прямоугольником выделена кодирующая область. Стрелками под фрагментами кДНК показаны направления и протяженность секвестрования. В -Bgl II, Е - Eco RI, Н - Hind III, К - Крп I, N - Fcol, S - Srnl. ■

I и II обозначают положение нуклеотидаых зондов »использовдрных для скрининга библиотеки.

Опр&деление нуклеотидаой последовательности клонированных вставок кДНК проводили по модифицированному методу Ыаксама - Гилберта (Maxam, Gilbert, 1977) в твердофазном варианте, разработанному Чувпило и Кравченко (1984).

Стратегия. определения нуклеотидаой последовательности представлена на рис.1. После расщепления плазмидной ДНК соответствующей рестриктазой матка вводилась в рестриктные фраг-

ч?

менты при помощи соответствующего ta- PJdNTP и фрагмента Кле-нова ДКК-полимеразы I К.coli. Далее меченные по обоим концам фрагменты расщеплялись одной или несколькими подходящими рест-риктазами для получения гомогенно меченных укороченных фрагментов, которые после этого разделялись электрофорезом в 5-8% ПААГ.' Выделенные после элюции из ПААГ гомогенно меченные двухцепочечныэ фрагменты использовали для непосредственного определения их нуклеотидаой последовательности.

Результаты определения нуклеотидаой последовательности показали, что ни один из обнаруженных клонов не содержал полноразмерной кДНК Р26. Во вставках из первых двух клонов отсутствовали несколько пар 'оснований 5'-кодирующей последовательности, но эти вставки содержали всю остальную кодирующую последовательность вместе с 3'-нетранслируемой областью, включай сигнал полиаденилирования (ААТААА) и поли-(А)-последовательность через 17 пар оснований после этого сигнала. Напротив, в третьем клоне отсутствовало 90 пар оснований кодирующей области со стороны 3'-конца, но он содержал 61-пару оснований 5'-нетранслируемой области мРНК.

-71 gaccccattgctcccatccacccagcagtgatgacccggccgggcccacaccacctcaccc■ 62 atggggmcagcmgagtggggcoctgtccaaggagatcctggaggagctgcagctgaao' 1 mgnsksgais ksileebqbw

122 ACCAAGTTCACGGAGGAGGAGCCTGAGCTOCTGGTACCAGTCCTTCCTGAAGGAGTGCOCC £1 TKFTSE*BIi'S SWYQSFLKECP

182 AGTGGCCGGATCACCCGGOAGGAGTTOCAGACCAICTACTCCAAGTTCTTCCCCGAGGCC 41 S G Я I Г RQ.BPQTIYSKifFPBA

242 gaccccaaggcctatgcccagcacgtcttccgaagcttigatgccaacagcqatggcacc 61 dp к afyaqhvfrsfdanspgt

302 TIGGACTTCAAGGAGTATGTOATCGOCCTACACATGACOAGCGCaGGCAAGACCAACOAG 81 bDFKEYYIAIi H M IT S . A G -К T Ii Q

362 AAGOTGGAQTGGOOOMCTCCOTCTATeAaiGTGGATGGCAATßGGAOCATCAGCAAQAAC 101 f~K Ъ В W A F- 5 Ь Y D-YD G N G T I S К N

422 gaggtgctggagattgtcacggctatctrcaaaatgatcagccctgaggacacaaagcat 121 evleiytaUfk mispedtkh-

482 CTCCCAGAAGAOGAGAAOACTOCGGAAAAaOGAGOAGAGAAGATCTGGGGATTCTTTGGO 141 LPEDEHTPEKRAffKIWO PPG

542 AAGAAGGATGATGATAAACMACAGAGAAAGAAraOATCGAAGGGACGCTGGCCAA'PAAG 161 KKDDDKLTEKE-PIEGTLANK

602 GAAATTCTGCGAOTGATTCAATTCGAGCOrCAAAAAGTGAAGGAGAAACTGAAGGAAAAG 181 E Г L H Ь I Q F E P QfCVKEKLKEK

662 aaactctga

201 к L Ter tgtcaactgctcaggtctcctccctccccacccctctcaaataaac 717 acacttgtgcacgcatgtgcacgcacacaaacacacaccgcccccggggccgggagggcc 77V tccaacccacagcacattaaaccctcctgcacacctccc-tgccaaacggaagtgtcgita 837 agctattcaccaagtcccgcecactatactgcccgcctcccctccccccagcccgccagc 897 ccaggcctccgtaataattccaggattaggxcacaggagccctaaatataggtcactgga 957 gccctaaatatccccgcccecatgtaagcicctttgtggat tgttgggtaagcaggt tcc 1017 aataaatgcaagaggagccgggcaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 1058

Рис.2. Нуклеотидная и выведенная аминокислотная последовательности Р26 из сетчатки быка. Подчеркнуты последовательности, определенные методами белковой химии, а также сигнал полиаденилирования. Стрелками обозначены EF-последовательности (см. текст). Тег -сигнал терминации трансляции. Строчными буквами обояначены нетранслируемые 5'-.и З'-области кДНК Р26.

На рис.2 представлена нуклеотидаая последовательность кДНК Г26. Все полные и частичные аминокислотные последовательности, определенные анализом пептидов Р26, кодировались этой последовательностью кДНК в одной рамке считывания. Триплет ATG (62-64) является инициирующим кодовом, поскольку это первый ATG-кодон нуклеотидной цепи, следующий после нонсенс-кодона 5GA (32-34) в той же рамке считывания,что и долипептидная цепь Р25. За кодоном СТО (665-667), кодирующим остаток Leu, следует кодон терминации TGA (668-670).

3.Анализ аминокислотной'последовательности Р26.

Таким образом, аминокислотная последовательность Р26, соответствующая нуклеотидной последовательности кДНК, состоит из 202 аминокислотных остатков, что соответствует молекулярной массе 23,3 кДа.

Недавно, методами белковой химии была определена аминокислотная последовательность кальцийсвязыващего бежа, названного рековерином, из сетчатки быка . Результаты этой ¡заботы полностью совпадают с нашими данными по Р2б. Однако, данные по нуклеотидной последовательности соответствующей полноразмерной кДНК рековерина в этой работе не были приведены. Поэтому, проведенное нами клонирование кДНК белка Р26 было необходимо для дальнейших структурно-функциональных исследований этого белка и использованием методов генетической инженерии.

Р2С содержат три консенсусные кальцийсвязыващие последовательности (так называемые ЕР-последовательности; на рис.2 они выделены стрелками). Согласно известным критериям , каждая ЕР-последовательность включает в _ себя 29 аминокислотных остатков и составлена из двух а-спиралей, между ними находятся аминокислотные остатки, боковые группы которых участвуют в образовании координационных связей с лином кальция. Единственным отличием от консенсусной последовательности является дополнительный остаток цистеина в положении 39 первой ЕР-последовательности Р26. Неясно, служит ли этот дополнительный остаток цистеина для уменьшения кальций-связывающего потенциала первой ЕР-последовательности и обеспечения, таким образом, тонкой регуляции некоей неизвестной" » функции. В любом случае, этот остаток цистеина может в дальнейшем служить хорошим объектом для направленного мутагенеза.

После установления выведенной полной аминокислотной последовательности Р2б скрининг го банку белковых структур ГОРЙ-Р1Й показал, что большая степень гомологии Р26 наблюдается с визинином - кальцийсвязывающим белком, специфичным для кож'очек сетчатки цыплят и для шишковидной железы (так называемого "третьего глаза")(Рис.З).Принимая во-внимание светоза-висимое возрастание уровня экспрессии визинина в шшковидной железе и в культуре клеток шишковидной железы,- было предположено, что этот белок вовлечен в механизм фототрансдукции в колбочках и клетках шишковидной железы. Аминокислотные последовательности визинина (192 аминокислотных остатка) и Р26 гомологичны на 59%; наименьшая вариабельность наблюдается в

нн' siiOHDaAaAisa-vaaiH эга * * -,** * * * * ******

osi SHS.A'sto'KHa-Aai'isiVMais sia

w

0 S S £ и H 1 y I и A я а i a 1 рош-s

* * * * * * * * * * * * * *

0 M 2 X 0 y S £ и H ï V I A A я Я я a i зга

* * * * * * * * * * * * * *

OOl 1 H £ •я 0 s s £ a H 1 y I I A я н я a 1 SIA

CÏ

£ 0 a N Ы V a Я s H л A H D У А У я poui-s

* V' * * * * * * * * * * * * * ' * *

Л 0 a 'S M y a Я s H Я A H D У А У я d 'a эгя

* * * * * * * * * * * * * *

08 £ D a a N Л a Я s а Я A H H У А 0 0 а. Я SIA

* ZI

X s A I s Я Я 0 s poui-s

* * * *. *

V я Í Я Я я s A I £ D Я я D У £ I H 0 S 9ZÍ

* * * * * . * m * * *

09 s h d л â H 0 A I H Я Я Я a 0 h I а 0 a sia

n

1 я я Ь £ я и рош-s

* * *' * * *

i 0 а X 1 Я s Ö A » S S 1 я я Я £ я X

* * * * * * * * * * *

Ot S 0 Ö H t> Я D Я A M H s 1 я я я £ А H 1 SIA

Я 1 Ö 4 Я Я 1 I я H S 1 y D s H S Я 0 îl 9 Zd

* * * * * * * * * * * *

03 S у а 1 Я 0 1 л я H S 1 y S s H S N 0 jï sia

-ot-

У1Э Е V ь Е I I Т А. I Р к м I Р Е Е Е И ъ 0 140

* * * * * » * * * * * # *

Р2б Е У ь Е I Т Т А I •Р к и X Б Р Е В т к н

* * * * * * «

Б-шой к м I N А Е 9 X к н

15 16

УК Ь р Е Б Е N Б р а К Й А Я. К 1 У? А У р N 160

* * * * * » * * * * * * *

Р26 Ь р Е Е И Т Р Е К' А Е К I УТ й р р в

* * * * * * * ♦ * * * * * ♦

Б-той 1 р Е В Е N т Р Е к К I X У У р а

16 17

713 К Е N 0 к I А Е в Е р I Я V М К N Б 180

* ш * * * * * * *

Р26 К К Ъ Э к ь Т Е К Е р I Е в 3? Ь А N К

* * * * * * * * * *

5-той к к ъ т Е а Е р I 0 I У К

18 19

УК А I и В. . ь I а У Б р К к 192

* * * * * ■* *

Р26 -Е I ъ К ь I а р Е V 0 к У К- Е К Ь К Е К К Ь

* * <ш * * * * *

З-той Е I ъ Й ь X а У X р 0 к

19

Рис.3. Сравнение аминокислотных последовательностей Р26 из НСП сетчатки' быка, визинина из колбочек сетчатки цыплят и фрагментов Б-модулина из НСП сетчатки лягушки {II-19).

Не-

центральных частях (с 65 по 125 остаток) соответствующих полипептидных цепей.

Наивысшая степень гомологии Р26 наблюдается с S-модулином,' калыдийсвязнвахщим белком из НСП лягушки, в присутствии кальция (I цМ) повышающим эффективность активации фосфодиэстеразы.

Недавно была клонирована кДНК S-модулина, что позволило установить полную аминокислотную последовательность этого белка. Было установлено, что S-модулин на 80% гомологичен Р26 и на 60% визинину (на рис.3 приведены неполные данные).

Было бы интересно выяснить, являются ли S-модулин и Р26 регуляторами, соответственно, для ФДЭ и гуанилатциклазы, иди зке каждый из этих белков обладает регуляторным действием для обоих ферментов.

Кроме, того,сыворотка крови раковых больных с синдромом ретинопатии (CAR - .cancer-associated retinopathy) дает положительную иммунохимическую. кросс-роакцию с белком молекулярной массы 26 кДа из сетчатки человека . Сравнение аминокислотных последовательностей показывает, что CAR-антиген является тем же белком, что и Р26.

5. Экспрессия P2S в Е. coll.

Принимая во внимание все сказанное, изучение Р26 не-обходимо.для детального понимания основ зрительного процесса и аномалий сетчатки. Доступность кДНК Р2б открывает широ-

кие перспективы для детальных структурно-функциональных исследований этого белка с использованием методов генетической инженерии. В качестве первого шага в этом направлении мы экспрессировали Р26 в E.colt в виде химерного бежа (фрагмент белка А из St.aureus -Asp-Asp-Asp-Asp-bys- А1а-Р2б).

Преимуществами этой системы экспреосии являются легкость выделения экспрессированного химерного белка аффинной хрома -тографяей на IgG-сефарозе, специфичность отщепления Р2б энте-ропептидазой и простота дальнейшей очистки отщепленного Р26 повторной аф|!инной хроматографией, а также достаточно высо -кий выход экспрессированного белка Р26 для дальнейших иссле -дований .

Ранее было показано, что вектор, содержащий полную ко -дарующую последовательность белка А,может быть успешно ис -пользован для экспрессии различных белков и пептидов . Более того, синтетически модифицированный фрагмент, кодирующий .участок связывания IgG в белке А, был столь же эффективен, как и целый ген. Следует отметить, что этот синтетический фрагмент был подобран таким образом, что он содержал.сигнальную после -доватэльность, обеспечивающую секрецию гибридного белка; кроме того, была учтена частота "встречаемости кодонов у E.coZí.

• На основании этих принципов была сконструирована плазмида pUCL2 для экспрессии в E.colt . Для получения химеры фрагмента бежа А и белка Р26 из экспрессирукя№ векторной плазмиды 'püCL2 удаляли полилинкерный участок BamHI-StuI. Полноразмерную кодирующую область кДНК белка Р26 собирали из двух клонированных фрагментов. Плазмиду pSKP26-5(-) расщепляли по сайтам Ncol

и Bglll для образования 5'-концевого фрагмента кДНК. Ддя образования 3'-концевого фрагмента кДНК белка Р26 другую плазмнду, pSKP26-4(-), ббрабатывали эндонуклеазами рестрикции Bglll и Smal. Этот фрагмент после выделения дефосфорилировали бак -териальной щелочной фосфатазой , что позволило- при проведении конечной.реакции датирования избежать образования побочных продуктов.

Чтобы обеспечить соединение мезду сайтами BamHI и Ncol, а также для образования последовательности, кодирующей фрагмент Asp- Азр-Азр-Аэр-Ьуз, который специфически распознается энте -ро пептидазой и расцепляется по связи Lys-X, были синтезированы олигонуклеотидные линкеры:

51-GATCCGGACGACGACGACAAGGC-3'

3'-GCCTGCTGCTGCTGiTCCGGTAG-5'.

Сразу перед инициирующим кодоном Р26 был добавлен кодон аланина для сохранения как рамки считывания, так и Мсо1-сайта. Лигирование вектора BamHI-StuI, гетеродуплекса BamHI-Ncol и двух фрагментов кДНК Р26 с использованием Т4 ДНК-лигазы привело к получению плазмиды рЬ2Р2б, содержащей полноразмерную кДНК Р26 (рис. 4).

Для получения гибридного белка шшзмиду pt2P26 трансфер -мировали в E.coll (штамм Ш-I) и единичной колонией заражали 5мл среды LB с 50мкг/мл ампициллина и эту культуру наращивали в течение ночи гцж 37°С при интенсивной аэрации. Затем 50-100мкл ночной культуры переносили в 200мл среда ЬВ с 50мкг/мл ампициллина и при 37°С и интенсивной аэрации наращи -вали культуру до оптической плотности 0,8-1,0 при бООнм. Далее

нтйщ

i I Ecoll

тег Smol

Р25КДНК

Bgttt

Kpní.I

Рис.4. Конструирование экспрессирущей плазмидн, содержащей кДНК Р26: а - фрагмент Ват HI - Si и I удален из pUC . L2; б, в - фрагменты Neo I - Bgl II и Bgl II - Sma 1 выделены из pSKP26-5(-) и pSKF26-4(~) соответственно; г - вектор, два фрагмента и гетеродуплекс Ват HI - Neo I лигированы, что привело к образованию плэзмиды pL2P26.

добавляли индуктор Ьас-оперона - 1РТЙ - до концентрации 1мМоль и продолжали инкубацию культуры в тех же условиях в течение ночи. На следующий день культуру 3 часа инкубировали при 42-44°С для облегчения секреции гибридного белка в межклеточ -нов пространство. После этого клетки осаждали центрифугирова -нием, а оуперндтант. использовали для выделения гибридного белка, где, как и ожидалось, согласно электрофорезу в БШ-ПААГ, гибридный белок и был в основном представлен.

Как было указано выше, химерный белок был сконструирован таким образом, чтобы облегчить его очистку методом аффинной хроматографии на З^-сефарозе. БЙЗ-электрофорез показал, что другие белки не связываются с аффинной колонкой, и гибридный белок не нувдается в дальнейшей очистке (рис.5). При более высокой нагрузке на дорокку полиакриламидного геля монно наб -ждать слабо окрашиваемую полосу более высокой молекулярной массы (на рисунке не показано).Вероятнее всего, эта полоса принадлежит иммуноглобулинам с аффинной колонки, и она составляет не более .1-2% от химерного бежа. Согласно предварительным ' данным, около 5-ЮЗЬ экспрессированного гибридного белка остается в клетках Е.ооИ.

Химерный белок ,был подвергнут протеолиру энтеропептидазой по связи Ьуз-А1а в последовательности Азр-Азр-Аар-Азр-Ьув-АХа, примыкающей к К-концевой последовательности Р26 в химерном белке. Время протеолиза контролировали БШ-електрофорэ -зом ( рис.5 ). На рис. 5 ( дорожки 2 - 5 ) можно видеть постепенное исчезновение . химерного белка и ■ появление полос

фрйгмента белка А и Р26. Для окончательной очистки Р2б приме -нялась либо повторная аффинная хроматография на IgG-сефарозе, либо ионообменная хроматография на колонке Mono Q.

Р26

НСП о Ч 10 2Z

Шмерйыи. «2~5елок

_Знспрессиро-

' «я««»' «евге» tsSSSi-данный Р26

.^фрагмент белка. А

Рис.5.' ЗББ-электрофорэз, показнваювдй! образование Р26 при расщеплении экспрессированного ' химерного белка энтеропептидазой. Указано время протеолиза: 0, 4, 10 и 22 часа.

ЦеЛый ряд фактов свидетельствует о сходстве свойств экс -дрессированного и природного Р26. Во-первых, электрофорети -ческие подвижности природного и экспрессированного Р26 иден -тичны (рис. 6 В). Во-вторых, для обоих белков характерно сходное поведение при ионообменной хромэтографии на колонке Mono Q, что может свидетельствовать в пользу сходной конфор -мации обоих белков (рис. 6-А);

Д.

ж 0,05

0,02^

а. Б

[КСЬ],М 12 3 1

0.1

0,05

Рис. 6. Сравнение Р26 из.НСП и экспроссировашюго в Е. coll. Профиль ионообменной хроматографии на колонке с Mono Q в смеси равных количеств этих белке>1 (а); электрофоретические подвижности Р26 из НСП (1,3) и экспрессированного Р26 (2,4) (б). 1,2 - окрашивание кумасси R-£50; 3,4 - связывание 45Са2+ ("кальциевый" блот).

вслодствие этого не имеется необходимости специально ренатурировать энспрессированный Р26. В-третьих, десять шагов автоматической деградации по Эдману экспрессированного Р26 не выявили отличий от установленной аминокислотной пбследовательности природного Р2б, за исключением И-концевого остатка аланина, введенного в , адапторный пептид экспрессированного белка. _ Наконец, ■ авторадиография'' экспрессированного ?2б, перенесенного на нитроцеллюлозу, по -казала, что полоса, связывадаая 45Са2"ь, совпадает с таковой в случае природного Р26 (рис. 6.В).

Разработка эффективной э.кспрессирующей системы,продуци -рущей более 25 мг очищенного химерного белка на литр культуральной жидкости, делает в настоящее время возможными различные исследования Р2б и гомологичных белков. Ясно, что эти исследования могут прородиться в нескольких параллельных направлениях, таких как направленный мутагенез и последующая экспрессия мутантных генов, белок-белковые взаимодействия и т.д.

швода

1. В библиотеке кДНН A.ZAP обнаружено 5 клонов, кодирующих Р26 (рековерин), 3„из которых «¿¡пользовались для сборки полной структуры Р26.

2. Установлена полная нуклеотидная последовательность белка Р26 из НСП сетчатки быка.

3. На основе полученной структуры выведена аминокислотная последовательность белка Р26 и установлена полная идентичность бежа рековерину, 80%-ная гомология с S-модулином • -кальцийсвязывавдим белком из НСП лягушки и 59%-ная гомология с визинином - кальцийсвязывавдим белком из колбочек сетчатки цыплят.

4. кДНК Р26 встроена в экспрессируадий вектор рИСЬ2 и экспрессирована в виде химерного бежа, с последующим его расщеплением энтеропептидазой и получением экспрессирован ного Р26 со сходными свойствами такового с природным.

Основныв результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Abdulaev N.G., Kutuzov M.A., Staiukler В.Е., Sualov O.N.-, Dergachev A.E., Zung T. Photoreceptor protein P26. - Abstracts of the 8th symposium- (PRG-USSR) on Chemistry oi peptides and proteins, Aachen, FRG, 1991, p. 37".

2. KutuzoY M.A., Shmukler B.E., Suslov O.N., Dergachev A.E., Zargarov A.A. and Abdulaev N.G. P26 - calcium binding' protein from bovine retinal photoreceptor cells. - FEBS Letters,1991, v.293, N.1,2, p.21-24. •

3. Кутузов M.A., Шуклер Б.Е., Суслов O.H., Заргаров А. А., Абдул&ев Н.Г. P26 - кальцийсвязывающий белок фоторецепториых клетйк сетчатки быка: первичная структура и экспрессия в Е. coll. - Биоорганическая химия, 1992, т.18, N5, с.623-634.