Пероксидазы растений-механизм действия и белковая инженерия тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

о. n

J la ирамах рукописи

ГАЗАРЯН Иpíinív Георгиешт

ПЕPOÍCСИДЛЗЫ РАСТЕНИЙ - МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ И БЕЛКОВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

02,00.15 03,00,04

- химическая кинетика к катал»»

- (биохимия

Автореферат диссертации на соискание учениЛ степени доктора химических ШуК

Москва - 1996

Работа выполнена на кафедре химической анзтмяапт Химического факультета Московского госудастпешшго ушперсигста нм.М.В.Ломоноеова

Офнциалышс оппоненты:

доктор химических наук, профессор Метелица Д.II. диктор химических наук, лрпфееспр Савицкий Л.П. доктор химических наук, црофес««£> КючаткоР С.Н.

Ведут,;»« организация:

Кафедра биогсхнологни Московской Государственной Академии тонкой химической технологии

Зар'.ита диссертации состоится

на заседании диссертационного совета N Д.053.05.76 по

химическим наукам при Московском государственном университете им.М.В.Ломоносова по адресу Москва 119899, ГСН-З, Воробьевы горы, Химический факультет МГУ, ауд. 202 кафедры химической элзимологин.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ ни.М.В.Ломоносова.

Лвторсфс.р&т разослан " " ^МО^ЛЯ^ 1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

ОШЦЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЯЛ КОТЫ

Актуальность проблемы. Термин гем-содержащне нерокгндазы Уншяет ферменты, прнсутстиуюишс nu псех >ки»ых организмах 11 визирующие гстеролнтичсскос расщепление нерокелда водорода с чедующим окислением доиориых субстратов, в число которых входят .«i, органические молекулы и неорганические пошл. Пероксндазы гений, г'рибов и микроорганизмов выделяют в так называемое ерсемейстпо перокендаз растений,. представители которого являются осубъединичными белками с молекулярной массой полипептндной цепи |ядка 31-36 кД, образующей два домена с нековалентпо встроенным аду ними 1-емнном. Пероксидазы растений и грибоц (КФ 1.11.1.7) и ичие от мпкробналыгых ферментон глнкозилироиани, содержат два ia кальция и четыре дисульфидных связи а молекуле белка.

Интерес к гем-содержащнм нерокендаяам pacrcuiiñ, и число которых 'ЛИТ н широко используемая в аналитических целях перокендалл .урина, последнее десятилетие неизмеримо вырос. Гсм~содержн>цими хжеидазами занимается порядка 200 научных групп и академической уке и несколько крупных компании: фирма Amcrsham International pic елнкобритання) разработала и внедрила метод детекции ДПК-зондов и тител на основе реакции усиленной хеми люминесценции (люминол + бсграт-усилитель), катализируемой псроксидазон хрена; фирма Ыоvo ordîsk, Дания-США, И фирма Sun tor у, Япония, одновременно патентовали, клонировали и кристаллизовали вероксидазу гриба oprinüs cinereus/Arthromycès ramosas, отличающуюся высокой политической активностью по отношению к люминолу; фирма Unilever, еликобритання-Голландия, занимается изучением перокендаз чанного нега с целью усовершенствования процесса ггронзиодстна чая. 3 года аззд была, создана небольшая фирма ЕпгутЫ. inc., Коламбас, США, роизводящая термостабильнуи> перохендазу нэ coomjx ообон, применение оторой запатентовано в качестве биокатализатopa в среде испод.',их дствор1ггелеГ| для пронзнодства смол типа фс-нол-фор,ча.н>легидиых. Рост риктического интереса к перокемдаэам связан, ио-нервмх, с выделенном и.

характеристикой iionwx ферментом, перспективных для использование и аналитических, так и синтетических целях, н но-нторых, с успеха клопиромаиин генов и установлении кристаллической структуры иерокендал. Это уже сегодня лолноляет конструировать фер.мет ладанными сиойетками методом случайного мутагенеза, т.к. рацноиал подходы к решению подобной ладами lice еще отсутствуют'.

Фундаментальный аспект исследований связан с фнзиологнчс рпдыо нсртссидаз н разнишп растений и их иммунном ответе, которя сих нор не получила споет объяснения на молскулярно-генсгнчесю биохимическом уровне. Несмотря па значительный прогресс и ноиим механизма гетсролитическоп) расщепления пероксида водорода в акти центре гем-содержатнх пероксидаэ, вопросом вопросов остается жир субстратная специфичность ферментов по отношению к субстрату-долс нерокг.идазмон реакции, не имеюнсая не только физиологического, i структурного объяснения, а с другой стороны, высокая специфичное реакции окисления индолил-З-уксуснон кислоты молокулир кислородом

Самостоятельный научный интерес представляет разработка си гетсролоп1чноГ| экспрессии ггерокендаз растении, дающих возможн проводить исследования каталитического механизма мен направленного мутагенеза. При этом экспрессия пероксилаз растет К.coli прсдсталяст собой наиболее сложную задачу, поскольку 6 синтезируется » неактивной дегликознлировапнон ано([юр,ме. реактивация требует проведения рс^юлднига, который до сих по известном смысле является искусством.

Проводящиеся в мире исследования в большинстве случаев отли узкая направленность, что приводит к отсутствию целостней карт понимания закономерностей Иероксидазного катализа и тормозит реш как фундаментальных, так и прикладных задач.

Целью работы явилось установление взаимосвязи между структ; и каталитическими свойствами пероксидаэ на осноне применения Men стационарной н предстационарнон кинетики и белковой инжеш иероксидазы xpcifa. Работа планировалась как комплексное нсследова

чающее разработку ионых псточиикои ферменгон - наганных к тбпнантиых - и их сранингельиую характеристику в (к'епх реакциях -<сидазиой и окспдазной.

И рамках поставленной проблем,! било необходимо решить /ющие задачи:

1. Пронести скрининг природных источник«» и пыделигь поные пентиппые н научном и практическом отношении пероксидазы из тур клеток растений, трапсн.мшых растении и культур грибок.

2. Охарактеризовать физико-химические и каталитические снойстна IX ферментов и изучить их поведение в реакции совместного лення о-диамиаилина и ряда »фенолов с целью уяснения механизма трат-субстратнон активации.

3. Установить осноиные стадии механизма окисления гормона роста еннй (индОлнл-З-уксусиой кислоты) молекулярным кислородом под ;тиием пероксидаз растений! на основе использоиання пероксидаз с 1ИЧ1ГЫМН каталитическими свойстнамн и различных аиалогои н изиодних субстрата. ,

4. Разработать систему экспрессии рекомбнпаштгых (|юрм жецдазы хрена в Е.ссИ, пригодную для проведения работ по ранленному мутагенезу.

5. Получить точечные мутанты пероксидазы хрена н изучить их 5илыюсть и активность и лероксидазнон и оксидазноп реакциях. :нтифипировать аминокислотные' остатки, контролирующие связывание стратой.

Научная новизна. В результате ныполпсиия данной работы были ;<:лены три новых продуцента пероксидаз с ноными сиопстнамн - из 'минируемых клеток люцерны, трансгенного табака и баэидналыюго [ба РНеШпиз ¡дт'апиз, а также получен ряд важных и (¡рншшшшалмш >ых данных по механизму действия пероксидаз и влиянию структуры ивного центра на каталитические свойства фермента.

Применение вновь выделенных пероксидаз наряду с коммерческими шарагами пероксидаз хрена, сои и «рахиса дли изучения мех;ш:,эма ктрат-субстратнои активации (ускорение окисления гидрохинона н

пирогаллола при совместном окислении с о-днаннзиднном) . позв< убедительно продемонстрировать ферментативный характер наблюда аффекта. Сравнение субстратной специфичности ферментов ноли сделать вывод о существовании субстрат-связывающего центра небольших органических молекул типа фенола и гваякола, поск именно эти активности варьируют наиболее сильно в зависимости от нероксидаэы.

Разработана эффективная система экспрессии рекомбниаптных пероксидазы хрена u E.coli м их рефолднита из телец включе! выходом более 25% от общего белка аионероксидазы, что нрактичес порядок превышает выход методик, описанных в литературе. Вп покачаны отличия каталитических свойств нативной и рскомбнна пероксидазы хрена, проистекающие как из отсутствия глнкозилиро! так н вследствие несколько иной упаковки активного 1 рскомбииангпого (фермента, нрниодящей к падению абсолютных эиа удельной активности в окепдазиой реакции и по отношению к фен гваяколу к пероксидазнои реакции.

Результаты влияния мутаций Phe4t->His и Phel43-*G стабильность и активность фермента подтвердили предположен докализамш замещаемых аминокислотных остатков и о контролнру роли l'hc-tt н связывании ароматических субстратов. Прниицит важным явилось установление влияния мутаций на фолдииг акт! центра н киисгнку реконструкции аноформ. Обе мутации прив> разрушению гидрофобной полости, связывающей гемин, и вызвали ] надеине каталитической активности.

Оперные с помощью метода остановленной струи в анаэр условиях показано отсутствие реакции прямого восстало! нерокелдазы в ферроформу под действием иидолнл-З-уксусдай кнел также то, что 2-мстил-индолпл-З-уксусная кислота : субс! оксигсназной реакции не является. Таким образом, общеприия лкгературе мнение о механизме . инициирования реакцн нсснецнфнческом радикальном характере процесса являются ошибоч Действительный механизм реакции иключает образование' тр<

лекса фсрмеит-кнслород-оубсграт, при распаде которого обрадуется юксид-раднкал п комплекс фермент-радикал субстрата, способный к мнению кислорода и окислению » Соединение 11 пероксидазы. Таким юм, перокендазм растений ¡шляются нысокоспецпфпчными-смаламп. В совокупности с данными направленного мутагенеза можно толагагь сущсстнонашн» специфичного к структуре субстрата центра лвання индолил-З-уксусной кислоты в днеталыкш области активного тл в непосредственной близости от остатка ¡'licit.

Практическая Ценность работы. Проведенные исследования злили предложить три новых продуцента нерокендаз: продуктивность гуры клеток люцерны состанлист 20 мг гомогенного препарата (сидппы с 1 кг биомассы клеток; перокемдаэы гриба Phcllitiits rius - около 15 мг с 1 л культуральной среды; анионной нерокепдаэы ta - СО мг с 1 кг свежих листьев траисгенного табака.

Пероксндаза гриба P/ieïlitius igniuriia позволяет определять фенолы жней границей определения 0,1-1 мкМ и запатентована как реагент шалптичсских целей.

Анионная пероксндаза табака обладает ira порядок более высоко/! гпителыюстыо при хсмилюмимссцогпюй детекции но сравнению с ксидазой. хрена в усиленной хемиломписсцснцни при сравнимой ^стабильности, и следовательно, яяллетСя перспективным реагентом семнлюминесцентпого анализа.

Отлшпгтелт.ная особенность катали ических свойств пероксидазы ta - стабильность Соединения I и высокая реакционная способность 1ШС1ШЯ И, что протипополоясно'свойствам всех остальных известных «стаз. Использование этой новой пероксидазы вместе, с щионнымк ферментами тина пероксидазы хрена открывает новые ожности изучения сложных реакционных механизмом, таких, нмер, как изученная в данной работе окенгеназная реакция.

Один из важных ■ методических пыводов, имеющий практическую (мост!, для экспериментальной работы, состоит о обнаружении :ктов фотолиза, вызываемых ксеионовон лампой п установке быстрою фования в аппарате "остановленной струи". Исследования тем-

содержащих нероксидаз этим методом должны а обязательном »оря иронодип.ся в присутстшш УФ-фнльтра, помещенного между каме наблюдения н аппаратом быстрого сканирования, для устранс

Побо'ШЫХ ЭффеКТОН.

Ключеным моментом разработанной методики реактншн рекомбинантной нероксндазы хрена яиляется предотвращение окисле белка аиоиероксндазы молекулярным кислородом в процессе выделен» солюбплнзацпн телец шоночення. Разработанная методика имеет oöi значение и была с успехом применена для получения рскомбинаитной / записн.мон нероксндазы из телец нк.тючення Е.соИ.

Апробация работы. Результаты работы докладъшалнсь следующих Всесоюзных, Всероссийских и Международных снмпозну! (конгрессах и конференциях): Международная конференция но хнмн биотехнологии биологически активных природных веществ (Парна, 19i Люкс-ген симпозиум (Кембридж, 1989), 7' Международный Конгресс культурам клеток и тканей растений (Амстердам, 1990), VJJ и N Бсесою.тые симпозиумы по инженерной гшэнмолопш, . (Москва, 1S 1993), V Всероссийская конференция "Новые направления биотехнолог (Нунцию, 1992), Международный симпозиум по бпосенсорам (Мое»

1992), Международные конференции "Прогресс н применения техноло рекомбниантных ДНК" (США, 1990) и "Технология рекомбшшшт ДПК-11" (США, 1993), II и III Международные симпозиумы по биохш н физиологии нероксидаз растений (Люблин, 1990 и Эльсинор, 1993), Международная конференция по инженерной энзимологин (Франц

1993), / н 8 Между народные симознумы но бно- н хемнлюмниесцел! (Англия, НШ и 1991), Международная научная школа но бнссецсори материалам (Нунцию, 1991), Конгресс EUROÜIC II "Ионы мсталло: биологических системах" (Флоренция, 1994), Съезд Бнохнмнческ Общества Великобритании N0.653 (Брайтон, 1994), I Международ юкещание "Биотехнология и применение нероксидаз" (Пущино, 1995), Международна конференция по стимуляторам роста paciei (Миннеаполис, 1995). Международная конференция "йиокаталиэ-(Су.мтлк 1995'*.

Публикации. По матфнл.'ШМ днггертмнш опубликовано 50 гных работ, получено I ангорское снидетельстпо п дна положительных :ння на выдачу патента.

Объем и структура работы. Диссерглкионнам работа нредстан.чнег н рукопись из 9 глав, изложенную на 305 страницах машинописного та, нклгочаег 17 таблии, 91 рисунок, а также список цитируемой ратуры из 137 наименовании.

Основное содержание диссертационной работы изложено ниже.

В Литературном обзоре нронедено обощенпе последних данных (на |рь 1996 г.) но структуре, механизму действия и белкоион инженерии содержащих пёроксидаз сунерсемейстиа растении. В Глапс 1 яедепы классификация и кристаллические структуры цитохром С жеидазы дрожжей, аскорбатпсроксндазы растении, лнгшш- и А/п-) кс. ид аз из Р/шпегос'киЧс екгу искропит. В Главе 2 рассмотрен!.! естиующне системы экспрессии гсм-содержащлх нсроксидаз, что дает ложность сопоставить их эффективность с методом получения тмбинаитион пероксидазы хрена (III' I'), разработанным автором, ременные представления о мсхачи?м<; исроксидазиои реакции смотрены в Главах 3 и 4. Участие дист;>льных остатков 11Ь-52, Тгр-51, -48 цитохром' С пероксидазы й растеплении молекулы иероксида орода было предложена п 1980 г., и . с этого момента их роль должает уточняться методом направленного мутагенеза, не меняя тину и целом. Вопрос же о молекулярных детерминантах субстратной цифшшости гем-содержащих иершеендаз до енх пор открыт. В Главе 5 рпые проведен критический анализ накопленных в литературе данных окислению ипдолкл-3-уксуаюн кислоты ((ЛА) - мощного регулятора (цсссов роста у растений, окислительное декарбокенлиронание которой, рытое в 1955 г., рассматрннаетси как главная физиологическая икция перокендаз растений. Дне принципиально различные схемы были ¡дложени в литературе для огшеадия процесса:

I. Схема Какадзнма-Имацакн (1979)

1- +■ ROOII F.I -t- ROH (

1ГЛ + 1ЛЛ Iii I + IAA*+ С

£11 + 1ЛЛ + П+ ~> Е +• 1ЛЛ" + П20 С П. Схема Рикарда-Джоба (!97't)

Ii + 1ЛЛ -> 11г++ 1ЛЛ^ (4)

|г2+ + о2 (5)

i-lll + IAA -> + P + Il20 (6)

Uli! + 21ЛЛ -> 1К1...1ЛЛ] + 1ЛЛ" + il20 (7)

11:1... 1Л.Л) -» 1111 + IAA* (8)

1:11 + IAA -> IL.. IAA* + II20 (9)

I-... IAA* -«■ Oj-> Uli + lnd-Cll20 + C02 (10)

где 1АЛ'+ - катион радикал 1ЛЛ, 1АА*- пндо.чнл-раднкал, 1:, EI, Ell, El напиши» фермент н его Соединения I, И и III соответственно, I феррофермент, I1 - индол-З-альдегид, 1 nd-Ci ЬО - нндол-3-эпокснд, R01 н ROD - гипотетические органические гидронероксид н соответствую! ему спирт.

Реакции (1)-(6) широко используются в обзорной литературе механизму окисления 1ДА, а реакции (7)-(10) даже не упоминаются, х Рпкард н Джоб (1971) уверенно отстаивали ферментативный харак процесса, не снизанный с традиционным иерокендазным циклом (1 )-(3) пред ложи ли схемы превращуhih 1АА в ' индол-З-альдегид и предполагаемый интермедиа! окисления индол-3-эпоксид пепоередстве! в активном центре ПНР. Принципиальным вопросом, ждущим сво решения, стало инициирование реакции, которое mi в одной из схем Tfti не было доказано: образование исходного органического гндроперокси необходимого для протекания реакции (1), и/пли прямое воостановле] (¡н'ррпиерокендазы в феррофермент иод действием 1АА по реакции (4).

Единственной возможностью дать корректный ответ осгавал попытка нгъпжт исследования мггодом "остановленной струи" условиях, uiu-puwe предпринятая в настоящей работе.

S

Глапа С. Материалы к методы оннсынает совокупности шернмснгальных методой, использованных в работе, а также подробно вводит разработанные метод!,I получении препаратом шкивных рмситов: перокендазы из культуры Клеток люцерны, перокендазы нз. стьев трансгснного табака ЫкоНлпа перокендазы

шдпалыюго триба РЬеШппя 1цтагш$. Продуктивность культуры клеток >церш,1 составляет 20 мг гоь агашого препарата перокендазы с 1 кг омассы клеток; перокендазы гриба РксШпш гдтапиз - около 15 мг с \ культуралыюй среды; анионной перокендазы табака - 60 мг с 1 кг ежих листьев трансгснного табака Стадии очистки фермент«» включают шообмениую хроматографию, телъ-фнлы рацию, осаждение сульфатом [МОКНЯ.

Глава 7. Новые перокендазы н особенности их каталитических свойств

Один ИЗ ВОЗМОЖНЫХ ПОДХОДОВ ДЛЯ 11ЫЯ11ЛСИПЯ структурно-ункциональных ' .зависимостей . перокендазиого катализа состоит п тостаилеинк каталитических свойств пероксидаз различной структуры, то могут быть как нативинс пероютдэзы с изисстной первичной грукгуроц, так и мупиггные формы рдюй и тон же перокендазы.' 13 анной' работе были, выделены три ясные перокендазы - щелочная сроксидаза из культуры клеток люцерны, кислая нероксидаза грибон 'кЛдтагии и кислая нероксидаза табака, из которых известна только ерпичиая структура последней. Пероссндаза гриба Рклдтагм.! была ласснфпцирована как секрстируемпя лероксидаза растительного типа, т.к. ыла неактивна по отношению к зератровому спирту (т.е. не являлась ишштероксидазой) н соли двухвалентного марганца не влияли на ее ктншюстъ (т.е. не являлась Мя-запнсимон иерокендазои). Фнзнко-|(М1Р1ескпс характеристики натшшшх ферментов,.полученных впервые в датой работе, и коммерческих ферментов из корней хрена, соевых бобов [ культуры клеток арахиса представлены в Таблице 1.

, Перокендазы,. как правило,. характеризуются наличием "лучшего" ¡убстрата. Так, Для перокендазы люцерны, арахиса и сон это гваякол, для герокевдазы табака, хрена и гриба - ферроцнанид и ЛВТБ. Отличительное

свойство анионных пероксидаз - низкая активность но отношешп иодиду. Данные Таблицы 2 также демонстрируют преимущества белко катализаторов по сравнению с собственно ■шипом. Белковое окружение только улучшает каталитические свойства гемнпа па 5-6 порядков, н ' придает ему способность катализировать окисление гваякола и фоиилендиамина.

Таблица 1. Физико-химические характеристики пероксидаз нз различ! источников

Свойства Иероксидазы

гриба табакасон ара..,.са люцерны хр Fl1 TOP SP РЫР AAP 11

М.м.,кД 36 36 37 40 48

Содержание гсма,% 13 100 46 87 73 К

Удельная активность,

К/мг, но A11TS 160 4600 210 200 450 2С

Таблица 2. Субстратная специфичности пероксидаз и темниа перокекдазной реакции. Удельная активность но различным субстра; выражена в мкмоль/сек ва мкмоль гем-содержашего белка или mkmi гемнна (т.е. в сек'1).

Ферменты FP ТОР SBP HRP PNP AAP Гемин

pl 3,5 3,5 4,1 8,9 . 8,9 9.2

Удельная активность по

AliTS 550 t250 290 1680 150 .500 0,005

Гваякол 260 615 570 720 11U0 8150 0

Фсрроцианид калии 3510 6060 95 207Ö 290 980 0,17

Фенол 0- 34 990 G5 140 0,008

о-Диашктднн 140 820 11 620 29 410 0,015

О-Фенилендиамнн 0 230 190 1220 550 130 0

К1 27 12 14 320 10 100 0,01

Сокращения: PNP, ЛЛР, HRP, SOP н ТОР - цероксидазы растений: , арлхиса, люцерны, хрена, сон, табака, соответственно, FP - пероксидаза гриба l'/irHiims iguiarius. ■ .

Иороксцдала табака CTIIOIllCHiliO К ."IHJMilHO.T, . что

оказалась исключительно активной K03B0.iii.i0 проводить ее хемплюмннесценлц

<цию n оптимальных условиях (pli 9,0) «а уровне <0" М, т.е. с гшггельностью определения « 5 рал превышающую такопую для HUP акции усиленной хемилиминесценнни при оптимальных условиях (рЛ

Столь высокая каталитическая активность ТОР, по-видимому, ana с необычными свойствами окисленных соединенны фермента » пенни с другими пероксидазами. Л именно стабильное образование мнения 1 ТОР наблюдалось в интервале 3-300-кратного избытка жеида водорода, при этом Соединение 1 ТОР, имеющее характерный •ка зеленоватый оттенок, можно было хранить часами, даже сутками, i удивительный факт, принимая во внимание, что IIRP, реагируя с »молярным количеством пероксида,. дает смесь Соединений 1 и II апислМо ;от используемой концентрации фермента. Константа скорости poro порядка для взаимодействия ТОР с перокендом подорода была »оделена методом "остановленной струи" ir составила 6,3x10е M 'с-' (рН ), что в три раза меньше соответствующей константы для IIRP (2хН)7 'с').

Попытка получить спектр Соединения II ТОР при рП 4,5-5,0 «алась неудачной. Соединение I прямо превращалось и Соединение III и большом Избытке пероксида водорода. Соединение Ш было стабильно •сменив часа, как И для HRP. При рИ 7,:'¡ и 30-50-кратном избытке II2O2 [Ло возможно зарегистрировать спектр Соединения II с характерными ками на 527 и 557 ни и размытмм пиком Соре (410-412 пи), ' идетельствукэднм о, значите. 1ьном содержании в смеси"'Соединения I. тектр был нестабилен i» превращался в таковой для Соединения 1 в челне 1-2мин. Высокая реакционная способность Соединения П ТОР .•сколько /напоминает псроксидозу из Сор ri nus cincreus/Arlhromgces tmostis (CiP), для которой устойчивый спектр Соединения II удается (регистрировать лишь при рН 10. Следует отметить, что CiP также включительно активна, по отношению к дюмпнояу, обеспечивая такую же увствителыгость, как íIRP в реакции усиленной хемнлгомннесценцни, н ила запатентована как реагент для хемилюминесцептиого анализа. При «следовании реакции окисления люминола методом "остановленной труп" в реж!1Ме быстрого сканирования Соединение I; 'ГОР прекращалось

Рис. I. Модель ак-пшного центра

(u-poKrivuuu хрена.

His42

и напищий фермент бон промежуточного образования Соединения 11, чг возможно лишь в случае большей реакционной способности Соединения И чем Соединения I.

Таким образом, субстратная специфичность пероксидаз включает ] себя три составляющие - окислительно-восетаношггельные свойств: субстрата и окисленных соединении фермента, а также организации субстрат-свизывающего центра и молекуле нероксидази. Две последят яплнютея отражением структурных особенностей белка. Принимая вс внимание модельную структуру активного центра пероксидаз растеши (Pne.t), рядом с которым находится одни из наиболее вариабельных участков, формирующий субстрат--снязывающую полость, можно полагать, чю эга полость н каждом частном случае отличается немонго- ГЬс41 римым своеобразием, определяющим свойства фермента. И этой области у TOI1 находится остаток Glu-141, соответствующий Plw-t-О в 1ШР н, согласно моделям активного центра и данным направленного мутагенеза Cil1, контролирующий в .я од и акпшнын центр. Наличие отрицательного заряда может сгабилизнропагь Соединение 1, компенсируя дефицит электронной iwotiioc'jii на порфнрнионом цикле, и одновременнс затруднить Доступ отрицательно заряженных субстратов, каким являете* иодид-ион.

Субстрат-субстратная активация «pu окислении фенолов и о-

днани.шдииа и ее применение и аналитических целях

Mn.vmie субетрг.г-оубетр.гтоп активации давно известно для реакций. i.ar.-Uii.iiipyoMiJx перокендазон хрена. Оно заключается и многократном ускоренна окисления медленно окисляемого, так называемого "плохого", субстрата в присутствии быстро окисляемого, ■\\о1'к1ш-чо"\ Нел и бы явление субстрат-субстратной активации было

зано исключительно с величинами констант скорости отдельных стадии ижсидазиого цикла (Схема 1), т.е. "плохой" субстрат расходуется при имодеистнин с Соединенном I, а "хороший" - замыкает цикл, реагируя с единением II, то разработка ноных субстратов-усилителей для реакции меипой хсмилюминссценции не составляла бы труда. Однако подбор знсходит эмпирическим путем, поскольку далеко т нее субстраты с тес высокими, чем для люминола, значениями кз могуг Г>Мсг$дап» 1ЛИТСЛЧ. Полее того, недавно описан (Кпска гьЭДь'йг

тергизма при действии смсси усилителей, когда псян'ьшя кз ЦШ сйгШ >с гратон превосходит тпконую для каждого из суЛстрятоя в я солокунносп) данинх указывает на более сдож^мй йдашеизм б.иодаемого :*{к|*;кта.

[ема 1

+ !1202 -> EI + и2о; (M

+ S + Il+ EU + R (kj)

I + S • + И+ П + пго + R <k,)

с S - одноэлектроннын субстрат и R - продукт его окисления.

1'аиес аффект активации окисления ферроцпапцда пероксидом дорода, катализируемого перокендаз ciï хрена, в ирнсутстиин о-таинзиднна был изучен » работах H.Н.Угаровой (1981). Кинетическая >ипая окисления о-днлннзндипа п присутствии ферроцнанида факгсризуется появлением иплукционно'о периода, во,время которого . снсляется только ферроцпанид, а продукт окисления о-диаиизидина не ;тсктируется, и, следовательно, предполагать одновременное окисление >оих субстратов в вероксидазном цикле невозможно. Эффект активации ял объяснен на основе взаимодействия ферроцнанида с комплексом оединсиня II пероксидазы хрена ц продукта одноэлектронного окисления ■дианнзндциа:

I + S -> EU-SUS * Е + Р ' US' + Fell Iill-S +• Fell F

п

где Ell-S* - комплекс Соединения II фермента с проду одноэлектрониого окисления й-дианизндииа, образование кото показано снектрофотомстрически, а Р - двухэлектронный продукт . окисления, Fell и Fell! - ферро- и феррицианид калия.

Что же происходит далее с комплексом E1I-S? Можно иредпола! что он далее превращается н Ц-S* - комплекс иативного фермеш радикала субстрата, который также может взаимодействовать с "ило: субстра I ом: Ell-S -> E-S"

E-S* + Fell Е + S + FcIII

Если предполагаемая схема верна, то субстраты с ре потенциалами ниже о-дианизиднна должны окисляться и прнсутстин дианизндива быстрее, а для субстратов с более высокими нотецциа эффект субстрат-субстратной активации должен отсутствовать не.тавп or тина пероксндазы.

Экспериментальные результаты, полученные нами, указывал! правомерность предположения о взаимодействии радикалов о-д нанизи и фенолов. Вне зависимости от тина пероксндазы фенол и резо| ингнбировалн цероксидазную активность, в случае же гидрохш пирогаллола н пирокатехина появляется период индукции. Хару влияния коррелировал с рсдокс-иотенциаламн фенолов: фенол и рсзо| имеют потенциалы 1,09 и 1,04 В, что превышает редокс нотсициг дианнзндшш - 0,85 В, н являются ингибиторами реакции, а нирокате гидрохинон и пирогаллол, вызывающие появление периода индук имеют потенциалы 0,74, 0,60 и 0,fil В соответственно. При незавиа измерении скоростей окислении о-дианнзнднна и гидрохш катализируемом нероксидмой гриба Ph.igniarius, оказалось, окисление гидрохинона и присутствии о-дианнзидина происходит и пе\ очередь и ускоряется ь ЗО-СО раз, т.е. нмеег место аффект субс субстратной активации. В случае использования HRP эффект актив окисления гидрохинона составлял 5-й раз.

Если бы наблюдаемый ткОДюкт акгинлцин был еннзан с генера рлднкллои окисленного о-диакн.чиннл, коюрые затем неферментат

м

гируют со вторым субстратом, то, ври условии равенства скоростей (чвидуалыюго окисления о-дианнзидииа в отсутствие добавок под icTimcM различных исроксидчз (т.е. рапной скорости генерации шкало» окисленного о-днаннзндннп), продолжительность периода тукции не должна яаинсеть от типа фермента. Действительно, для всех лтггелоных пероксидаэ зависимости продолжительности индукционного риода от концентрации гидрохинона или пирогаллола практически впадали, резко отличаясь от та копой для грибной пероксидазы (Рис.2).

. 2 Заинсимпстк продолжительности нплукимпиnom пгриола (I) от кмнтгрянин пипюхтюиа (ежи) н ог.шлола (спрдлл) ял» ралличмык пгрокемдм: 1 - аряхма»; 2 - тпЛпкг»; 3 - хрлпд; 4 - гриб* rh.igtifarius. (ЗЛЬНМС скорости окиокмич о-диамизнди"Л • итсуствие яягпЛ(ггороя ff f>ae«M 0,t o.e./Huit.

(олученпыз данные позволяют говорим, с уверенностью об участии шрмеита в наблюдаемых эффектах активации ц косвенно указы на ют на Лразоплпис комплекса фермепт-руг нсал субстрата, способного яаимодейстпопать со вторым субстратом.

Таблица 3. Нижние пределы определения фенолов с применением грибном юроксидазы (1) и ксроксидазы из корнем хрена (И)

Оредслясмое соединение Нижний предел 1 [ определения, мкМ 11

фенол U не определяется

резорцин 3,2 5,4

гидрохинон 0,8 /1,5

пирогаллол 0,45 0,59

пирокатехин 0,21 не изучалось

И

Продолжительность индукционного периода является мерой концентра! "плохого" субстрата и может бить использована для созда! аналитических методик его определения. Учнгиияя вы сок чувствительность нероксидалы грибов к фенолам именно на се основе бь разработаны методики их определения совместно с кафед( аналитический химии Химического факультета МГУ (см.Таблицу 3). Глава 8. Получение и свойства рекомбннаитных форм ис'роксцдазы хрена при экспрессии в E.coli. Направленный мутагенез нсроксидаз рас.еннй открывает нов возможности для изучения деталей каталитического механизма и рс белковой глобулы и перокендазном катализе. Поэтому одной из hcj работы стала разработка эффективной системы экспрессии рекомбниаитн нерокендазы хрена. Синтетический ген нероксидазы хрена под контрол tac-nромотора был предоставлен фирмой Лmershom International /j Iii.l.1 а нронедена оптимизация конструкции плазмид, штамма-хозяина условий культивирования и индукции. Наибольший уровень экспресс ¡»«Комбинат ного белка анонерокендлзы был отмечен для трансформаш M.Coli JM !09/pSA26! - 60-70 мг апобелка с I я культуры. Большая чат рикомбинаитпого белка синтезировалась и виде телец включения. Рсфолди/и апобелка псроксидилы хрена Изучение литературы но проблеме рефолдннга белкой из тел »ti,'lki4eiül/l И.coli позволило сделать один существенный вывод, Koropi Шфт'дт'.'шл стратегию реактивации. Все описанные процедуры в ключа обработку телец включения восстановителями для регеиерации 57/-гру белка. ЗйК'М белок Помещали в систему, обеспечивающую окисление Ш|у1|И1А1й.'1еку.1йр1МЙ дпеульфцднын обмен. Чаще всего применялся мет сшшшиых дисульфидов, как самый дешевый способ (в отличие окисленного глутатиона). С другой стороны известно, что виутриклеточн среда E.coli обладает восстановительными свойствами, и тельца включен не содержат ковалетних ciucvii, а только псковалеитныс - ионные nuiv^Wmuc. Логичное предположение состояло в том, что модификац! 5if-rp)'nu н образование неправильных дисульфидиых связ И(И>всх(»лит на стадии разрушения клеток под воздсИствн

и

1скулярного кислорода. При этом с высокой долей вероятности не все слнтсльные модификации S/7-rpynn обратимы и их последующая стаиовительная регенерации не может быть 100%-noií. Становится cpiueiiHo понятно, что по избежание трудностей рсгенерацни .S7/-rpymi, елейных молекулярным кислородом при разрушении клеток и доспим телец №слючен::я, получение и обработка последних должна водиться анаэробно или в присутствии достаточно мягкого и легко лясмого восстановителя, такого, например, как дитиотреитол (DTT).

Таким образом, был разработан метод реактивации рекомбниантной окендазы хрена, позволяющий получать каталитически активный омбннаптный фермент с выходом не менее 25% в расчете на суммарный сактивиропашшй белок рскомбннлнтион апоиерокендазы (более 20 мг I л культуры E.coli).

Аналогичный подход, заключающийся в применении DTT на всех пнях выделения, очистки и рефолди;|-а, впервые позволил получт ь алнтически активную рскомбннантую А/я-иероксидазу из Ph. щорторхит при гстсрологачмой уксиресаш n E.coli.

Разработанный метол рефолдиига был с успехом применен не ько для получения рекомбниантной перокепдаэы хрена дикого типа; по : мутактпых (|юрм (Таблица 4).

Направленный мутагенез перчкеидазы хрена

11есмотря па то, что разрабо гпнная процедура получения омбнпантных форм пероксидалм xjieira n E.coli позполяет получат», ивнме ферменты, существует принципиальный недостаток данной гемы экспрессии, связанный с искусственным фолдингом молекулы, i атом получаемый препарат рекомбииантного фермента дикого типа, lie ержащий аминокислотных замен, уже отличается от нативного »мента отсутствием гликозилирования, набором несколько иных форм и более высокой каталитической активностью (Таблица 5).-Т.е. • озможио говорить об идентичности патнвной и рекомбниантной HRP, учаемой в E.coli, как это отмечается для цитохром С пероксидазы. ice того, следует отдавать отчет в том, что точечная мутация прежде го оказывает влияние на фолдинг и ее эффект на каталитические '

параметры фермента по сути является суммарным. При отсут структурных данных о мутантах интерпретация изменений каталнтич свойств должна учитывать не только каталитическую роль заменя , аминокислотных остатков, но и их роль в фолдннге. Однако дани этих ограничениях сравнительные исследования точечных мут нерокендазы хрена способны дать большую информацию, чем срав различных иатнвных пероксидаз даже с известной структурой.

Таблица 4. Реаютшация и очистка рекомбннантьых форм HRP. *С очистки: 1 - солюбшлнзация апобелка в 6 M mi .лише; 2 - рефолдин осаждение сульфатом аммония; 4 - гель-фильтрация.

Стадии Общий Удельная Выход Реактнвац

очистки* х белок активность % белка,

мг Е/мг %

1. Рекомбинантная 11RP дикого типа

1 20 0 0

2 20 1 ООО 100

3 20 1 200 120

Л 5 4 ООО 100 25

И. Phe4l-*His мутант 1IRP (F41II)

1 20 0 0

2 20 12 100

3 20 13,5 112

4 1,5 90 . 60 7.5

III. Phcl43~*Glu мутант HRP (Г143Е)

1 20 0 0

2 20 30 • 100

3 1Ü , 30 50

4 5 50 40 25

Ни бор мутаций был связан с предполагаемой ролью остатков I H Phell? и механизме каилиза. Phe4l локализован между ocrai днеглльпых His-iO и Uis42 (Рнс.1). Последний координирует атом ж гемииа и активном центре HRP. Мутация 14111 приводит к появл последовательности из трех остатков гистиднна, что должно обле сияльтанне гемииа с активным центром. Остатки Phe!42 и Pbfl43 у i ь гем-скязынающую полость выдвигаются на роль субсграт-связывак \H'tiT|ni. Замена ненолярного Plie на отрицательно заряженный остато!

на создавать электростатические помехи на входе в активный центр отрицательно заряженных молекул, к числу которых относятся и ве.нно темни, и многие допорные субстраты. Кинетика реконструкции апоформ рекомбишштпых ферментов

Для проверки ялиян"я окисления 5//-групи кислородом воздуха па |д активной пероксидазы б ni jio проведено сравнение дпух вариантов 1лдишл - (1) рсфолдннг апоформы и затем ее реконструкция I! (2) loii рсфолдннг холо-формн. Гемип, катализируя окисления 5//-групп ородом, должен способствовать формированию неираянямцлк Л1к[|цдиых связей и необратимой модификации части /-групп, тому двукратное повышение выхода тешпиой иерогхкдазм trptt I влей ни гемииа после рефолдпнга апоформы (Рис.3) косвсшм :«ерждало наши предположения об отрицательном влиянии злнтслыкш модификации ¿7/ ipyini ira фолдинг.

Результаты по юшетнке реконструкции мутлитных форм Ш1Р с.4) прежде Dcero свидетельствовали о влиянии точечной замены на иссс упаковки белковой глобулы и частности, на формирование, итого центра.

3.(слева). Oi|w|>CKTneiiocib рсактнваинп ¡'екомбнюитиоК HUP г эатк-.ииости от порядка довавлепия темина: процесс рс*|>олдинп» it 2 - после рефоллвпп» апч^горчы. F'.nicirtpanila апобелка - 10 Nrr/ил. t. (трава). Кинетика включения гении:) я ашч^орим Iпроведения >та F4Hf (ÏÏ я F143E (2)

нов пгрокенлаэы хреиа. Концентрация апобглка Ï0 икг/ил

0.1

Д, E/rv

О 10 20 30 40 50 60 70

Члс

0.1

20 40

, -Г" 1 1 ■ 2

1

_£_1_L- .1 1

0.3

01

.60 £0 (00

[О

Для рекомбшшгшой HRP образование холофсрмента , анофермента и гемииа завершается через 40-42 ч (Рис.3). Для мута F41II, как и ожидалось, наблюдалось быстрое (5 ч) образова] , холоформы из апоформы при добавлении гемииа (Рис.4), после ч начиналась необратимая ннактп нация, iio-iui днмому, за с нестабильности мутантной формы и щелочной среде. Данные по очис (Табл. 4) так же, как и данные но реактивации, указывали нестабильность мутанта F4I11. Для мутанта F143E процесс ремшетрук! происходит более медленно (72 ч), чем для рекомбипантного ферме дикого типа. Содержание гемииа в гомогенном белковом препарате муш F143E (Таблица 5) составляло всего лишь 45% в отличие от препара других рекомбннантных форм (У8-1(Ю%) и подтверждало ожидаем Э(|к|>скт отрицательно заряженного остатка глутаминовон кислоты доступность гем-связывающеЛ полости. Потерн активности, i фракционировании сульфатом аммония в случае мутанта F143E бь связаны с ухудшением растворимости его осадка. Учитывая низк удельную активность мутантных форм фермента, можно было уверенностью говорить о сильном влиянии точечных мутации на фолд| HRP.

Влияние мутаций гш субстратную специфичность и

стационарную кинетику окисления ABTS и иодида

Изучение каталитических сизнсгн различных форм пероксида хрена по отношению к широко используемым донорным субстратам е раз показало различия в свойствах натниного и рекомбипантного «jtepwei н подчеркнуло.влияние мутаций на фолдинг молекулы, и в частности, структуру активного центра (Таблица 5).

Рекомбннантная HRP была более активна но отношению к ЛВ1 ферроцшшиду и в усиленной хемилюминесценции и менее активна отношению к 4«нолу, о-феинлецднамину, о-дианизндину, гваяколу иодиду- Она таю;;е была несколько менее активна в окислении I/ чем натканы й фермент, что коррелировало с меньшими значения удельных-активностей по фенолу к гваяколу, Мутация F41II привел; пашой потере 1ЛЛ-окспдазной активности и нероксидазной активности

жолу и фенолу, что позволяет гшюрнть о вяимиин этого остатка (илаланина па координацию 1ЛЛ II меньших «о размерам ароматических стратои п активном центре ИКР, или, другими слонами, о гествованнн специфичного субстрат-связывающего центра для 1ЛЛ и, ;тал1>ноп области тем-связываютсИ полости.

'>лнца 5. Субстратная специфичность рекомбннантных форм юкендазы хрена, экспрессирусмых и E.coli

HRP .llRP/rc IM III П43Е

олекуляриая масса. кД 41 34 31 34

„ 8.9 9.05 и.о. и.о.

8.7 8.8 . 8.6 ■

здержаине гема, % 100 98 SO 45

цельная активность. Е/мг, по :

BTS ; 2000 4000(100%) 90(2,2%) 50 (1.2%)

чмюя 1200 560 (100%) 3 (0,5%) 3 (1,3%)

шякол , 860 600 (100%) 0 3 (1,3%)"

Днаииэпдин ' 740 520 (100%) 7 (1,4%) 34 (6,8%)

•ерроциаиид 2460 5400( 100%) 1G0(3,5%) 110(2,2%)

одид -' 400 360(100%) 12(3,3%) 7 (1,8%)

Февилендиамнн 580 460 (100%) 9 (1.9%) 4,4(0,9%)

>кнелс|ше IAA* •■' 100 70 (100%) 0 1 (1,4%).

Скорость окисления. 1АА определяли спсктрофотометрнческк в секционной смссн 0,1мкМ фсрмеиг-1(К' икМ 1АД в 50 мМ Na-ацетатиом уфоре, pH 4,5;

Для того, чтобы оценит» В какой пере мутации повлияли на каждую 13 стадий . исроксидазного катализа, было проведено исследование шисдепия ABTS и иодвда калия методами стационарной кинетики в ннроких диапазонах Концентрами» обоих субстратов. В случае окисления \BTS кинетические данные описывались Схемой 2. Схема 2

Б + H2Ö2-> EI + lljO (k,) El + ABTS-» EH + • ABTS'4 <k2) Ell + ABTS-» E-ABTS'+ (k;i)

E-AHTS,f E > ;AÜTS,+ (k„)

Таблица 6. Константы скорости окисления ABTS нероксндом водор катализируемого рекомбинантнымн формами 1IRP, полученными в да* работе и А.Смитом (1992)* (0,1 M КЬ-ацегатный буфер, рИ 5,0, Ошибка не превышает 10% or самой величины, да исключением **kj рекомбниантнон ИКР - около 50%)

Форма фермента Константы скорости к], мкМ'с"' кз, мкМ 'с"1 кц, с"'

Рекомбниангиаи 11R11 4,8 3,0 4600

14111 • 0,022 0,37 -

П43Е 1,1 0,32 35

Рекомбинантная ПНР* 5,9" 3,7 850

F41V* 0,63 0,81 90

Величины к) и к^ для препаратом рекомбииантного фермента, получен в данной работе (Табл. б) и группой А. Смита (1992), нракти'к совпадали с учетом ошибок определения. Мутация 14111 преимуществе влияет на расщепление нероксвда водорода, тогда как замена 11 замедляет стадию окисления АВТУ. Мономолекулярная скоро лимитирующая стадия (кц) отсутствует в случае мутанта 14111 в от ли от 1-4IV н 1-113 П. В последнем случае эта константа падает более, че\ два порядка по сравнению с рекомбннантным ферментом дикого тин; это позволяет предполагать взаимодействие катион-радикала АВ'П отрицательным зарядом на входе и гем-связывающую. полость. Лап стационарной кппстнкн окисления /\tSTS под действием рекомбинанп форм НИР указывают на возможность существования комплекса ферме с радикалом окисленного субстрата, как это предполагалось в механиз субстрат-субстратной активации и окиления 1АА.

Изучение кннетнки окнсленля нодкда также показало разлнч) л|>фект мутации на свойства фермента. Иодид калия яиляе д ну х: и с кг ро I т ы м донором н окисляется в одну стадию: "

Схема 3

Е + НгОа Е1 + 11аО (к,) £1 К) Е + НО! (к2)

В случае натнинои, рекомбинангнои дикого типа il мутанта F143IÎ наблюдаются зависимости, описываемые уравнением Мнхаплнса-пен и имеющие вид семейства параллельных прямых в двойных этных координатах. Уменьшение каталитических констант скорости для нда и пероксида па порядок в случае мутанта F14311 (Табл. 7) тетсльствуст о труднод.>стунпостн гемниа, что можно отнести на счет анировлння активного центра отрицательным .«рядом остатка гамнновоп кислоты, создающим электростатические помехи для иоднд-а.

»лица 7. Консганты скорости окнелення иод нда калия пероксидом орода, катализируемого рекомбинаптными формами 11RP (0,1 M Na-татнмй буфер, pli 5,0, 25". Ошибка не превышает 10% от самой ичины)

Константа скорости

рма фермента k(, мкМ'с"1 кг. MICM 'C"1 kt, MV

гамбииантная HRP 0,8 7,0 -

III - - 2,5х105

13Е 0,0)4 0,3

Для мутанта F41II полученные кинетические данные формально 1сываются механизмом тройного взаимодействию ^уравнение скорости (сржит константу скорости третьего порядка - v = T<t[E„J[l ГгОгЛ Ki 1), ) позволяет говорить о значнтелы oii доступности гемнна. Это ■ласуется с наблюдениями о быстром включении гемнна в апоформу и лабильности фермента в процессе очистки.

Рекамбинантные формы HRP а условиях радиолиза Изучеш1е термостабильностн рекомбннантной HRP и инактивации в де реакции указывало на дестабилизацию молекулы, возможно, из-за сутствпи в пей олигосахарпдпых ценен. Однако качественно кривые активации папшпого и рскомбтгантного фермента не разлэтались и исывалнсь экспоненциальной завивимостью. Изучение кинетики активации в условиях радиолиза показало не только уменьшение абнльности рекомбцпаитного фермента, но и различия п структуре

активных центров пагшшоп (hic.5) и реканбинатиан чароксндазы (Рис.С). Активность по отношению к фенол/антипирину у рекомбнпантпого фермента была устойчивее, чем активность но отношению к гваяколу и ABTS, а у напитого фермента - наоборот. У рекомбшшншой HRP в отличие от иативной на кривых инактивации наблюдалась динамически устойчива)! коиформацпи, субстратная специфичность которой существенно отличалась от исходной.

Гис. f) (слева вверху). Изменения hhiilili и иаишной HRP но отношени» к шанкьлу О), ABTS (2), (|лнолу (3> и о-феии.и'кли.мщпу (4) под д. Г|. г mt.'M гамма-радиации и 0,1 М Тш-HCI буфере. pH 8,0. l'wc.6. (енраьа кверху) Пэменеии* акгньиоетм рсHW по отношению к иодйду (1), фенилу (2), пшколу О) и ABTS (4).

Гис. 7. (слеп., btin.iy). lUMcituiiiii актиишмли 1411! мутата НКР по отноцкнию I нолиду (!) н ABTS (2). Гис. в. (справа нпп/У Нлмсщ'щи, ахщнмисш FI43E Myiaiua реко^бикантиий нероксидалы Хрена № отношению к иолилу (1), A11TS (2> и о-»|«.|ш;:ендиамн1|у (3). Коииешрзцин HalHHiKjix, q ('еконбныатиых фернеитои 0.1 мкМ,

J.

N»i/<* <s с

1илкт1ш;щш1 F-1I11 мутанта (Рис. 7) демонстрировала стабильность •ктшшости по отношению к под иду н нестабильность - но ABTS. Учитывая Ь'иипше згой замены на кинетику реакции окисления нодида и A13TS, южно полагать, что при окислении нодида катализ осуществляет 1сиосредст1!енио молекула гемина, обеспечивающая расщепление пероксида Ii прямое взаимодействие феррильиото кислорода с иодид-ионом. Наиболее инте1>еепым явился гтабилидирующий эффект замены » мутанте Г МЗК (Рис.8). Отрицательный заряд на входе в гем-саязывающую полость, по-видимому, споеобстаует ее меньшей доступности к защищает от повреждения гидроксил-радикалами и содьватированнымл электроламп, генерируемыми при радиолиэе.

Совокупность полученных данных показывает различие в механизмах окисления различных субстратен перокендазы и различную роль остатков Phc41, Phct43 в механизме, катализа HRP. Данные до мутагенезу Phe-It позволяют говорить о его участии в контролировании доступа ароматических .субстратов к феррн.тышму кислороду, «но совпадает с , выводами Оргии де ■ Моителлано (1995), основанных на данных об увеличении на два порядка активности мутанта Pheli-^Ala и реакциях сульфооксидировапля. '

■ Глава 0, Мехайизм оуислення иидолил-3-уксусной кислоты

кислородом под действием перокекдаа растений ■ . . . Реакция окисления IAA Молекулярным кислородом иод действием различных^ гем^содержатнх пероксидаз была нами исследована с использованием самых' разнообразных экспериментальных подходов. -стацниарных и нредстационарных спектральных исследований в азробных и ' Анаэробных условиях, эксперимента по поглощению кислорода н ВЭЖХ. Было показано, что в сильно-кислой среде все гем-содержащне перокендазы (цнтохром С лероксидаэа, лигнин- и Мя-псроксидазы из Pli.chrysnsporium) катализируют и определенной' степени окисление !ЛЛ с образованием шгдол-З-идьдегнда.

В нейтральной среде только перокендазы растений катализируют окисление 1ДЛ кислородом воздуха и именно эту реакник, следует считать специфической. В стационарных спектральных исследованиях 'при

окислении I АЛ кислородом воздуха', катализируемом ТОР, .основной формой фермента являлась нативная, но удавалось зарегистрировать Соедннетгие II сразу после смешении реагентов. Для ТОР так же, как и для HRP Л был характерен активационный эффект при добавлении нсроксида водорода, снизанный с появлением Соединения II, которое наблюдалось до тех нор, пока в системе имелись нсроксид и кислород. Учитывая стабильность н малую реакционную способность Соединения I ТОР детекшш Соединения II позволяла считать, что именно оно является ключевым ицтермедиатом оксидазного цикла, а не Соединение I. В противном случае зарегистрировать Соединение И ТОР было бы невозможно в условиях стационара.

При высоких концентрациях ТОР и 1ЛЛ в кислых средах образование ферроформм удавалось зарегистрировать , обычными с.псктрофогомстрнчсскнми методами. Появление феррофермента совпадало с созданием кажущихся анаэробных условий в реакционной смеси и появлением индол-З-алвдеглда. Это говорило в пользу восстановления ферри-нсроксидазы иод действием радикальных частиц, образуемых л кислой среде.

Соединение III ТОР в ходе окисления IAA зарегистрировано не было. При взаимодействий полученного в избытке нсроксида водорода Соединения III ТОР с IAA с появлялся устойчивый спектр Соединения II, что отличало TCP от HRP, для которой добавление 1ЛД к Соединению 111 HRP лить ускоряло сто распад.

Хорошо известна высокая специфичность реакции окислешш IAA. Только АА-МСТИЛ-1АА, как сообщалось (и это соответствует действительности), может окисляться так же как IAA, но не ее аналог» -а,а-димстил-1ЛА, 5-гндрокси-1ЛА, пндол-З-прогшоиат и бутират. Мы ппервые изучили окисление 2-метил-1АА под деистием ТОР методами стационарной и нредстационариой кинетики и ВЭЖХ, и получеинце результаты позволяют утверждать, что 2-метил-1ЛА не является субстратом оксидазного цикла, хотя н выступает прекрасным субстратом лерокендазного цикла. Спектральные изменения при добавлении 2-метил-IAA к Соединению III ТОР (или ИКР) не по!сазывают. образования

2 6

Соединения 11, н потребление кислорода не детектируется. Таким образом, 2-метил-замещение иирролыюго кольца 1АЛ блокирует реакцию, связанную с потреблением кислорода и образоианиеи Соединения II.

Изучение окислении IAA кислородом под действием ТОР и ИКР методом "остановленной струн" в анаэробных условиях Первые проведенные нами эксперименты с использованием приставки быстрого сканирования но изучению взаимодействия HRP и ТОР с IAA в строго анаэробных условиях показали наличие прямого восстановления феррн-нерокендазм в феррофермепг (Рпс. 9). Однако, при повторении экспериментов в режиме фиксированной длины волны с использованием вольфрамовой лампы, реакция не протекала (Рис. 10). Облучение мощной ксенононой лампой в режиме быстрого сканирования приводило к фотолизу реагентом и образованию частиц, способных восстанавливать нерокендазу. При иомещещш 3G0 нн фильтра между ксеионовой лампой и камерой наблюдения образование феррофермента было сведено к минимуму в кислых рП и не детектировалось в нейтральных.

Рис 9 (сл.-ва). Спектральные изменен)!* при e v; ннодей-тьчи 2 мкМ ТОР п 2,5 мМ IAA s 50 иМ Na-UHTpaTiwM буфере, pH 4,5, записанные « режиме быстрот сканирования н отеутовпе им фильтра межлу ксеноновой лампой н камерой м;,6лм,;\синх в интервале 0,012 2.Л сек. Стрелками iij'.d'u.u направлении »вменений г.асктра. Рис.10. (справа). Сиектральине изменения, регистрируемые i;a 4(13 (О. 4■ О (2) и 433 нн (3) н режиме фиксированной ллнны волны при взаимодействии 2 мкМ ТОР с 5 мМ 1ЛА в ciporo ;.n;i:ip<>itiibi]t условиях в 50 мМ Na-цнтратном 6y»J>epe, pH 4,5. - . .

Л.в<

Л, о t.

B.ie

2«

—Г—- Ч... •

Э5Я

Таким образом, прямое посстанавление чероксндазы и фсррофермснт в анаэробных условиях в присутствии 1ЛЛ индуцировалось лишь фотолизом. Восстановление ' оказалось чувствительным к pH, что отражает pli-зависимость редокс потенциала пары фсрри/ ферроиероксндаза: -275, -155 и -105 мВ при рП 7, 5 и 4 соответственно. Поэтому феррофсрмелт и наблюдается в кислых средах. Наиболее вероятно образование феррофермсита под воздействием радикалов скатола (12). При этом образуется катион скатола, превращавшийся в метилен-3-нидолетш, ln=CH'¿(13). Последний легко но.чимсрнзуется и, по-видимому, является причиной образования 30-40% неидентифицнруемнх продувов окисления полимерной природы при окислении 1ДА в кислых , средах, катализируемом HRP.

1ЛА'+ -> 1п-СП2' • + со2 (11)

I- + 1п-СН2' -> Е2+ ■ + In-CJIj* (12)

In-Clly* Ь=СН2/ (13)

В результате анапробиых экспериментов в этом исследовании впервые бы..о однозначно показано, что IAA неспособна прямо восстанавливать иероксидалы в ферроформу в отсутстине фотолиза.

Поэтому широко распространенное мнение о необходимости этой реакции В качестве инициирующей для всего оксидазного цикла не соответствует действительности. ',.'./'..'•■;.'■••„ : , '

Способность 2-МСТИЛ-1ДА к восстановлению пероксидазы ' а фсррофермснт в фотолитических услоииях была аналогична 1АА; '.хотя, как описано выше, она субстратом оксидазного цикла не является. Этот факт полностью опровергает возможность рассмотрения оксидазного цикля как пероксидазного с радикальным механизмом возникновения инициирующего органического гндронероксида (механизм Накадзима-Ямацакн). , . ' " -'"/■' •'"''-" '

Итак, если фсррофермснт является вторичным продуктом оксидазного цикла, а 2-мстил-1АА, являясь прекрасным субстратом пероксидазного цикла и легко разлагаясь п присутствии кислорода. С

»браэоианием радикало», не является субстратам н оксидазной реакции, то

еакоп же механизм иннциироиання?

Учктмиая существование фотолитиясского иосстанонлсния фермента i присутствии IAA, псе дальнейшие эксперименты в присутствии (роводились и обоих режимах - режиме фиксированной длины ролны и эсжимс быстрого сканирования с использованием 360 им фильтра.

Спектральные изменения u режиме фиксированном длины волны |а6людались лишь и тронной системе. с|)ермент-1ЛЛ-кислород (Рис.И-Н).

ki*c. 1 l <swtpxy) Cikki рольные изменения. регистрируемы»; it.i 403 (I), 416 (2) и 433 нм (3) « режиме |íияспроьниttoft длины лопни (пфаи) « • режим« быстрого скаиироеаиая • мшерамс 0,012-24 сек (слева) II [■ i3AMмодеñcvfeiiн 2 мкМ ЮР с 5 ьМ ÍAA и 62.5 мкМ кислорода (t(*-«r'M«.HT " выстреливал«' претя» снеск ÍAA-1 ислорол) в с грога анаэробных уровнях н SC мМ Ыа-цмтритиом буч}*"!*, |>Н 4,5- На вроке • 25 ни диапазон líArtjii нзобиг.щческоЦ точки.

'HI:.J2. (eiinjy) Слгктралькы.; мзмонгкия, регистрируемые иа 403 (!), 4)6 (2) н 433 км (3) ■ режиме |»1К1И|иэеаиний длины волны (справа), н заижамыс в режиме быпск<1н1<|к>вг>иия « им rt реале 0,012-24 сек слева) при »закмодеВц-мим 1,5 мкМ ТОР с 5 мМ IAA и ь2,5 мкМ кислорода <»|«рм«нт "аыст^магяи" против мсск 1ЛЛ-кислород) • строго aitajp«6nwx условиях к SO мМ Nu-фосфлтиом буфере, рИ 7,0.

7.9

Данные демонстрировали существенное различие в поведении HRP (Рис.13) и TOI' при рП 4.5 (Рис. 11). 1) случае ТОР лини, незначительные спектральные изменения детектировались в течение индукционного периода продолжительностью около 10 сек (Рис.11). Продолжительность индукционного периода была пропорциональна концентрации кислорода. HRP отличалась двухфазной кинетикой,- причем продолжительность первой фазы также была пропорциональна концентрации кислорода (Рис. 13) и гораздо короче, чем для ТОР, указывая на то, что скорость потребления кислорода в присутствии IIRP при pH 4,5 приблизительно на порядок выше, чем при катализе ТОР.

Рн-' 13, (Мирчу) Спектральные изменении, регистрируемые на 403 О), -1 !б (2) II 433 пи (3) в режиме фиксиропаииои ллмиы iv>ai\u (ичта) и .ia,m..'in\\w>: в режиме быстрого сканироялимя в интервале 0.012-24 се* (спрчпл) при и.шиилгмстпнн 2 мкМ IIRP с 5 мМ IAA к 62,5 мкМ кислорода (фермент "ныстрелнналн" против смеси Мл-кнслчртд) и строю aii.LjprjrtiiMx условиях в 50 мМ Na-нитр.тгном буфере. pH 43. Па врезке - 25 им лнлиллон вблтн наоСеетнческоЛ точки.

Рис..И (mniaj) Спспральимс тмеиенпя, регистрируемые на 403 (1), 41 Г, (2) и 433 им (Э) в режиме фпксаро|<;ммюй /t'HnuJ полны (справа) и лапнс.ипши п режиме, быстрого сваиировлння в интервале 0,012-24 се* (слева'» при члгшмгук-йстпии 1.5 мкМ HRP н 5 иМ 1ЛА и 62,5 мкМ кислорода (фериепт "выстреливали" против CMI си 1ЛЛ-кисЛ1>р(»л) в строго апалробнм* условиям и 50 иМ Na-t|-nri[i;iTHoH буфере, pH 7,0.

. А.» <1.2

Л, О

В. ш"

П.1

При pH 7,0 скорости потребления кислорода при катализе обеими перокспдазами были сравнимы. Данные быстрого сканирования наглядно свидетельствуют о различиях в мехаинме действия ТОР и HRP в ' целой среде и показывают присутствие различных редокс-состояшш и первой кинетической фазе. В случае HRP образуется Соединение !П фермента, а затем по исчерпании кислорода появляется феррофермент. Четко выраженной изобестической точки между нативным ферментом и Соединением 111 не наблюдается, указывая на возможное образование Соединения 11. В елучае ТОР наблюдается лишь натшшый фермент, который по исчерпании кислорода переходит в ферроформу с четкой нзобестической точкой при 416 нм.

Тем не менее, общим для ТОР н HRP является то, что феррофермент появляется после окончания реакции (потребления кислорода). При р!1 7,0 обе пероксидазы недуг себя одинаково (Рис.12, 11), н иашвнын фермент прямо превращается и Соединение II.

Таким образом, реакции инициируется лишь и тройной системе 1АА-нероксида.за-кислород. Причем, в случае 2-иегил-1ЛЛ появление кислорода н с: стеме не приводило ли к каким спектральным изменениям (не показано), подтверждая, что '2-мети.ч-1АЛ не является субстратом окендазного цикла. Совокупности полученных данных позволяет говорить об инициировании реакции окисления, проходящем через образование тронного комплекса, высокоспецифичного к структуре субстрата, потому что, варианты активации через двойные взаимодействия фермеит-1АА и кислород-IAA, лежанию в основе схем Рнкарда-Джоба и Пакадзима-Ямацакн соответственно, не подтверждаются экспериментально.

(1) Нет восстановления пероксидазы в феррофермент под действием IAA, поскольку в кислой среде образовавшийся катион-радикал 1АА претерпел бы декарбоксилпрованне по реакции (11) (к - 18 U00 с'1, Кандеяс, 1995) и сместил равновесие в сторону феррофермента, который должен был бы непременно детектироваться даже в стационарных условиях.

(2) Образование радикалов 1АА и 2-метнл-1АЛ под действием кислорода имеет место, и оба соединения - прекрасные субстраты

нсроксидазиого цикла, но только 1ЛЛ - субстрат оксидазного цикла, а 2-мстнл-аналог - нет.

Остается еще нарнан» Двойного изаимодепствпя иероксидаза-кцелород, когорте не являлось предметом специальных исследований, хотя Угаровой с cowr. ((975) было показано различие коэффициентов экстинции HRP и «»ровных и анаэробных условиях, позволяющее предполагать спплынянне кислорода с ферментом. В режиме фиксированной длины полны нами детектировались очень незначительные, но воспроизводимые, изменения, позволяющие предполагать слабое комнлексообразовапне феррифермептоп г. кислородом.

Таким образом, актичацин оксидазного цикла проходит именно через тройной комплекс, который может образоваться как при последовательном присоединении кислорода и (АЛ, так и наоборот, 1ЛЛ, а затем кислорода. Какие различия и процесс вносит порядок присоединения субстратом? К кислой с|юдо наблюдаются различия п зависимости от порядка доб.тления субстратов, а в нейтральной различия отсутствую!. Л HMumm, спятыпаши; 1ЛЛ перед кислородом сиособстеуст образованию фс(»|кк|>ермеиг,1, а кислорода перед 1ЛЛ - ист. Iic.ni учесть, что при смешении HRP со сзчесью 1АЛ и кислорода картина практически совпадает с viKOHuii, полученной при смещении реагентов п порядке фермент, 1ЛА, кислород, можно утвррждать. что комнлсксообразование фермента с 1ЛЛ гораздо сильное. Наблюдение о преимущественном образовании феррофермента при добавлении кислорода к сиесч фермента л 1ЛЛ оказалось справедливым и для стационарных анаэробных условий - для IIRP и ТОР, и даже липнпшег'Оксидазы, которая обладает очень низкой активностью ко отношению к ÍAA. Для ТОР феррофермеит детектировался в течение получаса после смешения реагентов. При сравнении профилей ВЭЖХ было отмечено, что при добавлении субстратов к ферменту в порядке кислород-ИЛЛ основным продуктом реакции являлся не иидол-З-альдегид, а. индол-З-карбинол и питермедиат X, медленно превращавшийся в метилспокспндол.

Итак, можно говорить о различиях в механизме образования и распада тройного комплекса и зависимости от порядка присоединения

бетратов и кислом среде. Исходя из всей совокупности данных можно верждшь, что иииципрошние по тину ффмснг-»1ЛЛ-*кислород специфическое, характерно для всех гем-содержащих нерокендат при 1слых значениях р!( и недет к образованию радикалои скатола, профермента н нндол-3-альдешда.

Что же происходит при формировании тронного комплекса в «рядке фермент-жислород-ИЛА? Обратмся к данным быстрой тетики в нейтральной среде, т.к. здесь наложение радикальных эоцессов минимально. Рис. 12, 14 показывают, что при нейтральных р11 (ннственной детектируемой формой фермента является Соединение II и нсим образом, подтверждают его ключевую роль в окисленни 1АЛ. >еррнфермект превращается непосредственно и Соединенно II с хорошо тднмон изобестической точкой при 408 км для ТОР (для ИКС юбестнческая точка между феррнферметом и Соединением 11 находится ри 410 вм). Время потребления кислорода для ТОР и ИКР сопоставимо, отя концентрация Соединения II ТОР намного ниже, чем для ИКР, "где есь фермент существует в виде Соединения И. Это еще раз указывает па ысокую реакционную способное п. Соединения II ТОР.

Можно предположить, что при распаде тройного комплекса бра.тусгся непосредственно индолнл-раднкал, который удерживается »ерментом, и сунероксид-радикал.

•+02-> |Е-02] + 1АА-» 1Е-02-1АА1 Е-1АА* + 11+ + 02"- <14) •-1АА'+ 02 . Е(ОП') 1п-С1120 + С02 (15)

•<01Г) + 1АА Е-1АА" + НгО (16)

1 далее - реакции (15)-(1б) - соттветстиуюг реакциям (9) (10) в )ех шнзме 1'икарда-Джоба с тон лишь разницей, что индолнл-радикал н ь'нпси интерпретации имеет актипнроианное 2-положенпе ннррольного сольца и нидол-эпокенд 1и С1120 выглядит нижеприведенным образом:

Оксндазпын цикл при окислении 1ЛЛ нключаст инициирование (14), i которой нсроксидаза выступает как окснгспаза, активируя молекулярный кислород, и основной цикл (15)-(16), включающий натипньн ф-.ррцф рмент и Соединение Л и функционирующий независимо oi нероксндазного. Ключевой момент цикла - восстановление Соединения Г молекулой 1ЛА с образованием комплекса фермент-радикал, способной далее реагировать с молекулой кислорода. Существование комплекс; подобного типа предполагалось на основании кинетических данных рассмотренных в глаиах 7 и 8, а именно, в механизме субстрат-субстратно! активации н формальной кинетике окисления ABTS рекомбннамтной 1IRP.

Вся совокупность кинетических данных указывает на образовать комплекса фермспт-радпкал как существенную черту иерокендазног« катализа.

В работе Дапфорда (1992) был показан активирующий эффек SOD (супероокспдднмутазы) на образование Соединения H при окислсши IAA п ней тральной среде как иод действием нсроксида, так н без псе, чп соответствует предложенной реакции.(14) и способствует инициировании окепдазиого цикла. Им также было показано частичное ингибнронани образования Соединения III и присутствии SOD.

В наших экспериментах и кислой среде было отмечено, что SOI практически не оказывает влияния на процесс, катализируемый HRP, и ускоряет потребление кислорода в 1,5 раза при использовании ТОР ка катализатора; уменьшения доли Соединения III HRP отмечено не было Эго говорит о том, что основное различие между ТОР и HRP в кисло среде как рал связано со способностью последней оЛразовыват Соединение III при распаде тройного комплекса, образуемого lip несиецнфнческом взаимодействии в порядке фермент-1ЛЛ-кпслород. 1 нейтральной срсдс, в которой осуществляется только оксидазный цнк (15M1G), Соединение III HRP практически отсутствует (Рис.14).

Появление Соединения III при катализе HRP окисления 1ДА кислых средах создаст альтернативный путь образования Соединения И тем самым ускоряет процесс окисления приблизительно на порядок н сравнению с ТОР, для которой Соединение 111 отсутствует и в кислы

•редах. В aro-" свяли понятно, почему пероксид водорода активирует жеидазнмй цикл у 'ГОР: включение пероксидазного никла обеспечивает )бразоваиие Соединения II быстрее и и более высокой конценграци I, чем -шпцинронаиие через тройной комплекс. Результаты о вспомогательной роли пероксидазного цикла были подтверждены данными быстрей кинетики окисления 1АЛ под действием ТОР и пероксида водорода. Причем даже при использовании высоких концентраций нерокенда (1 мМ) наблюдался спектр Соединения II до полного исчерпания пероксида. Соединение I эафнкенроваиоо не было, что подтверждает данные Рикарда и Джоба (1971) о прямом двухэлектронном восстановлении Соединения 1H HRP в Соединение II ко реакциям (7)-(8). Таким образом, актянашшпнын эффект пероксида водорода при окислении 1ЛД под действием ТОР и HRP Л связан с включением нерокендаэиого цикла дли обеспечения альтернативной генерации Соединения II. В случае катионных перокендаз необходимость в активации отсутствует, поскольку они обладают способностью формировать Соединение III, которое в результате днухэлектроннечо восстановления переходит в Соединение II.

Отсутствие Соединения III и процессе окисления IAA, катализируемого ТОР, можно считать результатом электростатических помех при взаимодействии отрицательно заряженной молекулы фермента (pl 3,5) с суиероксид-радикалом. Другое правдоподобное объяснение состоит в необычности свойств ТОР, вытекающих из се первичной структуры. На входе в активный центр находится отрицательно заряженный остаток ^лутаминовой кислоты, который может оказывать существенное влияние на взаимодействие нероксидазы с отрицательно ззряженными чалнцами, в частности с суиероксид-радикалом, а также играть существенную роль в стабилизации Соединения I.

Каталитическое окисление аминокислотных коныогатов IAA в

присутствии пероксида водорода.

В физиологии растений формируется мнение о том, чю пероксид водорода в расти тельном кле тке выступает в качестве сигнального соединения. Поэтопу ачтниаццониый :я|«]лкт нерокенда водорода па окисление IAA под действием перокгл.ши табака может иметь

3Í

шцкдолснюх; значение п физиологии этого растении. С другой стороны, исследекшнсях по структуре метаболитов 1ЛЛ in vivo и in viti возникают ирогиворсчя из-за идентификации различных продуктов. Hj окислении 1ЛЛ иод действием ИКР образуются оксиндол-3-карбино. индол-3-карбпнол. мстнлеиоксиндол и индол-3-альдегид, в растениях я 1АА представлена коньютатами '¿-аспартата и Л-глутамата с IAA оксиндол-З-уксуснон кислотой, самой 1ЛЛ и окснндол-3-уксусис кислотой, кндод-3-ал1.дс1Т|дом и иидол-3-карбоновой кпелотт Метплепоксппдол в растениях не обнаруживается. Ситуация шперпрегацпеи роли перокепдаз в катаболизме 1ДА стала euie боле сложной, когда было показано, что IIRP in vitro не окисляет копьютат 1ЛЛ с аминокислотами. Таким образом, все предыдущие исследования и механизму окисления 1ЛЛ нероксидазами не могли связать активно« фермента с недскарбокенлпрующимп трансформациями 1АА. Получении в нашей работе данные, хотя н убедительно демонстрирую нысокоспецифнчную оксигепазную «функцию перокепдаз по отношению 1АА, не да к 1 оснований предполагать, что продуктами реакции окислспи JAA молекулярным кислородом иод действием перокепдаз яилшогс соединения тина оксипдол-3-уксуснон кислоты. Поэтому одна и возможностей изучения механизма окситсназиой реакции состояла апробации встречающихся м природе аминокислотных коиыогатои 1ЛЛ присутствии нерокенда водорода, что и было впервые сделано.

В работе . были изучены копьюгагы 1ЛЛ со следующим аминокислотами - D,¿-асиартат, ¿-аспарашн. D- и Л-феннлаланпн Многие искусственно синтезированные коньюгаты, в отличие о природных с глутаматом и аспартатом, легко гидролизуется образованием IAA, и, следовательно, окисляются. Поэтому были выбраш коньюгаты 1АА, относящиеся к трудно гидролизуемым и не явллющпсс: субстратами в окенгепазион реакции.

В ьрисутсвни перокепда водорода в кислой среде удавалоа зарегистрировать незначительное потребление кислорода в систем! нероксидаза-коньюгат IAA. С целью проверки предположения о< активацишшод) аффекте лерокенда водорода на окисление конмогатов 1А/

«юрод ом ноэдуха и присутствии 1IRP и ТОР Лило проведено .•игральное изучение «эзимодейпвия Соединений 111 с коньюгатами 1ЛЛ. 'ведение конмогатоя 1ЛЛ (ipil низких рИ было аналогично самой IAA -единение Ш иреярл)^алось в Соединение 11 как й случае HRP, так и в учае ТОР, что было нисколько необычно, если учесть, что при ислеяии самой 1ЛА под действием Соединения III HRP Соединение И не блюдается. 1IRP была более активна, чей ТОР в отношении D.L-паргата IAA и в этих условиях быстро появлялся продукт окисления :лтого цвета. Появление Соединения II было связано с потреблением 1слорода. Эффективность окисления коньгатов 1АА падала в ряду /,-иараги11>0,1-аспартат>0-фенилала1шн. Никаких спектральных iMeiieimíí и образования продуктов не отмечалось для ¿-феиилалаиина. \есь следует вспомгшть, что при окислении 2-метил-1АА Соединением 111 сутствовало как Соединение II, так и потребление кислорода, т.е.-ссигецазный цикл не "включался". В литературе известно окисление •илового эфира IAA кислородом в присутствии иероксида водорода и RP, сопряженное с появлением карбоцептрнронанннго радикала по mil',tu ЭГ1Р (Escobar, 1У92). Так, для обеспечении потреблении ислорбда в. системе пероксидаза-коиьюгат IAA необходима генерация аднкала субстрата и/или Соединения 11 чере:) нероксидазиый цикл.

Для HRP обршоиалие Соединения 11 является обычным, поскольку но менее активно, чем Соединение I и иативный фермент, и представляет обой основную стационарную форму в процессе нерокендааного катализа, 'азложение Соединения .111 также происходит через Соединение П. По ля ТОР появление устойчивого в стационарных условиях Соединения II иикально. Э'к, означает, что имеется как минимум два реакционных ,икла, включающих Эту форму фермента - оксигеназный и связанный с Соединением Ш. Учитывая отсутсвие Соединения 1 при окислении 1АЛ Соединением HI TOP по данным быстрой кинетики, можно предположить грямое двухэлсктроипое посет.'нтвлйние (Соединения III под действием АА, чго эквиваленте Переносу атома кислорода с фермента на IAA. ГОР-ООН" + ÍAA-+ ТОР(СЧГ) + 1ДЛОП <17) Соединение Ш Соединенно 11

Двухэлектронное восстановление Соединения Ш HRP был показано Рнкардом и Джобом, но они его интерпретировали Kai последовательное связывание двух молекул 1АЛ н далее их окисление in реакциям (7)-(8), что менее логично, чем вышеприведенное допущение Стационарное появление Соединения II, сопряженное с потребление! кислорода, позволяет предположить существование оксигеназного цикл для коныогатов J АЛ в присутствии перокенда, обеспечнвающеп шншинропаипе реакции, т.е. генерацию карбоцентрироианного радикал конмогата 1ЛА. Если учесть результаты стационарных исследопант окисления 2-метил-1ЛД Соединением 111 ТОР, а именно, отсутствие Kai Соединения 11, так и поглощения кислорода, напрашивается вывод i переносе кислорода именно во второе положение пнррольиого кольца.

В кислой среде в строго анаэробных либо в кажущихся анаэробны: условиях, созданных избытком • NAD1I, . реакция протекает чере разложение Соединения Ш без видимого образования Соединения II Следует отметить, что NADH не обладает 'способность* восстанавливать нерокендапы в анаэробных условиях. В аэробны: условиях нри добавлении. NADII вначале образуется Соединение III, затем фсрро<|>ермент уже и условиях кажущегося анаэробиоза. Поэтому NADII можно использовать вместо перокенда. водорода, т.к. сг добавление также' приводит к Соединений 111. Показательно, чт анаэробные условия при избытке перокенда ведут к быстрой инактивашг фермента (характерное падение • пика Соре), что происходит горазд медленнее в аэробных условиях. Таким образом, окенгеназный цикл определенном ашеле защищает фермент от повреждения радикалами генерируемыми при взаимодействии с нерокендом.

При изучении восстановления Соединения III HRP D,L-acnapraToi IAA методом "остановленной струн"- в анаэробных условиях был ноказано, что Соединение Ш HRP превращается непосредственно Соединение II без появления даже следовых количеств Соединения 1 Кинетическая кривая накопления Соединения И на И18 им (нзобестическа точка между ферро- и феррнферментом. HRP) удовлетворял экспоненциальной зависимости с кажущейся константой скорости первог

¡рядка раиной 12 с"1. Для ТОР уже первый спектр, полученный через 1,2 гек после смешении демонстрировал избыток Соединении 11 по >авнешпо с Соединением III. Таким образом, двухэлектронпое ^•становление, показанное Рнкардом и Джобом для Соединения III ?йствптельно является экспериментальным фактом, снраведл1шым и д.1я эньюгатов IAA. Такое восстановление должно интерпретироваться как сренос кислорода но реакции типа (17), поскольку одновременное заимоденствиетпе двух молекул коныогата 1ЛА с ферментом (согласно птерпретацнн дпухэлектроиного окисления IAA Рикардом и Джобом) геричеекп затруднено. Тот факт, что и стационарных анаэробных словиях Соединение II не детектируется, не означает, что реакция (17) е имеет места. Просто отсутствует цикл, связанный с потреблением ислорода н Соединением II.

uc.tS. Ссе.ч). Кинетика вззина£к1*1ствил Соединении iii ИКР с 2 *Ч !',L-.r1АЛ в 0.05 .M Na-кграгиом буфере, рН .<5, ■ режиме £м(Люп» сианпроваии* в интервале 0.012-6 се* в а«л.»р«йммх усло*нях. ■ослимспне III получено нредмнку&кцывм 4 нкМ фермента H I мМ иерлкспла в течение 1,5 мич. 'HV.Itl. (спракя). Ki/Mefnra (макмоде-Иетвм Соединения I IIRI1 с 2 мМ D.L-ac.Taprar.t IАЛ ш 0.0.4 M N,t- ' мтрятном буфере. рН -'4,5, в режиме ймстрого скааяртэння в интеряоло 0,012 мсек-6 сев) в акаоробныв СЛОЫЫХ. Соединен« ( ПШУЧСНС ирсЛннкубацНеА 4 икМ <|«рмента H 6 икМ litfpоксида в течении 13 rie*.

Еще одной дополнительной возможностью проверить наличие (пухэдектронного окисления коныогата IAA, интерпретируемого jepeiioc кислорода, было изучение его взаимодействия с Соединение^ (1 гШР. При изучении этого взаимодействия методом "осганавлещмй ару,и" Соединение I HRP превращалось в нагдшдеЯ фермент, я,то /»вду

>писать следующей схемой: , ^

Е(СГ) + 1АЛ-С -У £ + . ох.ИДА-С (18) ^оедннеппе I оксипдот-З-уксусная кислота

Б этой связи следует сказать, что исходный спектр HRP содсрж следы Соединения 11, поскольку трудности получения чистого Соединен! ( HRP хорошо известны. Поэтому, нывод о существовании реакции (1 не бесспорен. В целом, изучение окисления коныегатов 1ЛА нероксидазаг растений представляет собой новое направленно в исследовании механнэ! физиологически значимых реакций; катализируемых нероксидазаг растений.

ВЫВОДЫ

В результате проведенного исследования был нолучей (тд важных принципиально новых данных о мехмншт действия и структур» функциональных зависимостях иероксидамют кагалша, которые Мдж; суммировать в следующих выводах.

1. Выделены перспективные ирадуисмш Квемх и<ерокемдаз культуры клеток люцерны, траисгешкито табака и гриба Phellin ujninrius. Разработаны методики получения и охарактеризованы свонст новых ферментов. Показана возможность применения новой грпбц пероксидазы для анализа фенолов и пероксидазы табака как ново реагента для хсмнлюмннесцситного анализа.

2. Исследован феномен субстрат-субстратной активации реакции окисления о-дианнзидииа на примере 5 иативных пероксидаз ряда фенолов и подтверждена его феомоггативная природа, связанная существованием комплекса иерокендаза-радикал субстрата. .

3. Разработана система * экспрессии: и ■ - рефолднн рекомбинантион пероксидазы хрена в Е.coli, позволяющая проводи наработку рекомбинантных форм фермента в количестве 20-30 мг с 1 культуры и осуществлять работы по направленному мутагенезу. Показа; различие в свойствах натипиого и рекомбинантного фермента, являющее отражением искусственного фолдинга при отсутствии-природной систем посттрансляцнонион модификации.

4. Получены и охарактеризованы точечные мутанты F41H F143E пероксидазы хрена. Обе мутации привели к нарушению се

«»дородных связей и активном щтщк- н падению каталитической наивности. Характер влияния проведенных замен на стабильность, жлюченне гемина и анофермент, субстратную специфичность и различные ;тадни пероксцдазцого цикла «одтнерднл предположения о локализации заменяемых остатков фелилаланина н их роли и механизме катализа. Показано , наличие скорость-лимитируюишх стадии, связанных с Чпссоциацнеп комплекса фермент-радикал субстрата, для рскомбннантпон ИКР дикого типа и мутанта РМЗЕ. Исчезновение активностей по пая колу п фенолу в лероксндазиой реакции и окснгеназнои функции у мутанта Р4111 позволяет говорить об участии остатка Р/к'4/ в контролировании доступа ароматических субстратов к феррцлыюму кислороду.

5. Методами стационарной и предегацпонарной кинетики л апазробиыл' условиях впервые изучена реакция окисления индолил-З-уксусной кислоты молекулярным кчелородом, катализируемая нерокейдаээмм растений. Впервые показано, что механизм реакции связан с образованием тройного комплекса в порядке фермент-кислород-субстр^т, при распаде которого иысцобожднется супсроксид-радпкал <и образу^т^я комплекс фермента с радик/ШМ субстрата, способный к „поглощению Кислорода п. окислению в Сосдиномис И пероксидаэы. Ддаш ■ образр.ч оксигеназный цикл включает н/тшиую форму-фермента и.С-ред>шециеЛ1,и функционирует независимо ог пвроксидпзного,

6. ГЦкнюдеио изучение 2'метнл*индолнл-3-ук<;усцой кислоту в реакции окисления молекулярным .кислородом .и впервые .показано, что данный аналог, несмотря на оияэыиание с ¡{^рмецтом ,н высокую реакцноноспобность в лероксиддзлом ¡цикле, субстратом ,окелдазцой реакции не я&лется. Таким образом, 'была .продокжетрнрглада .высокая субстратная специфичность И9ровдндая ¿.растений л .речкцнд о^лглецня индолил-З-уксусн^"! .к.пс^^цч мод?кул^рдым .кислородом л .иыеказяно Предположение о' дасуюрода до активного .цацра ,»0 птррос положение шдеро^дргр.ко^ьцд. -

7. .Чпервме ¡изучены аминокислотные конмогаты индолил-З-уксусной кислоты в реакции иероксидазиого окне пения методами предстационарноК кинетики. Показано, что доЗаплевне перокенда водорода

активирует окснгеназную реакцию, связанную с потреблением кислоро/ Продемонстрировано существование прямого дг.ухэлектрошюго переноса молекулы ипдолил-З'уксусион кислоты и ее амииокислотных коньюгатон активный центр. Это эквивалентно переносу атома кислорода во втор положение нпрролыюго кольца с образованием оксицдол-уксуан кислоты, чго может объяснять' идентификацию этого метаболита растениях.

8. Вся совокупность полученных данных позволя классифицировать нероксидазы растении как высокоспецпфичш оксигевазы нндолнл-З-уксусной кислоты и предположить налич) инсокоснсцифнчного к субстрату центра связывания, в котором остатс I'he-t I обеспечивает координацию индольного кольца. Таким образо» субстратная специфичность а перокендазной реакции отражает наличт центра связывания иидолил-З-уксусной кислоты, способно! координировать и меньшие по размерам ароматические субстраты, такт например, как фенол к гваякол.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях: t. Скршшнков АЛО., Карассв II.П., Урманцева В.В., Волкова Л.А. Газапии И.Г. 111 гамм Modicago sativa L-t - продуцент нероксидазы Л.с. СССР N 4828580. Приоритет 22.11.90. БИ N6, 1992.

2. Gazarvan I.G.. Veryovkin A.N., Pisarev V.V., Kim B.B., Egorov Л.М Catalytic properties of Medicago sai.iva L-1 peroxidase.// In: Abstract of 11 Intcrnatiooal Symposiufl» on Molecular and Physiological Aspects о Plant Peroxidases, Lublin 27 29 August 1990. Lublin, 1990, p. 125.

3. Gawryan I.G.. Veryovkin A.N., UrmanUeva V.V., Fechlna V.A., Egoro\ A.M. Isolation of homogeneous peroxidase from Medicago sativa L-1 cell culture.// In: Abstracts of П International Symposium on Moleculai and Physiological Aspects of Plant Peroxidases, Lublin 27-29 August 1990. Lublin, 1990, p. 12C. . -

4- Gigary.'m LQ,, Savelycv S.V., Fethina V.A., Veryovkin A.N., Egorov A.M., OiLlepp S.A; Solubilization and refolding of recombinant horseradish peroxidase expressed in E.coli. In : Biochemical, molecular

anil physiological aspects of plant peroxidases <,l£dr JiI|.olw,z<;\vsl<i, ll.Greppin, C.IVnel, Th.Caspar). Geneve, 199.1, p. 55-58: Ga/aryan 1С.. Urmantseva V.V., Voryovkin A.N., l;echina V.A, Peroxidase preparation from MeUicago, saliva L-t cell culture. In : Biochemical, molecular and: physiological, aspects of plant peroxidases (U.d. J.Lobarzewski, ll.Greppin, C.Penel, Th.Caspar). Geneve, 1991, p. 505-506.

Газарян VI, Г.. Егоров A.M., Peuiei илкояа И.А., Веревкии. A.lI,., фечипа 13-A. Шроксчдаза из Phellims sp.66 - новый фермент д,ля, хсмнлюмлцесц/ещшдо анализа.// В: Тезисы VII Всесоюзна симпозиума но идокснсриой. зизимологии, Москва, 1991, с. 139, ГйЗЩгИИ..И'.К« Иероксндпзы растений.//В: Биотехнология иероксидда рЖГеши) II, грибов, Итоги Пауки л Техники ) HI J11 ПИ. I'All,, р. Г>№1>Х№;клчъ т.Уб, Москва, ВШШТИ, 1992, с. 4-28.

ГпзирйИ, _ILL Молекулярная и генетическая структура

пероКг.ндаЗ./'/В: Вшлехтмппш Пероксидаз растений и грибов. Муми Науки иТехники ^ШШТИ РАН, сер. Биотехнология, т.З5. Москва, ВИНИТИ, 1,992, г/. 28-54

Газарян И.Г.. Кцм Б. Л, Досеева В..В., Всрсвкнм А.II., Егоров A.M. Физико-химические в каталитические енойства рекомбииантвой иерркевдазд хреца„ синтезируем ой, » Escherichia coll. / / Доклады AH СССР, 1992, 325(2), с. 397-Ш. ). Газарян И.Г.. Фечипа В.А., Веревкид, А.Д., Урмаидека В.В., Скрилиикоп А.10. Периксндаэа культивируемых клеток люцерны.// Доклады. АН СССР 1<Ш, 326 (I), с. 198-20,1.

1. Решетникова W. А., Газарян И. Г..' Веревкмц А. Ц., Фечш.м Ц.А., Мирошниченко Т.Г.) Егоров. A.M. Поиск . грибов - продуцентов иероксидаэы. //Микология и фитопатология 1992, 26(5), с. 383-3&7.

2. Газарян И.Г.. Чубарь Т.А., . Фсчдша . В.А., Карзанов В В. Низкотемпературная экспрессия активной пероксчдагд хрена и

. E.coli.// 'i: Тезисы V Всероссийской конференции "Пощле направления биотехнологии", Пущпно, 18-22 мая 1992 г. Москва, 1992, с.112.

13.Dosecva V.V., Gazaryan I.G.. Kim B.D., Egorov A.M. Chemituminesceiit properties of native and recombinant horseradish peroxidase produced in E.coli. //In: Abstracts of III International Symposium "Plant Peroxidases. Biochemistry and Physiology" July 10-14, 1993, Klsinore, Denmark. Kopenhagen University, 1993, N 134

14. Gazarvan l.G.. Skripnikov A.Yu., Veryovktn A.N., Fcchina V.A., Chubar T.A. Alfalfa régénérants from peroxidase superproducent cell culture. //In: Abstracts of III International Symposium "Plant Peroxidases, iiiochemistry and Physiology'- July 10-14, ИШ, Elsinore, Denmark. Kopenhagen University, 1993, N 118.

15.Г>а/агуап 1С.. Rcslietnikova I.A., Veryovkin A,N,i Ualùlin A.L., Shckhovlsova T.N,, Egorov A.M. Novel fungai pefOxUiase for assay of phenols. //In: Abstracts of III Interniitiortai Symposium "Plant Peroxidases. Biochemistry and Physiology" July 10-t4. 1993, Elslnorc, Denmark. Kopenhagen University, 1993, N 40..

• 16. Глзаряп И .Г.. PeiiicTiiiiKoha И.А„ . DepeuKttti Л.H., ФеЧина U. A., Лялюлнп А.Л., Шохонцона Т.Н. Пероксидаза гриба Phellinus tgniarius 71-31. //Доклады РАН 1993, 329(5)1 с. 120-122. : . •

17. Гпяприн_И.Р.. Скршшикои A.JO., Верепюш А.Н., Фечица В.Л.

ПсроксидаипиО статус растеннй-регсПерантоп, Полученных из сунсрпродупирукцней культуры, wictok люцерны. //Доклады РАН 1993, 331 (3), с. 3Ö4-366.- '

l&Ga/aryan I.O.. Skripnikov. A:Y«., Vcryovkin A.N., Fechina V.A., Chubar Т.Д., ligorov A.M. .Alfalfa régénérants from peroxidase superproducent cell culture. In: Plant Peroxidases: Biochemistry and • Physiology (Ed, K.G.VVelinder, S.K.Rasmusscn, C.Penei, H.Greppin). Geneve, 1993, p. .111-414.

19. Gazarvan 1.0. Heterologous expression of heme-containing peroxidases. //Plant Peroxidase Newsletter 1994, 4, p. 16-26.

20.Egorov A.M., Gazarvan l.G.. Doséeva V.V.Km B.B., Veryovkin A.N., Fechina V.A., Kapcliuch Ya.L. Horseradish peroxidase isoïyme С; Д . comparative study of native and recombinant enzyme produced by E.coli transformants.// Annals NY Acad Sei, 1994, 721, p. 73-82. .

!l.Ga/aryan 1С.. Loginov D.B., Lialuiirt A.L., Sliekhovlsova Т.Ы. Determination of phenols using various peroxidases.// Analytical Letters, I!)!M, 27 (15), p. 2917-2930.

?2.Gazaryan I.P.. Doseeva V.V., Galkin A.G., Tishkov V.I. Effect of single1 point mutations Phc41->llis and Phel43-*Glu on folding and catalytic properties of recombinant horseradish peroxidase expressed in E.co!i.//FEBS Letters 1994, 354 (It), p. 248-250.

23.Орлова M.A., Ma pectin Е.Л., Досеева В.В., Газаряи И. Г. Сравнительное изучение стабильности нативнои и рекомбипантной пероксидазы хрена под действием радиации и других инактнвируюншх факторов. // Известия РАН, сер.хим., 1994, 43 (12), с. 2230-2233.

24.Газарян И.Г., Досеева В.В., Марсева Е.А., Орлова М.Л. Изменение субстратной специфичности нативиой н рекомбипантной пероксидазы хрена под действием ионизирующего излучения.//Известия РАИ, сер.хим., 1994, 43 (12), с. 2234-2237.

25. Логинов Л .В..' Газаряя И.Г.. Досеева В .А., Галкин А.Г., Тншков В.П., Мареева Е.А., ' Орлова М.А. каталитические свойства Phe41-»IIis мутанта пероксидазы хрена, экспрессируемого в E.coli.//Известия РАН, сер.хим., 1994, 43.(11), с. 2034-2037.

26.Щеховцова Т.Н., Лялюлин А.Л., Кондратьева Е.И., Газарян И.Г.. Долманова И.Ф. Использование перокгпдаэ различного происхождения для Ьпределення фенолов.// Журнал аналитической химии, 1994, 49 (12), с. 1317-1323.

27.G?zarvan I.G.' Geneticenginccrim; of heme-enntninin;» peroxidases. //In:

• Abstracts of International Scientific Summer School "Biosensing

' Materials" July 7-13, 1994, Pushchino, Russia. Moscow, MSU, 1994, pp.

'' 9-12.

28.Gazarvan I.G.. Doseeva V.V., Galkin A.G., Kapeliuch Yu.L., Loginov D.B., Egorov A.M. . Heme catalytic properties in plant and fungal peroxidases. //In: Abstracts of ElIROBIC II "Metal ions in biological systems" Florence, Italy, August 30 - September 3, 1994. Florence, Univ of Florence, 1994, p. 140.

. 29. Oa/aryan I .G.. Doseeva V.V., Calkin A.Ce, К;цlelinch Yu.L., Egorc A.M. Clieini luminescent properties of recombinant horseradish peroxkhe aiul its mutant forms expressed in E.coli. //Abstracts of VIU t International Symposium on liiolumiuescence and Cltemiluniinescence, 5-September, 1994, Cambridge, England. Jn: J.Bioluni.Cliemilum., ISM, (5), p. 347.

30. Oayarvan I.P.. Logiiwv D.B., Doseeva V.V., Galkin A.G., Tishkov V. Catalytic properties of Phe-l 1—^11 is mutant, of horseradish peroxida: expressed in E.coli. //in: Abstracts of The Biochemical Society Meetir No.653, University of Sussex, Brighton, December 13-16, 1994. lssui witli the liiocbemist Dec 94/Jan 95, p. С, A 20.

31. Газаряп 11.Г.. Досеева В.В., Га;;кип А.Г., Тиннсов В Н., Мареева li.Л Орлова М.А. Эффект отрицательного заряда на входе в активны центр нерокемдазы хрена.,//Известия РАН, сер.хим., 1995, 44 (2), 371-37-1. .

32. Орлова М.Л., Мареена li.A., Досеева J3.В., Капслюх Ю.А., Шсачен* Л.А., Гаяаряи II Г . Коег О.А.//Известия РАН, сер.хим., 1995, А (1), с. 176-179.

33. Решетникова П.А., Г.лкин В.П., Га.чарян И Г. Воздействие ферментно! Hpci ia para нерокендазы гриба Phcllinus igniarius на лишоуглеводны комплекс березоной древесины.//Прикладная биохимия микробиология 1 »95. 31 (2), с. 204-206.

3i. Газаряп II.Г.. Решетникова И.А., Досеева В.Б., Беккер Е.Г. Выделен) и сравнительная характеристика нерокендаз гриба Phellinus igniarii (l.:l-r.) Quel.90-i и табака.// Биохимия 1995, 60 (7), с. 1017-1022.

35. Оагагуан 1.0. Current .progress in plant peroxidase research - froi Ulsinore to Vienna.//Plant Peroxidase Newsletter 1995, 6, p.16-22.

3t>. Kj,'orov A.M., Resbetnikova 1.А., Fechma V.A., Oazaryan l,( Comparative studies of plant ant' fungal peroxidases.// Annals NY Act Sci USA, 1995, 750, p. 469-472. .

37. G.\;vryan I.O.. Ash by G.A. Thornoley R.N.F., Lagriinini L.M. Anion toKuco ¡KTOXitiaie overexpressed in transgenic plants: unusual kinet properties and their application to mechanistic studies.//Ii

International Workshop on Peroxidase Biotechnology and Application, l'uschino, J one 26-30, 1995. Oral and Poster Abstracts. Moscow, Bioinfonn Services Co., 1995, p. 18.

8. Gazarvnn I.G.. Asliby G.A., Thorneley R.N.F., Lagrimini L.M. Mechanism of indole-3-acctic acid oxidation catalyzed by horseradish peroxidase, anacrobic stoj.ped-flow studies../ / In: International Workshop on Peroxidase Biotechnology and Application, l'uschino, June 26-30, 1995. Oral and Poster Abstracts. Moscow, Bioinfonn Services Co., 1995, p. 57-58.

19. Gazarvan I.G.. Lagriiiiini L.M. oxidation of indole-3-acetic acid catalyzed by tobacco peroxidase: oxygen uptake studies.// In: International Workshop on Peroxidase Biotechnology and Application, Puschino, June 26-30, 1995. Oral and Poster Abstracts. Moscow, Bioinfonn Services Co., 1995, p. 54.

¡0. Gazarvan I.P., Lagrimini L.M. The nature of tobacco anionic peroxidase . interwaction with indole-3-acctic acid (1AA), 2-niethy!-lAA and 1AA amino acid conjugates.//In: Abstracts of the 15th International Conference on Plant Growth Substances, Minneapolis, July 17-22, 1995. Minneapolis, 1995, N 157.

¡1. Гаэаряи И.Г.. Досеева B.B;, Галкин Л.Г., Тишков В.И. Получение и каталитические свойства точечных мутантоо Phe41->llis и Phel43->Glu пероксидазы хрена, экспрессируемои i Escherichia, coli.//Биохимия 1995, 60 (10), c.1555-1563. '

12. Whitham R.E., Gazarian I.G.. Tien M. Expression of fungal Mn-pcroxidasc in E.coli and refolding to yield active enzyme./ /Biochem.Biophys.Rcs.Commims 1995, 216 (3), 1013-1017.

I.G.. Lagrimini L.M., Asliby G.A., Thorneley R.N.I". Mechanism of lndole-3-acetic acid oxidation by plant peroxidases: anacrotic stopped-flow spectrophotomctric studies on horseradish and tobacco peroxidases. //Biochein J. 1996, 313 ( 2), 841-847.

l^btASMS