Пролонгированная формы цитозара на основе биосовместимых полиуретанов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

?Г6 од

2 Б ДПР 1593 АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЯ ХИМИИ И НЕФГЕХИШИ

На правах рукописи

ГРИГОРЬЕВА Майя Владимировна

ПРОЛОНГИРОВАННАЯ ООРМА ЦИТО0АРА НА ОСНОВЕ БИОСОВМЕСТИШХ ПОЛИУРЕТАНОВ

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев - 1993

РаОота выполнена в отделе биосовместимых полимеров Института химии высокомолекулярных соединений Академии наук Украины

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор Г. А. Пхакадзе

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Н. П. Дмитренко

доктор химических наук В. В. Шзвченко

Ведущее учреждение :

Институт биохимии им. А. В. Палладина АН Украины

Защита состоится " " " 1993 г. в часов

на заседании специалиэировеш-ного ученого совета Д 016,65.01 в Институте биоорганической химии и нефтехимии . АН Украины (253660, Киев, ул. Мурманская, 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии и нефтехимии АН Украины

Автореферат

Ученый секретарь

специализированного ученого совета

М. Федоряк

ОВЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Проблема предупреждения, распознавания и лечения злокачественных опухолей - одна из самых сложных в современной науке. Известно достаточно много различий в характеристиках нормальных и опухолевых клеток (высокая скорость митоза, повышенный эндоцитоз, суммарный поверхностный заряд, опухоль-специфические антигены и т.д.), однако, формы злокачественного роста весьма разнообразны , а указанные отличия непостоянны. В то же время применяемые в медицине противоопухолевые (ПО) препараты, уничтожая опухолевые клетки, почти столь же разрушительно воздействуют и на нормальные. В настоящее время, множество усилий направлены на то, чтобы повысить селективность ПО препаратов и снизить их токсичность. В связи с этим применение полимерных систем в качестве носителей ПО лекарств представляется перспективным, так как варьирование структуры полимерного носителя допускает благоприятные изменения фармакологических свойств, таких как биораспределение, проницаемость мембран, биотрансформация или фармакодинамика. Экспериментальные результаты и представления, сформулированные в ряде работ, свидетельствуют о перспективности применения биодеструктируемых в организме полиуретанов для создания пролонгированных лекарственных форм.

Поэтому задача получения новых полимерных ПО препаратов, а также их конструирование на основе известных низкомолекулярных лекарств, оказывающих при выраженном терапевтическом эффекте минимальное повреждающее действие, является актуальной.

Цель и задачи исслею вопия. Целью настоящей работы было изыскание возможности создания пролонгированной формы антилейкоз-ного препарата - цитозара (Ага-С), имеющего небольшой период полураспада, что существенно затрудняет его применение в клинике. Для этого необходимо было решить следуюшме задачи: 1. Изучить кинетические закономерности реакции взаимодействия Ara-С с фенили-§оцианатом в качестве модели формирования конъюгата пенополиуретана с Ага-С. 2. .Определить активность кислой фосфатазы и щелочной фосфатазы в организме животных при имплантации биодеструктируемых полиуретанов - потенциальных полимерных матриц для иммобилизации ПО лекарств. 3. Иммобилизовать Ага-С на биодеструктируе-мой полиуретановой матрице. 4. Изучить выход Ага-С из полимерной матрицы в гидролизующую среду в опытах in vitro. 5. Исследовать активность иммобилизованного Ага-С по отношению к ферменту-мишени

- fí -

- обратной транокрштазе HIV-l. б. Изучить БО действие иммобили-. зованного Ага-С на мышах с перевитым лейкозом L 1210.

Научная новизна роботы. Показана принципиальная возможность получения изоцианатсодерлащего конъюгата пенополиуретана с Ага-С, способного снижать обшую токсичность Ага~С и увеличивать его терапевтическую эффективность. Установлено, что по активности ферментов кислой и щелочной фссфатав можно оценивать Оиосовмести-мость полимерных имплантатов и интенсивность био деструкции. Впервые проведена иммобилизация цитозара на биосовместимых биодест-руктируемых носителях. Показано, что количество химически связанного препарата можно варьировать путем изменения соотношения между активными изоцианатными группами полиуретановой матрицы и водой. Исследованы кинетика выхода Ага-С из полимерной матрицы в гидролизуюшую среду и влияние иммобилизованного цитозара на активность обратной транскриптазы НIV-1 в опытах in vitro. Установлено, что в ходе иммобилизации цитозара его ингибируюшая активность по отношению к Ферменту-мишени не снижается и сопоставима с нативным препаратом. Показано, что при снижении общей токсичности препарата в пролонгированной форме, он эффективно препятствует развитию лейкоза, значительно увеличивая продолжительность жизни животных.

Практическая значимость работы. Проведенные исследования позволяют рекомендовать для применения в клинике в качестве депо-форм противоопухолевых лекарств препараты, полученные- на основе биодеструктируемых биосовместимых полиуретанов.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывались на сессии Совета по проблеме "Высокомолекурные соединения" при АН Украины (Киев, 1980 г.), VI Всесоюзном симпозиуме "Синте'-тические полимеры медицинского назначения" (Алма-Ата, 1983 г.), VIII Республиканской конференции по высокомолекулярным соединениям (Губежное, 1990 г.), IX Всесоюзном симпозиуме "Синтетические полимеры медицинского назначения" (Звенигород, 1991 г.), VI Украинском биохимическом съезде (Киев, 1992 г.), 3-й Европейской конференции Восток-Запад по материалам и процессам (Страсбург, 1992 г.).

Публикации. Результаты выполненных исследований изложены в 12 научных публикациях.

Структура работ Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы,. включающего 183 наименований. Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков и 7 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЕ

Во введении обоснована актуальность и определена цель работы, указаны ее научная новизна и практическая значимость, обобщены основные научные результаты.

Первая глава является обзором литературы, в котором отражены сведения о полимерах-носителях ПО лекарственных препаратов. Большое внимание уделено ПО лекарственным форма,,I пролонгированного действия на основе биодеструктируемых полимерных носителей, в которых лекарство не связано химически с полимером ("наполненные" полимеры) или же иммобилизовано на полимерной матрице (полимеры "прививочного" типа). Рассмотрены критерии биосовместимости полимерных носителей, имплантированных в организм экспериментальных животных. Отмечен недостаток информации о возможном использовании биодеструктируемых полиуретанов в качестве носителей ПО лекарств.

Во второй главе описаны объекты исследований, методика кинетических исследований, синтез изоцианатсодержащих носителей, методики определения активности ферментов - кислой и щелочной фосфатаз, обратной транскриптаэы Н1У-1. В расоте были использованы методы ИК- и УФ-спектроскопии, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), потенциометрического титрования и элементного анализа.

В третьей главе изложены экспериментальные данные и проведено их обсуждение. Поскольку как иммобилизация Ага-С, так и формирование полиуретановой матрицы связаны с реакциями изоцианатных групп, то были исследованы закономерности этих реакций в системах реагентов с монофункциональным изоцианатом: Были изучены кинетические закономерности некаталитического и катализируемого Р'е(асас). взаимодействия Лга-С с фенилизоцианатом (ФИЦ) в сопоставлении с кинетическими параметрами взаимодействия ФИЦ 'с водой - модели формирования пенополиуретана из иэоциан'атсодержащего форпо-

ЬыОор катализатора был обусловлен особенностями тонкого механизма каталитического действия Ре( асао)3 , заключающегося в пред-варителыюм алкоголизм этого хелата с образованием координационно-ненасыщенного Ре(асас)гОИ, который в дальнейшем выполняет роль активного каталитического центра и позволяет избежать протекания вторичных реакций, требующих дополнительного расхода изоцианатных групп, а, следовательно, введения больших избытков токсичного изоцианата.

Сопоставление анаморфоз, построенных в кинетических координатах простой реакции второго порядка со стехиометрическим соотношением реагентов, показало, что анаморфоза кинетической кривой некаталитической реакции <ИЩ с водой строго линейна до высоких степеней превращения изоцианата, тогда как аналогичная анаморфоза взаимодействия ФИЦ с Ага-С имеет точку перегиба, соответствующую 50 %-ному превращению изоцианата. Подобное отклонение от линейности .по-видимому, обусловлено различной реакционной способностью двух пар Функциональных групп цитозара во взаимодействии с <1ИЦ. Совпадение величины ^и константы скорости взаимодействия ФИЦ с водой подтверждает различие в реакционной способности ОН-групп цитозара, поскольку согласно ранее опубликованным данным скорости взаимодействия изоцианата с водой и первичными спиртами имеют близкие значения.

Введение в реакцию катализатора,вероятно, приводит к нивелированию реакционной способности всех ОН-групп цитозара, тогда как скорость взаимодействия ФИЦ с Шг-группой пиримидинового кольца остается практически неизменной, о чем свидетельствует участок анаморфозы после 75-78 %-ного превращения ФЩ. Наблюдаемый каталитический эффект представляется закономерным, поскольку Ге(асас)'3 селективно активирует исключительно ОН-группы гидроксилсодержаще-го реагента (табл.1).

Полноту протекания реакции и идентификацию конечного продукта взаимодействия ФИЦ с Ага-С контролировали методом ИК-спект-роскопии. Экспериментальные данные элементного анализа описанного выше продукта соответствуют теоретически рассчитанному содержанию углерода, водорода и азота. ;

Результаты кинетических исследований позволили оптимизировать условия и степень связывания цитозара с отвервдаемыми водой полиурегаиовьши форполимерами на основе дииэоцианатов и простых оксиалкиленгликолей.

Такой выбор обусловлен наличием в форполимерах реакцион-носпособных групп, позволяющих осуществить' ковалентную иммобилизацию препарата; возможностью регулирования гидрофильно-гидрофоб-

ного баланса полимерной матрицы; возможностью управления процессом связывания цитозара с носителем и скоростью высвобождения препарата.

Таблица 1

Кинетические параметры взаимодействия фенилизоцианата с цитозаром и водой

Реакция Цитозар Вода

л/(моль«с) к2. ю3, л/(моль«с) к-105, л/(моль-с)

Не каталитическая 4,2*0,2 3,2±0,1 4,710,2

Каталитическая 30.0±'1,3 4,2±0,2 7,810,4

Природа гликоля оказывает значительное влияние на прочностные, эластичные и сорбционные свойства полиуретанов и их совместимость с живыми тканями.

Выпускаемая в настоящее время полиуретановая композиция медицинского назначения (клей КЛ-3) представляет собой макродиизо-цианат на основе полиоксипропиленгликоля МЫ500 Да и ТДИ. Выбор такого гликоля определяется хорошими эластичными и прочностными свойствами отвервденной композиции, однако недостаточная гидро-фильность матрицы (см. табл.2) создает сложности при использовании этой композиции в качестве носителя лекарственных препаратов.

Поэтому в качестве гликолевой компоненты при синтезе макро-диизоцианата нами использованы блок-сополимеры полиоксиэтилен- и полшжеипропиленгликолей с различным соотношением звеньев и разной молекулярной массы (фирменное название "Лапрол"). Так,например, Лапрол 4502-2-80 обозначает гликоль с содержанием 80 % поли-океиэтиленовых звеньев, молекулярной массы 4500 Да. Свойства по- • лученных композиций На основе различных гликолей, сопоставленные с соответствующими свойствами клея КЛ-3, представлены в таб. 2

Обращает на себя внимание закономерное увеличение гидрофиль-ности отвержденной композиции с ростом ММ Лапрола и содержания оксиэтиленовых звеньев в цели олигомера. Вероятно совокупность этих факторов приводит к резкому скачку гидрофильное™ отвержденной композиции на основе Лапрола с ММ- 4500 Да, в котором содержание оксиэтиленовых звеньев выше всего на 10 % мае.

Лимитирующей стадией взаимодействия изоцианатных групп с водой является образование неустойчивой карбаминовой кислоты.

Введение Fe(acac)3 позволяет регулировать скорость этой . стадии. Установлено, что наиболее оптимальной следует считать концентрацию катализатора - 0,02 % мае., поскольку параметры ценообразования в этом случае являются удовлетворительными (время старта пены - 130 с; время потери липкости - 3 ч ; соотношение HjO /NGO(моль) 1-5,0) и обеспечивают получение стабильной пены, в которой полимерные стенки пузырьков выделяющегося газа обладают достаточной прочностью и не разрушаются под давлением 00, .

Таблица 2

Свойства отвержденных водой ПУ-композиций на основе различных гликолей. Время отверждения 24 ч при температуре 40 °С.

Полимерная Концентрация Степень набухания

основа катализатора, 7, мае. в воде, % мае.

КЛ-3 1.8 (УП 606/2) 2,1

Лапрол 1502 0,02 3,0

Лапрол 1602-2-70 0,02 13.7

Лаирол 2502-2-70 0,02 17,0

Лапрол 4502-2-80 0,02 30,4

Установлено, что при имплантации полимерный материал подвержен деструкции под влиянием жидких сред организма. Для характеристики взаимодействия полимер-ткань важные сведения дает определение активности кислой и щелочной фосфатаз. Кислая фосфатаза (КФ) является маркером лизосом, а величина ее активности может отражать как гистотоксичность полимера, так и интенсивность биодеструкции. Щелочная фосфатаза (ЩФ) отражает транспортные процессы в клетках и, следовательно, их функциональную активность.

Для биохимического определения активности КФ проводили имплантацию под капсулу почек кроликов полимерных пленок следующего состава: 1) пленки-матрицы на основе олигогликоля (ММ 4500> и то-луилендиизоцианата; 2) пленки А-10 на основе гексаметилендиизоци-аната и полидиэтиленгликольадипината (ММ 1500),с удлинителем цепи этиленглшеолем; 3) пленки д-1 на основе гексаметилеядиизоцианата и окситетраметиленгликоля (МЫ 1000), содержащие в составе основной цепи полимера природный фрагмент - Ь-фенилаланил-Ь-серин. Материалы 2) и 3) были исследованы в качестве контроля, поскольку их . биосовместимость была установлена ранее иными методами. Как видно из результатов приведенных в таблице 3 на 7-е и 14-е сутки [",¡>0.1" имплугеации пленки-матрйдн происходит достоверное, по с раз-

Таблицы 3

Активность кислой фосфатазы в гомогенатах почек кроликов (в нмоль Р^ на 1 мг белка за 1 мин ; М+гт 5-6)

Почка

Сроки после имплантации -1-

т

7 суток 14 суток | 30 суток | 90 суток I 1 год -1--н-1-,-----

Оперированная

Противоположная

Полимер - матрица 35.lt 3.1*130,21 3,5 |27, 2± 2,6|25,3± 3,3|25,4Ь 4,4

-1--,-,---

36.0± 2.9135,8± 4,0127,21 2,9|27,7± 4,1|25,21 4,2

I I I I -

- Полимерная пленка А-10 --1-----

Оперированная

Противоположная

38.2± 4,9136.1+ 4,0*|27,0± 1.9 |25.6+ 2,5l25.lt А.Л

38,7± 2,7*1 40,2+ 3,1*128,.4+ 2,0|25,5+ 3,2|28,1 + 4,5

I I I I -Полимерная пленка Д-1--1——-—■—

Оперированная

Противоположная

40,6+ 1,1*|44,2+ 6,2138, 5+ 1. 6^32.2+ 1,2|25+ 2,0

41,6+ 0,44,4± 2, 1*141,7+ 3,7*134,6+ 2,5|27,0± 1,8 1111

Примечание: активность в интактной почке - 29,0+ 2,2, в ложнооперированной - 27,3± 1,8; * - означает, что различия с контролем достоверны (р<0,05)

- в -

нению о нормой, увеличение активности фермента, в подлежащих имп-лантату участках почечной паренхимы. В дальнейшем в течение одного года после операции изменение активности КФ не отмечалось. В то же время методом культуры тканей было установлено, что данные образцы нетоксичны. Следовательно, изменение уровня КФ является . показателем отражающим биодеструкцию полимера.

Гистохимически установлено следующее распределение КФ и ЩФ в клетках, принимающих непосредственное участие в биодеструкции полимерных имплантатои: в макрофагах, фагоцитирующих полимер, наблюдался высокий уровень ЩФ (указание на активацию транспортных процессов в этих клетках); в гигантских клетках инородных тел, лизи-руоти.с полимер, КФ (указание на активность лизосом).

Следующим этапом была иммобилизация цитозара на полимерах-матрицах и исследование кинетики выхода цитозара из них.

В качестве стартовой концентрации препарата была выбрана величина 70 мг/г отвержденной композиции. Такой выбор был обусловлен тем, что при этой концентрации все реакционноспособные группы цитозара должны прореагировать с NCO-группами полимерной композиции (при их общем содержании 10% мае.). При этом остается достаточное количество изоцианэтных групп для последующего отверждения форполимера водой. Опыты показали, что уменьшение или значительное увеличение указанной концентрации приводит к неудовлетворительным результатам. Для первого случат - это невозможность регулирования скорости и величины выхода препарата из матрицы, во втором - неудовлетворительные свойства формирующегося пенополиуретана (появление тремин, неравномерность распределения пор, излишняя жесткость н пр.).

Как видно из рис. 1 максимальный выход препарата достигается' при пятикратном (по сравнению со стехиометрическим) избытке воды. При этом сохраняется приемлемая структура полимерной губки. Увеличение количества отвердителя не дает■ устойчивой пены. Такое соотношение вбды и активных изоцианатннх групп удается поддерживать при проведении процесса связывания цитозара в климокамере в условиях 100%-ной влажности.

. Изучение выхода цитозара из полимерной матрицы в опытах in vitro показало, ,что количество цитостатика б экстракте и скорость процесса его выделения, в гидролизующую среду ', определяются количеством иммобилизованного вещества, а также гидрофильностью и ММ полимера.

• В эксперименте исследовали полимерные матрицы -с ММ 1600, 2500, 4500 Да, содержащие 70 мг препарата на 1 г полимера.

л ч о Я

в

£Е

Рис. 1. Выход цитозара из полимерной матрицы в Физиологический раствор в зависимости от соотношения Н^О и полимера (Лапрол-1600).

10 12 14 16

[Ага-С], мкг/мл

В зависимости от ММ форполимера выход препарата из полимерной матрицы достигается спустя 4-8 часов (рис.2.). Причем количество выделяющегося Ага-С закономерно вышё для полимеров с низкой ММ .

10 12 14 16 18

Время, час ' Рис. 2. Выход цитозара из полймерной матрицы й физиологический раствор. 1 -Л-1600, 2 - Л-2500, 3 - 4500

При одинаковых .стартовых условиях иммобилизации цитозара и химической природе реагирующих групп;следует отметить упомянутое ранее увеличение гидрофильности 'при переходе от полимера с мм 1600 Да к полимеру с Ш 4500 Да. Следствием этого является более полное ковалентное- связывание гидрофильного Ага-С и уменьшение доли физически сорбированного препарата. Однако, по-зидимому,кинетика выхода Ага-С в большей степени определяется структурными особенностями полиуретановых матриц и прежде всего соотношением открытых и закрытых пор. ■

-lo-

te)

Рис.3. Ингибирование обратной транскриптазы HIV-1 иммобилизованным Ага-С 1 - полимер; 2 - Ага-С; 3 - полимер + Ага-С

(а) - poli A, oligo dT. Зн-dTTP'

(б) - poli rrtC, oligo dT, 3H-dGTP

- и -

Строение пенополиуретанов при одинаковой скорости выделении rasa существенно зависит" от вязкости форполимера, которая в свои очередь определяется реологическими свойствами исходного гликоля. В ряду исследуемых Лапролов вязкость увеличивается от 6000 мПа-с для Лапрола-1602-2-70 до 18000 мПа-с у Лапрола -1602-2-80. Вследствие этого, формирующаяся реносистема на основе этого оли. гогликоля характеризуется повышенной стабильностью и высокой эластичностью. Пониженная вязкость форполимеров на основе Лапро-- лов с меньшей ММ приводит к утончению стенок ячеек с газом и их разрыву, что значительно увеличивает содержание открытых пор с физически включенным цитозаром, выход которого в этих -условиях определяется скоростью диффузии в гидролитическую среду.

Очевидно, что основываясь на этих данных, нельзя однозначно судить о выходе цитозара из полимерной матрицы в организм. Учитывая, что биодеструкция наполненного полиуретана начинается с первых дней воздействия организма, можно предположить, что диффузия цитозара-и биодеструкция полимерной матрицы в организме протекают одновременно.

Поскольку установлено химическое взаимодействие цитозара с полимерным носителем, было необходимо экспериментально подтвердить сохранение основного механизма действия иммобилизованного препарата - ингибирования активности обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека HIV-1.

Было показано, что цитозар ингибирует обратную транскрипта-зу, синтезирующую транскрипт по заданной матрице (рис.3).

Блокирование синтеза полидезоксинуклеотида, наблюдаемое и двух сериях экспериментов с различными матричными затравками и предшественниками,дало основание, считать, что Лга-С влияет не: посредственно на фермент, исключая таким образом конкуренцию с нуклеозидтрифосфатами и взаимодействие с матрицей.

Экстракт из контрольных полимерных образцов (без Ara-С) н« меняет активности обратной транскриптазы, как в случае с полири-боаденозином, так и с,полирибометилцитозином в качестве матриц и, следовательно, не содержит ингибиторов.

Экстракт, полученный из полимерной матрицы с иммобилизованным Ara-С (70 иг/г полимера), обладает ингибирующей способностью, практически тэтой же как раствор нативного препарата сопоставимой концентрации.

Завершающей стадией исследования было изучение противоопухо-

левого действия иммобилизованного цитозара в опытах на экспериментальных животных с перевитым лейкозом Ь 1210.

Исследовали токсичность цитозара, иммобилизованного на полимерной матрице , и свободного цитозара, введенного одно- и многократно в одной и той же суммарной дозе мышам ВБР1. Бри этом токсический эф!ект был максимальным при введении в брюшную полость свободного .препарата в дозе 30-35 мг/кг 5 раз ежесуточно (масса животных снижалась более чем на 15 X, погибло 30 % животных) , средним - при введении свободного препарата в дозе 160 мг/кг - однократно и минимальным - при введении препарата, иммобилизованного в полимерной матрице , в той же дозе.

Bic. 4. Изменение количества лейкоцитов у мышей с лейкозом 1 12Ю с имплантатом Л-4500 ( 70 мг Ara-С на Г г полимера).

I - контроль; 2 - опыт

4 б '8 10 12 30 60 90 Время, "сут

S 2,0

к

и S

1,0

Рис. 5, Активность щелочной фосфата-аы в сыворотке крови мышей ВВА.2« а - Интактные животные; б - животные с перевитым лейкозом ь 1210; в - лейкозные животные с имплантатом; г -лейкозные животные + дробные инъекции; Л - лейкозные животные + одноразовые инъекции

При действии цитозара, иммобилизованного в полимерную матрицу ММ 1600 и 2500 Да (концентрация 70-200 мг/г, доза - 80, 200, 300, 500 и 1000 мг/кг), не получено положительных результатов. При введении цитозара в полимерную матрицу ММ 4500 Да, концентрации 70 мг/г и доза 160 мг/кг отмечено излечение 14-50 X животных. Мыши жили в течение 90 суток, после чего их забивали под эфирным наркозом. Масса животных была в пределах нормы. В течение 90 суток отмечено 3 пика повышения количества лейкоцитов в перифери-' ческой крови приблизительно в 2 раза на 11, 32 и 6б-е сутки (рис.4). К концу опыта содержание лейкоцитов в крови было в пределах физиологической нормы. В остальные сроки исследования увеличение продолжительности жизни животных было равным 53-72 %.

Одновременно с вышеописанными исследованиями мы проводили анализ сывороточной щелочной фосфатазы в крови экспериментальных животных в качестве' промежуточного контрольного показателя, так как ранее было установлено, что развитие некоторых злокачественных опухолей•коррелирует с увеличением синтеза ЩФ и повышением уровня ее активности.

На рис. 5 представлены результаты, полученные при определении активности ЩФ у пяти групп мышей ЭВА^ Уровень активности Фермента у интактных животных в среднем составлял 1,5 мккат/л (группа а). В группе (б) определяли активность ЩФ спустя сутки после перевивки лейкоза Ь 1210. Активность ЩФ у животных этой группы была увеличена на 46 % по отношению к норме. Группе (в) одновременно с перевивкой лейкоза была имплантирована полимерная матрица с иммобилизованным' цитозаром (1000 мг/кг). Установлено, что на 5-7 сутки активность ЩФ у животных этой группы практически приближается к норме. Животным двух оставшихся групп внутрибрюшинно вводили цитозар в той же дозе, что и при имплантации. Однако в Группе (г) это были дробные инъекции:2хГООмг/кг в день- Б течение 5 дней, а в группе (д) - одноразовая инъекция - 1000 мг/кг. В результате активность ЩФ снижалась на 20 % и 40 % соответственно.

Результаты проведенных экспериментов позволяют сделать заключение о возможности создания на основе биодеструкт'ируемых. .биосовместимых полиуретанов депо-фэрм антилейкозных препаратов со стойким сохранением цитостатического действия.

ВЫВОДЫ

1. Установлены кинетические закономерности некаталитических и катализируемых трис(ацетилацетонатом) железа реакций цитозара и воды с фенилизоцианатом, позволившие оптимизировать условия связывания препарата с изоцианатсодержавдми полиуретановыми матрицами.

2. Разработана рецептура водоотвервдаемых изоцианатсодержа-щих композиций и исследованы свойства полиуретанов на основе оксиалкиленгликолей различного состава и молекулярной массы.

3. Разработан метод оценки биосовместимости полимеров,основанный на определении активности фермента кислой фосфатазы в тканях экспериментальных животных. Установлено, что синтезированные полимерные матрицы обладают хорошей биосовместимостью.

4. Проведена иммобилизация цитозара на синтезированных поли-уретановых носителях. Показано, что количество химически связанного препарата можно варьировать путем изменения соотношения между активными изоцианатными группами полимерной матрицы и водой.

5. Исследованы кинетика выхода цитозара из полимерной матрицы в физиологический раствор и влияние иммобилизованного цитозара на активность .обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека HIV-1 в опытах in vitro. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в ходе иммобилизации цитозара его ингибирующая активность по отношению к ферменту-мишени не снижается и сопоставима с нативным препаратом.

6. Изучено противоопухолевое действие ., иммобилизованного цитозара с перевитым лейкозом L 1210. Показано, что при снижении общей токсичности препарата в пролонгированной форме, он эффективно препятствует развитию лейкоза, увеличивая продолжительность жизни животных по сравнению с контрольной группой.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО'ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Щукина Л В. , Довгопол II И. , Григорьева М. В. Активность кислой фосфатазы почек кроликов при субкапсулярной имплантации полиуретана // В кн. Биодесгруктирующие полимерные материалы, Киев: Нау-кова думка. - 1982. - С. 61-64.

2. Пхакадзе Г. А, Яценко В. Л. , Коломийцев А. К., Григорьева М. В. , Коноплицкая К. Л , Неумержицкий А. л. Сравнительная оценка активности фосфомоноэстераз в качестве теста для определения биосовместимости полимерных аллоимплантатов // Докл. АН УССР, сер Б. -1982. - N 6. - С. 69-71.

3. Липатова Т. Э. , Коноплицкая К. Л. , Щукина Л. В. , Григорьева М. В. Активность кислой фосфатазы в почках кроликов при имплантации различных полиуретанов // Укр. биохим. журн. - 1982. - Т. 54, N з. -С. 284-266. . '

4. Познякова'Т. Е , Григорьева М. В. , Довгопол Е И. Изменение Ферментативной активности тканей как отражение биодеструкшш полимерных имплантатов // Материалы 6 всесюзн. симп. "Синтетические полимеры медицинского назначения", Алма-Ата, 1983. -С. 149-150.

5. Рахле.вский Л. В., Григорьева М. В., Пхакадзе Г. А. Иммобилизация трипсина на полиуретановых носителях // Укр. биохим. журн. - 1991. - Т. 63, N 3. - С. 94-97.

6. Рахлевский Л. В., Григорьева М. В., Гладырь И. И. Модификация полиуретанов диизоцианатами // Матер. Республ. конфер. по высокомолекулярным соединениям. - Рубежное, 1991. С. 21.

7. Григорьева М. В., Рахлевский Л. В., Петруша Н. А. , Гладырь И. И. , Пхакадзе Г. А. Полиуретановые носители противоопухолевых препаратов// Материалы IX Всесоюзн. симп. "Синтетические полимеры медл-цинского назначения". - Звенигород, 1991. С. 20. ■ •

8. Григор' ева М. В. , Рахлевськйй .1 В. , Пхакадзе Г. 0. Бплив 1мобШзеванного цитозинарабпгазиду на лужну фосфатазу лейкозних мишей // Материали VI, Укр. бюх1м. з' 1зду. - Ки1в, 1992. - С. 116.

9. Григорьева М. В., Рахлевский Л. В. , Петруша Н. А. , Пхакадзе Г. А. Кинетические закономерности реакции цитозииарабинозида с фенили-

" зоцианатом // Укр. хим. журн. 1993. - N 4 - С. 321-325",

10. Петруша Н. А. , Григорьева М. В., Рахлевский Л В., Кулик Г. И. , Пхакадзе Г. А., Моргарт Н. В. Исследование противоопухолевого действия препаратов, иммобилизованных на полимерной матрице, у животных с опухолью // Экспериментальная онкология. -.1993.

N 3, - С. 81-83.

11. Григор'ева М.В. , Пхакадзе Т.О.. Гладир 1. I., Рахлевський Д В. 1нпб1рування эворотно! транскриптази HIV-1 1мобшвованим цито-заром. - Допов!Д1 АН УкраИни. - 1993. - N 3. - С. 139-141.

12. Pkhakactee G. , Rahlevsky L., Grlgoieva M. , Gladyr I. New one part polyurethane adhesives for medical application and antitumor drug release systems on it U The 3rd Eur. East-West Confer, on Materials and Processes. - Strasburg, France. - Nov.3-6, 1992. -P. 129-130.

, оошсатель

Подп. кпеч. # ез./з. Формату, /у// Бумага

Печ. офс. Усл. печ. л. Уз. Уч.-над. л. с, £6 . Тиражу, ЗаззУЗ ■

Киевская книжная типография научной книги. Киев, Репина, 4.