Влияние липидов и субстратов на реакции восстановления и комплексообразования цитохромов Р-450 тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

'с О I 5 й

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ им. Н. Н. СЕМЕНОВА

На правах рукописи ХАНИНА Ольга Юрьевна

УДК 577.152.1

ВЛИЯНИЕ ЛИПИДОВ И СУБСТРАТОВ НА РЕАКЦИИ ВОССТАНОВЛЕНИЯ И КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЯ ЦИТОХРОМОВ

Р-450

Специальность 02.00.04 — физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва 1990

Работа выполнена в Институте химической физики АН СССР.

Научный руководитель: доктор химических наук Р. М. Давыдов.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Г. И. Лихтенштейн; кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник С. П. Куприн.

Ведущая организация: химический факультет МГУ.

Д.002.26.01 в ИХФ АН СССР по адресу: Москва, ул. Косыгина, д. 4, ИХФ АН СССР.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики.

Защита

в

часов на заседании Специализированного совета

Автореферат разослан «

Ученый секретарь Специализированного совета д. х. н., профессор

Б. Р. ШУБ

оГ V

¡7!

1ЦИЙ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. С момента своего открытия в начале 50-х годов универсальная оксигеназа живых систем -цитохром Р-450 привлекает пристальное внимание исследователей. Цитохром Р-450 обнаружен в клетках представителей животного,. растительного и бактериального миров. Цитохром Р-450-содержащие системы участвуют в окислении как эндогенных субстратов - холестерина, стероидных гормонов, жирных кислот, так и ксенобиотиков - лекарственных веществ, пестицидов, канцерогенов, мутагенов и т.д. Несмотря на большое число работ, посвященных структуре и механизму функционирования цитохромов Р-450. в"лия~ ние субстратов и липидов на структуру восстановленного белка является в настоящее время наименее изученным вопросом. Большие возможности для изучения свойств восстановленных цитохромов Р-450 открывает исследование кинетики присоединения к белку окиси углерода и влияния на нее различных физико-химических факторов: наличия и химической природы субстратов, липидного микроокружения, поверхностно-активных веществ и т.д.

Цель работы заключалась в исследовании влияния субстратов и липидного микроокружения на физико-химические свойства восстановленной формы цитохромов Р-450 из различных источников. Конкретные задачи исследования состояли в следующем:

1) изучение кинетики реакции рекомбинации цитохромов Р-450 с окисью углерода;

2) изучение влияния субстратов типа I и липидного микроокружения на кинетику реакции цитохромов Р-450 с СО;

3) изучение влияния субстратов и липидов на реакцию восстановления цитохромов Р-450 радикалами метилвиологена.

Научная новизна работы. В работе впервые систематически изучены реакции комплексообразования СО с восстановленной формой цитохромов Р-450 из различных источников, в частности, из дрожжей Candida maltosa. Показано, что реакция присоединения СО к цитохрому Р-450 из дрожжей С. maltosa описывается однофазной кинетикой. Установлено, что при фотодиссоциации кар-боксикомплекса цитохрома Р-450 Ш-2 образуются неравновесные конформеры с повышенной реакционной способностью. На основе данных по квантовым выходам фотодиссоциации карбоксикомплек-сов и ЭПР спектроскопии цитохромов Р-450 сделан вывод о разной стереохимии низкомолекулярного лиганда в координационной сфере гемового железа (II) белков и влиянии на нее субстратов и их химического строения. Впервые изучена кинетика восстановления цитохромов Р-450 радикалами метилвиологена в растворе и в присутствии субстратов и липидов. Установлено, что эти реакции описывается двухстадийной кинетикой, что объясняется наличием в агрегатах белка двух состояний. Показано, что наличие субстратов и липидов приводит к увеличению констант скорости восстановления цитохрома Р-450.-Практическая ценность работы.

Кинетический подход,разработанный в диссертации,может использоваться для определения изоферментного состава препара-

тов цитохрома P-450. Результаты работы следует учитывать при изучении процессов активации молекулярного кислорода в ходе монооксигеназных реакций. Результаты также могут быть полезны для понимания превращений, происходящих в активном центре цитохрома Р-450 в процессе ферментативного гидроксилирования.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на конкурсе научных работ ИХФ АН СССР (1985г.), на Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и охрана внутренней среды человека". Москва (1985г.), на Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и охрана окружающей среды", Новосибирск (1987г.), на Международной конференции "Свободные радикалы в биологии и медицине", София (1988г.), на Всесоюзной конференции "Цитох-ром Р-450 и модификация макромолекул", Ялта (1989г.).

Публикации. Ш материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена ца 125 страницах машинописного текста, содержит 26 рисунков и 15 таблиц. Библиография включает 137 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В Главе 1 приведен обзор советских и зарубежных исследований по строению и механизму действия монооксигеназных систем. Рассмотрены современные представления о физико-химических свойствах, структуре и механизме функционирования ключевого компонента монооксигеназы - цитохрома Р-450.

Глава 2 посвящена материалам и методам исследований. В этой главе описаны основные методы исследований и используемые препараты. Кинетику реакции ферроцитохромов Р-450 с СО исследо-

вали методами импульсного фотолиза и остановленного потока. За реакцией следили по изменению оптической плотности системы на длине волны 450нм. В. опытах с применением установки импульсного фотолиза реакцию запускали путем фотодиссоциации карбоксикомп-лекса цитохрома (Р-450-С0) коротким мощным световым испульсом (энергия вспышки 70-200 дж, длительность светового импульса 50/и В заключительной части главы приведена программа, разработанная для обработки результатов кинетических измерений на мирко-ЭВМ "Электроника ДЗ-28".

Глава 3 "КИНЕТИКА РЕАКЦИИ ПРИСОЕДИНЕНИЯ СО К ЦИТОХРОЫАМ

Р-450 ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ИСТОЧНИКОВ". В этой главе изложены результаты исследований по реакции комплексообраэования СО с восстановленными цитохромами Р-450 и» митохондрий коры надпочечников быка, дрожжей С. maltosa и микросом печени кролика.

Реакцию связывания СО о восстановленным цитохромом Р-450 из митохондрий коры надпочечников исследовали методом остановленного потока и методом импульсного фотолиза. Кинетические параметры процесса не зависели от способа его регистрации. Фотодиссоциация карбоксикомплеса ферроцитохрома Р-45С^сс характеризуется малым квантовым выходом. <0,1, поэтому основная часть кинетических измерений проводилась на установке остановленного потока. Реакция комплексообраэования СО с цитохромом Р-45%^. описывается одностадийной кинетикой второго порядка с k-2,5í0,3xl0 Ы с (15*С, рН-7,4).

Эксперименты по связыванию СО цитохромом Р-450 из дрожжей Candida maltosa проводили на двух препаратах: цитохроме Р-450, выделенном из дрожжевых культур, выращенных на п-дека-не (Р-450 С-10), и, выращгнных на n-гексадекане (Р-450 С-16).

л

Реакция комплексообразования Р-450 С-16 с СО описывается одностадийной кинетикой второго порядка с константой скорости 6 -{ -I

к-0,27+0,4x10 М с (рН-7,4,5 С). Присоединение СО к цитохрому Р-450 С-10 осуществляется в две стадии с константами скорости к^-1,3x10 Меи ^-1,5x10 М с (рН-7,4; 5 С). Вклад быстрой стадии в суммарную кинетику составляет 40Х. Веса стадий не зависят от температуры и концентрации окиси углерода. Двухстадийный характер кинетики обусловлен присутствием в образце двух изо-форм фермента, которые были изолированы и охарактеризованы (Аветисова, 1986). В частности, было установлено, что молекулярный вес одной изоформы равен 67кДа, другой - БОкДа. Реакция с СО каждой из изолированных изоформ дрожжевого цитохрома-Р-450 С-10 описывалась одностадийной кинетикой второго порядка. Значения констант скорости присоединения СО к выделенным иэоформам совпадали с измеренными константами для суммарной фракции белка Результаты кинетических исследований по комп-лексообразованию цитохрома Р-450 С-10 с СО показали, что кинетические параметры этого процесса могут использоваться в качестве простого и чувствительного теста для определения изоферментного состава препарата.

В отличие от двух предыдущих препаратов цитохрома Р-450, комплексообразование злектрофоретически гомогенного цитохрома Р-450 Ж-2 из микросом печени кролика с СО описывается сложной, многостадийной кинетикой. В условиях избытка СО кинетика рекомбинации' этого белка с СО может быть аппроксимирована суммой 3-х экспонент. В таблице 1 приведены константы скорости второго порядка и веса отдельных стадий. .

к

- б -

Таблица 1. Кинетические параметры реакции рекомбинации цитохрома Р-450 М-2 с СО.

[СО] ,м ? клх10 Х'а1 6 к.хЮ -1 М с Рд(7.) к3х105 М-'е'

6. 10 1.3 50 2,5 40 2.8 10

•ч 2.10 1,4 45 2.7 37 3,0 18

7. 1.5 35 2,8 42 3.1 23

2. Ю"-*" 1.4 30 . 2,8 43 3.1 25

7.10*е 1.5 25 2.4 37 3.2 32

При уменьшении концентрации СО вес быстрой стадии (Р^) падает, а медленной увеличивается. Бес второй стадии (%)

практически не зависит от СО. При запуске реакции методом остановленного потока, т.е. путем смешивания растворов белка и СО, присоединение СО к восстановленному цитохрому Р-450 ЛЫ-2 описывается двухфазной кинетикой с бимолекулярными константами

е -I -I 5 -I

скорости к^ - 2,5x10 М с и к^ -2,8x10 М с

(рН-7,4;15°С). Эти константы по величине практически совпадают со значениями к^ и ку в импульсно-фотолитических экспериментах. Вес медленной стадии возрос до 502. Наличие быстрой стадии

7 -1 -I

с константой скорости 1,3x10 М с в кинетике рекомбинации белка с СО (табл. 1) в работе объясняется возникновением при фотодиссоциации'карбоксикомплекса ферроцитохрома Р-450 ЛМ-2 неравновесного конформера с повышенной реакционной способностью (схема 1)'.

{ргс0) АО & flPi~ÍO) ■ М-Ъ НО^Щ-со)

(Pz-CO) p¿ (Pz-СЛ) Схема 1

Г(Р3-СО)] « [(Pi-CO)]

Согласно схеме 1 при фотодиосоциации конформера (1^-СО) образуется стабильный конформер Р^, относительное содержание которого определяется весом второй стадии реакции. При фотодиссоциации

конформера (Е-СО) возникает нестабильный, короткоживущий конфор-

* 7 -i-i

мер P¿c повышенной реакционной способностью (к^- 1,3x10 М с), .

который релаксирует к состоянию ^ с константой скорости Л -4Б0с В рамках приведенной схемы в растворе восстановленного белка существуют два равновесных конформера , и ^ , а в растворе -карбоксикомплекса белка - два равновесных конформера (3^-СО) и (1£-СО)

Тот факт, что на относительное содержание конформера %не влияют ни комплексообрааование с СО, ни температура, позволяет предположить, что равновесие между этим конформером и остальными конформерами и ^) устанавливается весьма медленно. Возможной причиной медленного перехода между конформерами Р^ и Pj может быть различное агрегационное состояние белка. Известно, что в водном растворе очищенного цитохрома Р-450 образуются агрегаты, содержащие по 6-9 белковых молекул. Агрегация может оказывать влияние как на конформацию белка, так и на доступность простеги-ческой группы для молекул окиси углерода Кроме того, на реакцию с СО может оказывать влияние и относительное расположение молекул белка в агрегате (внутри агрегата или на его поверхности). Добавление детергента Тритона N-101(0,22), который вызывает мономери-зацию белка, приводит к сокращению числа стадий реакции рекомбинации цитохрома Р-450 М-2 с СО до 2-х. Константы скорости второ-

- 9 -

е 5 -1-1

го порядка этих реакций равны 3.7x10 М с (60г) и 5x10 М с .

Реакция присоединения СО к ферроцитохрому Р^450 ЛМ-4 из микросом печени кролика описывается двухстадийной кинетикой второго порядка. Веса и константы скорости отдельных стадий приведены в табл. 2. Таблица 2. Кинетические параметры реакции присоединения СО

к цитохромам Р-450, р№-7,4, 0,05 М Иа-фосф. буфер. 15°С.

Белок

Источник выделения

-i -i к.М с Р Z

Р-450$сс Митохондрии коры

надпочечников быка Р-450 С-16 Дрожжи С. maltosa Р-450 С-10 Дрожжи С. maltosa 67кДа

50кДа

Р-450 ЛИ-2 Микросомы печени кролика

Р-450 ЛМ-4 Микросомы печени кролика

2.5 - 0,3x10

2.7 ± 0.3x10* 1.3 i 0,3x10е 1,5 ± 0,2х105 1.5 i 0,6xl0f(40)

2.8 i 0,4x10^(45)

3.1 ± 0,3x10^(23) 1.8 ± О.ШО^бб)

2.2 i 0,3x10*

Таким образом, полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что в гомогенных препаратах восстановленных цитох-ромов р-450 из надпочечников быка и дрожжей С. naltosa преобладает одна форма белка, а в препаратах микросомальных цитохромов присутствует несколько конформеров, на равновесие между которыми существенное влияние оказывает присоединение молекул СО к гемовому железу.

Другой важный результат заключается в том, что, несмотря на сходное строение активных центров цитохромов Р-450 из различных источников, константы скорости присоединения СО к гемовому железу белков заметно отличаются. Одной из возможных причин этих различий может быть влияние белкового микроокружения и пятого аксиального лиганда на стереохимию молекулы СО в координационной сфере гемо-вого железа. С этим предположением согласуется результаты исследований квантовых выходов фотодиссоциации карбоксицитохромов Р-450 (ф ) и ЭПР спектроскопии нитрозильных комплексов цитохромов. Было обнаружено,что значения квантовых выходов фотодиссоциации карбокси-комплексов различных цитохромов Р-450 заметно отличаются между собой. Максимальный квантовый выход наблюдается для микросомального цитохрома Р-450 JM-2 -0,5, для цитохрома Р-450 из дрожжей С. maltosa § =. 0.1, для цитохромов Р-450 и Р-450 JM-4 § =. 0,1-0,2.

В соответствии с литературными данными (Li, Spiro, 1987) для карбоксикомплексов гемсодержащих белков существует связь между частотой валентных колебаний связи C-0(¿) и конфигурацией связи Fe-C-0. Для линейной конфигурации связи Fe-C-0 равно 1965-1970см . Если связь Fe-C-0 имеет нелинейную конфигурацию.^ 1950-1940см . Измеряя квантовые выходы фотодиссоциации карбоксикомплексов цитохромов Р-450, а также квантовые выходы фотодиссоциации других гембелков и модельных соединений, мы обнаружили корреляцию между квантовым выходом фотодиссоциации и частотой валентных колебаний связи С-0, связанного с гемовым железом (11). Квантовый выход фотодиссоциации связи Fe-C-0 уменьшается при увеличении ^(рис. 1).

Рис. 1 Зависимость -lg $ от частоты валентных колебаний связи Fe-C-О для различных гемопротеидов.

Различия в значениях квантовых выходов фотодиссоциации кар-боксикомплексов, так не как и различия частот валентных колебаний исследуемых цитохромов Р-450, объясняется разной стереохимией связи Fe-C-О. Предполагается, что в комплексе СО с цитохромами Р-45С^ и Р-450 JM-4 конфигурация сузязи Fe-C-О близка к линейной, а в карбоксицитохромах Р-450 ЛМ-2 и Р-450 из дрожжей угол Fe-C-0 меньше 180°.

С данными по зависимости квантовых выходов от ^ согласуется результаты исследований нитрозильных комплексов цитохрома Р-450 методом ЭПР.

На рис.2 представлен типичный спектр ЭПР нитрозильного комплекса цитохрома Р-450. Значения g-фекторов и константы СТС для некоторых нитрозильных комплексов цитохромов Р-450 приведены в табл. 3.

Рис. 2. Спектр ЭПР нитрозильного комплекса цитохрома Р-450-ЛМ-2. Т-77К.

Таблица 3. Значения г-факторов и константы СТС

нитрозильного комплекса цитохрома Р-450 ЛМ-2.

Белок-N0 ех кг А2

Р-450сдм 2,073 2,009 1.976 19,2

Р-4505сс 2.071 2,001 1,962 22

Р-450 ЛМ-2 2,067 2,001 1,968 20

Различия в значениях е-факторов и А^ сигналов ЭПР комплексов цитохромов Р-450 с N0 обусловлены разным расположением молекулы N0 относительно железа, которое влияет на & -связь между ]^орбиталями N0 и д или д орбиталями железа.

Таким образом, разная стереохимия связи Ге-лиганд в активном центре белков является, по всей видимости, одной из причин различий

е константах скорости присоединения окиси углерода к гемовому железу различных цитохромов Р-450. Другая причина различий связана с разной доступностью гема исследуемых ферментов для молекул низкомолекулярного лиганда.

Глава 4. ВЛИЯНИЕ СУБСТРАТОВ И ЛИПИДОВ НА РЕАКЦИЮ КОМПЛЕКСО-0БРА30ВАНИЯ ФЕРРОЦИТОХРОМОВ Р-450 с СО. Эта глава посвящгна изучению влияния субстратов и липидов на спектральные свойства восстановленных цитохромов Р-450 из надпочечников и микросом печени и кинетику их взаимодействия с СО.

В табл.4 представлены данные по влиянию холестерина (X). 22Й -гидроксихолестерина (ГХ). 20Я,22Г?-дигидроксихолеетерина (ДГХ) на константы скорости реакции цитохрома Р-450 с СО и квантовые выходы фотодиссоциации его карбоксикомплекса. Видно, что действие субстратов зависит от их химического строения: холестерин не оказывает заметного влияния на константы скорости присоединения СО. присутствие остальных исследуемых субстратов существенно уменьшает величину констант. Квантовые выходы фотодиссоциации карбоксикомплексов заметно возрастают в присутствии субстратов.

Таблица 4. Влияние субстратов на кинетические параметры реакции

присоединения СО к цитохрому Р-450 и квантовый выход фотодиссоциации его карбоксикомплекса, рН-7,4", Т-20*С.

Добавки

ГХ

ДГХ

X

г

2.5 * 0.4X10 2,0 - 0,3x10^" 1,0 ± 0,3x10* 0,5 ± 0.2x10*

0.1 0.4 0.3 0.3

Подобное действие оказывает присоединение камфоры к бактериальному цитохрому Р-450 из P. putida (Peterson, 1974). Константа скорости комплексообразова

а квантовый выход фотодиссоциации карбоксикомплекса возрастает от 0,06 до 1. Изменение констант скорости присоединения СО и квантовых выходов фотодиссоциации цитохромов Р-450 в присутствии субстратов можно объяснить как непосредственным действием субстрата на конфигурацию связи Fe-C-О, так и опосредованным, через белковую глобулу, в результате которого могут происходить структурные изменения в области "гемового кармана".

Добавление субстратов типа 1 (метфенетамин, бензфетамгаг, гексобарбитал) к растворам восстановленного микросомального цитохрома Р-450 JM-2 приводит к уменьшению числа стадий в кинетике рекомбинации этого белка с СО до двух и увеличению квантового выхода фотодиссоциации в 1,5 раза. В присутствии субстратов, в отличие от чистого препарата цитохрома, кинетика процесса не зависит от способа его запуска (методом остановленного потока и методом импульсного фотолиза). Константы скорости присоединения СО и квантовые выходы фотодиссоциации цитохром Р-450 JM-2 в присутствии субстратов приведены в таблице 5.

&1ЛО установлено, что субстраты типа 1 практически не влияют на спектры кругового дихроизма ферроцитохрома Р-450 ЛМ-2 и его карбоксикомплекса в области полосы Соре и ультрафиолетовой области. Присутствие субстратов не приводит также к изменениям спектров ЭПР нитрозильных комплексов цитохрома Р-450 JM-2.

присутствии камфоры уменьшается

- 14 -

Таблица 5. Влияние субстратов на кинетические параметры

реакции присоединения СО к цитохрому Р-450 ЛМ-2 и квантовый выход фотодиссоциации карбоксицитохрома Р-450 ЛМ-2. рН-7,4; Т-15*С

Добавки

- -73 к, М с (Р%)

§

1.5 г 1.0x10 (40) 2.8 £ 0,6x10^(45) 3,1 + 0.4x10^(23)

0.5

Метфенегамин

3.5 ± 0.7x10 (60) 5,7 £ 0.5x105

0.7

Бензфетамин

С

2.9 2 0,6x10 ( 55) 5.0 ± 0,5x10^"

0.7

Гексобарбитал

{

5.2 ± 0.7x10 (63) 0.15 ± 0.03x10^

0.8

Исчезновение быстрой стадии с константой скорости 1,5x1 о' М 'с' в реакции рекомбинации цитохрома Р-450 ЛМ-2 с СО в присутствии субстратов типа 1 в рамках предложенной выше схемы можно объяснить стабилизирующим действием субстрата на кон-формер (1^-С0) , т.е. в присутствии субстрата равновесие (£-СО) ^ (^-СО) смещается вправо. С таким объяснением согласуется стабилизирующее влияние субстратов типа 1 на кислородные комплексы р-450-0д : в присутствии гексобарбитала время жизни кислородного комплекса цитохрома Р-450 при 25°С увеличивается

от 2 до 20 мин., а переход комплекса Р-450 ЛМ-2-Ю замедляется в 100 раз. .

Совокупность этих данных позволяет заключить, что присоединение субстратов типа 1 к субстрат-связывающему центру фермента оказывает стабилизирующее действие на некоторые конфор'меры восстановленного цитохрома Р-450 ЛМ-2, но слабо влияет на стереохимию активного центра и белковой глобулы конформеров (1^-СО) и (%-СО).

Данные по влиянию нафталина, антрацена, 7,8-бензофлавона на комплексообразование СО с микросомальным цитохромом Р-450 Ш-4 отражено в таблице 6. В присутствии субстратов число стадий в кинетике реакции цитохрома Р-450 ЛМ-4 с СО уменьшается-— до одной. Присоединение нафталина к белку практически не влияет на кинетические параметры реакции рекомбинации и квантовый выход фотодиссоциации карбоксикомплекса. Наличие в области активного центра антрацена приводит в 20-кратному ускорению реакции присоединения СО к цитохрому Р-450 ЛМ-4, но не влияет на квантовый выход фотодиссоциации комплекса белка. Напротив, бензо-флавон сильно замедляет реакцию цитохрома Р-450 ЛМ-4 с СО и приводит к увеличению квантового выхода фотодиссоциации комплекса в 10 раз. Отсутствие второй стадии в реакции СО с фермент-субстратным комплексом можно объяснить тем, что присоединение субстрата к субстрат-связывающим центрам фермента смешает равновесие между- конформерами восстановленного цитохрома Р-450 ЛМ-4 в сторону более реакционноспособного.

Увеличение квантового выхода при фотодиссоциации Р-450-С0 в ' присутствии бензофлавона, по-видимому, является следствием искажения линейной конфигурации связи Ге-С-О, которое может возникнуть в результате непосредственного действия этого субстрата на стереохимию связанного СО (Рис.3).

Таблица 6. Влияние субстратов на кинетические параметры реакции рекомбинации цитохрома Р-450 ЛМ-4 и квантовый выход фотодиссоциации его карбоксикомплекса рН-7,4. Т-15°С.

Добавки

-4-1 к. М с

§

1.8 г 0.4x10 2.2 1 0,2x10*

0,2

Нафталин

2,1 ± 0,4X10"

0,1

Антрацен 4,9 ± 0,5x10 0.1

7,8-бензофлавон 0.21 ± 0,04x10^ 1,0

Со стерическими затруднениями, создаваемыми бензофлавоном, по-видимому, связано сильное понижение константы скорости присоединения СО к гемовому железу. Низкий квантовый выход фотодиссоциации карбоксикомплексов Р-450 ЛМ-4 в присутствии нафталина и антрацена указывает на слабое влияние этих субстратов на геометрию связи Ре-С-О. Однако, в отличие от нафталина, антрацен вызывает сильное ускорение изучаемой реакции. Возможной причиной этого являются структурные изменения в области "гемо-вого кармана", индуцируемые антраценом, в частности, изменение связи между железом и тиолатным аксиальным лигандом. Различное действие нафталина и антрацена может быть обусловлено как разными геометрическими размерами этих субстратов, так и разным — расположением центров присоединения этих субстратов в молекуле фермента.

В заключительной части этой главы излагаются результаты исследований по влиянию реконструкции цитохромов Р-450 ЛМ-2 и Р-в липосомы из различных липидов. Использовались следующие липидные препараты: фосфатидилхолин (ФХ), дипальмитоилфос-фатидилхолин (Д1ЙХ), смешанная фракция липидов, экстрагированных из микросом печени кролика (СМЛ) и кардиолигош. Установлено, что реконструкция цитохром Р-450 в липидные везикулы из фосфатидилхолина и кардиолипина практически не влияют на константу скорости присоединения СО к гемовому железу и квантовый выход фотодиссоциации его карбоксикомплекса Липидное микроокружение Р-4505сс слабо влияет на спектры ЗПР его нитрозильного комплекса

Реакция СО с ферроцитохромом Р-450 ЛМ-2, встроенным в липосомы, описывается сложной 2-3-х-фазной кинетикой (Табл.7).

Габлица 7. Кинетические параметры реакции рекомбинации СО с

цитохромом Р-450 ЛМ-2, встроенным в липосомы, рН-7,4, Т-15®.

Добавки М М'(рЛ) §

240 ( 35) 80 (42) 14 (23) 0.4

Протеолипосомье

ФХ 1300 ( 45) 220 (21) 25 (33) 0,2

СМЛ 670 (61) 220 ( 39) — 0,2

ДПФХ 310 (30) 70 (41) 10 (29) 0.4

Из табл.7 видно, что липидное микроокружение влияет на реакционную способность восстановленного цитохрома Р-450, причем величина эффекта существенно зависит от природы липида. Наиболее сильное влияние оказывают фосфатидилхолин и микросомальные липиды, ДПФХ не приводит к заметным изменениям в кинетике процесса. Обнаруженное влияние природы липидов на взаимодействие восстановленного белка с СО коррелирует с их действием на ферментативную активность (Уваров ЕЮ, 1984).

Встраивание белка в СШ1 приводит к некоторым изменениям спектров ЭПР нитрозильных комплексов цитохрома Р-450 ЛМ-2: изменяется форма спектров и смепшгся ехи е^компоненты (рис.4).

Данные ЭПР спектроскопии спин-меченного белка указывают на достаточно большие структурные изменения, происходящие в цитох-роме Р-450 при встраивании в липосомы. Исследования спектров ЭПР спин-меченного цитохрома Р-450 ЛМ-2 (малеимидный нитроке ильный радикал ковалентно связывали с цистеином-152) показали.

что расстояние между нитроксильной группой и гемовым железом, которое составляет 17А в изолированном белке, увеличивается до 23А в белке, встроенном в липосомы.

Рис. 4. Спектр ЭПР нитро-зильного комплекса цито-j хрома Р-450 ЛМ-2, встро-' енного в везикулы СИЛ. Т-77К

g* 2.061

8* 2001

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что присоединение субстратов и липидное микроокружение могут оказывать заметное влияние на структуру и реакционную способность восстановленных цитохромов Р-450.

Глава 5. ВЛИЯНИЕ СУБСТРАТОВ И ЛШОДНОГО ОКРУЖЕНИЯ НА КИНЕТИКУ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ЦИТОХРОМОВ Р-450 РАДИКАЛАМИ МЕТИЛВИОЛОГЕ-НА". В этой главе изложены результаты исследований по кинетике восстановления цитохромов Р-45(^ из митохондрий и микросомаль-ного цитохрома Р-450 ЛМ-2 радикалами метилвиологена. Генерацию радикала метилвиологена( МВ) проводили фотохимически:

Эо— Эо*—• Эо5

3 1 * ■»

Эо + НАДН—Эо + НАД + Н (Эо - зозин)

Эо + МВ*—МВ++ Эо

За образованием восстановленного белка следили по возникновению его карбоксикомплекса на длине волны 450 нм, за исчезно-

векием радикала - по изменению оптической плотности в области б02нм. Установлено, что восстановление цитохромов Р-450 Ж-2 и Р-450зсс описывается двухстадийной кинетикой. Беса быстрой и медленной стадий не зависят от концентрации реагентов.

Характерной особенностью реакции восстановления цитохромов Р-450 радикалом МБ является тот факт, что константы скорости исчезновения радикала примерно в 5 раз превышают константы скорости образования восстановленной формы белка (при восстановлении пероксидазы и цитохрома с исчезновение радикала и образование восстановленной формы гемопротеидов происходят симбатно). Предлагается схема, согласно которой радикал метил-виологена присоединяется к белку с образованием промежуточного комплекса, в котором осуществляется перенос электронов на гемо-вое железо. Добавление субстратов приводит к 2-3-х-кратному увеличению констант скорости восстановления. Реконструкция цитохрома Р-450 ЛМ-2 в везикулы микросомальных липидов приводит к значительному ускорению реакции( табл. 8). Действие липидов усиливается при добавлении субстратов.

Таблица 8. Кинетические параметры реакции восстановления

цитохрома Р-450 ЛМ-2 радикалом метилвиологена, рН-7,4; Т-15*.

Добавки 7^1, С*

-I

2.6

32

0,5 1.1 1.4

Метфенетамин 4,5 Лкпосокы СИЛ 19.3 Эмульген 913 9,1

41

63

Двухстадийный характер кинетики восстановления объясняется существованием агрегатов цитохрома Р-450, в которых белок может находиться в состояниях, различающихся по доступности гема для . восстановителя (внутри агрегата или на поверхности). Это подтверждается результатами опытов с неионным детергентом Змульге-ном 913,добавление которого приводит к диссоциации олигомеров цитохрома Р-450 на мономера Исследование кинетики восстановления белка в присутствии 0,2% Эмульгена 913-показало, что диссоциация олигомеров приводит к сокращению числа стадий реакции до одной и увеличению константы скорости реакции восстановления.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что кинетика присоединения СО к восстановленным цитохромам Р-540 существенно зависит от источника их выделения. Комплексообразование СО с ферроцитохромами Р-450 из митохондрий коры надпочечников быка и Р-450 из дрожжей С. mi tosa описывается однофазной кинетикой, а с микромосальными цитохромами Р-450 ЛМ-2 и Р-450 ЛМ-4

двух-трехфазной кинетикой. Многостадийный характер кинетики объясняется наличием в растворе ферроцитохромов Р-450 ЛМ-2 и Р-450 ЛМ-4 нескольких конформеров с разной реакционной способностью по отношению к СО.

2. Показано, что при фотодиссоциации карбоксикомплекса микросомального цитохрома Р-450 ЛМ-2 образуется неравновесный

конформер о повышенной реакционной способностью.

3. Для карбоксикомплексов цитохромов Р-450 из различных источников установлено наличие корреляции между квантовым выходом фотодиссоциации и величиной валентных колебаний связи Ге-С-О, обусловленной разной стереохимией молекул СО в координационной сфере гемового железа.

4. Показано, что субстраты типа 1 влияет на кинетические параметры реакции комплексообразования СО с цитохромами Р-450 из микросом печени и митохондрий надпочечников и на стереохимию связи Ге-С-О.

5. Показано, что липидное микроокружение может оказывать сильное влияние на кинетику присоединения СО к микросомальным цитохромам Р-450 и стереохимию N0 в координационной сфере генового »глеза метадлопротеидов. Результаты ЭПР спектроскопии спин-меченного цитохрома Р-450 ЛЫ-2 и нитрозильного комплекса фермента свидетельствуют о заметном влиянии микросомальных липидов на конформацюо белка и структуру его активного центра.

6. Показано, что реакция восстановления цитохромов Р-450 ЛМ-2 и Р-450^£с радикалами метилвиологена описывается суммой двух экспонент. Двухфазный характер кинетики восстановления указывает на наличие в растворах этих белков двух конформеров с различной реакционной способностью. Связывание субстратов и встраивание белка в липосомы приводят к ускорению реакции восстановления.

Основные результаты диссертации изложены в работах:

1. Давыдов Р.М. Ханина О.Ю., Ягофаров С., Уваров ЕЕ,

- 23 -

Арачков А. И. - Влияние липидов и субстратов на кинетику комплексообразования ферроцитохрома Р-450 с СО// Биохимия. -1986. -Т. 51. -С. 125-129.

2. Ханина О. К1 , Уваров Е Ю., Давыдов Р. М. - Влияние липидов на рекомбинацию с СО ферроцитохрома Р-450//Биофизика.-1987. -Т. 32.

- С. 686-687.

3. Davydov R М., Khan i па 0. Yu. and Uvarov V. YU. - Effect of Lipids and Substrats on the Properties of Microsome Liver Ferrous Cytochrome P-450 LM-2//In: Biochemistry, Biophysics and Induction of Cytochrome P-450. -1985. -Budapest.- P.74-79.

■ 4. Давыдов P.M., Ханина 0.KL, Уваров ЕЮ. - Влияние субстратов типа 1 и лилидного микроокружения на свойства -восстановленного цитохрома Р-450 ЛМ-2//Тезисы Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и охрана внутренней среды человека.

- Москва,- 1985. С.20.

5. Ханина О. КИ. Кузнецова Г. П.. Давыдов Р. М., - Влияние липидов на реакционную способность восстановленного цитохрома Р-450//Тезисы Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и охрана окружающей среды". - Новосибирск. - 1987. - С. 87.

6. Давыдов Р.М., Уваров Е Ю. .Ханина 0. К1, Тимофеев RE-Исследование методом ЭПР влияния липидного микроокружения на -. цитохром Р-450 ЛМ-2//Тезисы Международной конференции "Свободные радикалы в боилогии и медицине".-Софм.-1988.-С.

7. Ханина 0.1й .Бандт Д., Давыдов P.M. - Восстановление цитохрома Р-450 радикалами метилвиологена//Тезисы Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и модификация макромолекул". -1989.- Ялта, - С. 113-114.