Выявление углевод-связывающего центра в молекуле α-химотрипсина и его роль в регуляции свойств фермента в системе обращенных мицелл тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

ВЫЯВЛЕНИЕ УГЛЕВОД-СВЯЗЫ8АЮЩЕГО ЦЕНТРА в молекуле ОС-ХИМОТРИПСИНА И ЕГО роль в регуляции свойств

ФЕРМЕНТА в СИСТЕМЕ ОБРАЩЕННЫХ мицелл (02.00.15 - химическая кинетика и катализ)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА - 1996 ,

Работа выполнена на кафедре химической экзимологии Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научные руководители: доктор химических наук, профессор Н.Л. Клячко доктор химических наук, профессор A.B. Левашов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Н.К. Наградова доктор химических наук, профессор И.А. Ямсков

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Защита состоится »22- октября 1996 г. в 16.00 час на заседании диссертационного совета Д.053.05.76 по химическим наукам при Химическом факультете МГУ по адресу: 119839, ГСП, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан , "_2о" сентября 1996 года.

Ученый секретарь диссер тационного совета,

кандидат химических наук '

характеристика работы

Актуальность проблемы. Классическая энзимология - это энзимология водных сред. Большинство работ в этой области, касающихся структуры активных центров и выяснения физико-химических механизмов биокатализа, ;; были выполнены с высокоочищенными препаратами ферментов, выделенных из природных объектов. Однако, при использовании высокоочищенных препаратов ферментов естественно возникает вопрос: насколько свойства ферментов, наблюдаемые in vitro, адекватно коррелируют с условиями их функционирования in vivo. Сейчас стало очевидным, что местонахождение ферментов в клетке играет существенную роль в регуляции их каталитических функций и способности участвовать в клеточном метаболизме. Так, множество ферментов, если не большинство, -окализованы на поверхности биологических мембран или внутри них. Доже а-химотрипсин, считавшийся долгое время свободно-диффундирусмым ферментом, функционирует (А.М.Уголев, 1972) в прочно адсорбированном состоянии на щеточной кайме энтероцитов (рис.1). Немало ферментов находятся в составе комплексов с мзкромолекулярными компонентами клеток, такими как белки и полисахариды.

Относительно недавно было установлено, что мно ие ферменты содержат в своем составе углеводы, т.е. являются гликопротеинами. Особенности поведения гликопротеинов обусловлены наличием на их поверхности углеводных фрагментов. Ус.ановпено, в частности, что именно благодаря олигосахаридным фрагментам гликолротеины проявляют способность к олигемеризации; гликозилирование необходимо белкам для взаимодействия с биомембраной и стабильности образующегося комплекса.

В то же время, определенная ограниченность в понимании роли небелковых компонентов в биокатализе в немалой степени обусловлена тем, что в процессе очистки ферменты теряют свое природное

окружение, и изучение таких препаратов в водной среде зачастую не позволяет выявить механизмы регуляции каталитической активности и надмолекулярной cipyKiypu /л vivo.

Гликокаликс

>ерменты

Благодаря

Липидная мембрана

использованию систем обращенных мицелл,

о

Рис. 1. Схема мембранного пищеварения.

моделирующих

природное биомембранное окружение ферментов in vivo, в качестве среды для ферментативных реакций стало возможным выявлять функциональные особенности надмолекулярной структуры ферментов, обнаруживать отличия в поведении мембранных и немембранных форм белка. Значительный прогресс, достигнутый в понимании молекулярных процессов, происходящих в обращенных мицеллах, и причин того или иного поведения белков в них, делает весьма перспективным использование этой системы для выявления и изучения различий в свойствах разных форм фермонтсз.

Ц§яью_работы явилось изучение влияния углеводных

фрагментов на свойства гликопротеинов. То обстоятельство, что гликопротеины представляют собой сложные биополимерные структуры, делает чрезвычайно трудоемким . и трудно интерпретируемым исследование функционирования природных гликопротеиноо с целью выяснения роли их углеводных фрагментов. В этой связи для изучения влияния углеводных фрагментов на свойства связанного с ними белка многообещающим представляется

использование предлагаемого нами подхода, суть которого состоит б получении искусственно гликозили.рованного белка, моделирующего свойства природного гликопротеина, методом химической модификации природного негликозилированного белка. Так, при искусственном гликозилировании мы имеем возможность не только контролировать и варьировать количество и локализацию углеводов, но и задавать их структуру на стадии синтеза. При таком подходе всегда есть контроль - исходный негликозилированный белок. Это должно позволить выяслять различия, появившиеся в поведении фермента в результате гликозилирования.

В данной работе мы использовали в качестсе модельного объекта хорошо изученный негликсзилированкый фермент - а-химотрипсин. Основной задачей работы было получение путем химической модификации гликозилированного аналога а-химотрипсина и выявление различий в поведении исследуемых ферментов в системе обращенных мицелл.

Научная__нопизна_ряботьц В работе для изучения влияния

углеводных фрагментов на свойства гликопротеиноз впервые предложен и реализован подход, суть которого заключается в получении искусственно гликозилированного фермента, исходя из природного негликозилированного. В качестве модельи-го объекта был выбран хорошо изученный негликозилированный фермент а-химотрипсин. Были получены препараты а-химотрипсина, модифицированного О-глюкозамином по карбоксильным группам белка и модифицированного 0(+)-целлобиозой по аминогруппам с различными степенями модификации. Показано, что гликозилирование придает а-хнмотрипсину свойства, характерные для природных гликопротеинов: способность к олигоыеризации (димеризации) в системе обращенных мицелл и мембранотропность (способность взаимодействовать с мицеллярной матрицей).

Обнаружено, что з зависимости от степени модификации 0(+)-целлобиозой гликозилированный а-химотрипсин способен

образовывать димеры различной формы. Объяснение выявленных закономерностей дано исходя из предположения о способности а-химотрипсина находиться в виде двух различных форм (конформаций) -"открытой" и "закрытой".

В работе обнаружено и доказано существование в молекуле нативного а-химотрипсина центра связывания с углеводами, благодаря которому он способен образовывать нековалентные комплексы с искусственными (гликозилированный u-химотрипсин) и природными (на примере пероксидазы из корней хрена) гликопротеинами.

Обнаружено, что комапексообразование нативного а-химотрипсина с гликопротеином придает а-химотрипсину (в форме комплекса) способность взаимодействовать с мицсллярной матрицей.

Методом конкурентного подавления комплексообразования а-химотрипсина с пероксидазой в системе обращенных мицелл сахарами различной природы предпринята попытка изучения специфичности углевод-связывающего центра а-химотрипсина. Показано, что из изученных Сахаров, наибольшей способностью подавлять комплексообразование обладает целлсбиоза (концевой фрагмент глюкоза, р-тип связи 1->4).

Практическая значимость работы. Обнаруженная в работе способность а-химотрипсина (благодаря его углевод-связывающему центру) образовывать нековалентные комплексы с углевод-содер:*ащими молекулами (материалами) открывает новые перспективы конструирования и регуляции надмолекулярных структур с участием этого фермента, используемого в медицине и биотехнологии.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на: Ill-ем Симпозиуме "Химия протеолитических ферментов" (г. Москва, Россия, 1993), Int. Conference "B¡ocata!ysis-95" (г. Суздаль, Россия, 1995); VI Int. Conference "Frontiers in Biochemistry and Molecular Biology. The legacy of Andrey Belozersky" (Moscow, Russia,

1995); XI Int. Symposium on Surfactants in Solution (Jerusalem, Israel,

1996).

Публикации, По материалам диссертации опубликованы 4 течатные работы.

Объем it структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литератуты, постановки задачи, экспериментальной части, результатов, и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (180 наименований). Работа изложена на 148 страницах машинописного текста и включает 2 таблицы и 41 рисунок.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

/. Изучение способности препаратов гликозилированного a-химотрипсина образовывать олигомерные структуры и взаимодействовать с мицеллярно й матрицей

Для выяснения влияния углеводных фрагментов на свойства гликопротеиноп нами был получен а-химотрипенн, модифицированный D-глюкозамином со степенью модификации 7±2 (схема модификации представлена на Рис.2). Отсутствие межмолекулярных сшивок было показано методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условия-/; наблюдается лишь одна полоса белка с молекулярной массой в районе 25 кДа (молекуляр, зя масса а-химотрипсина).

Различий s водной среде в поведении нативного и гликозилированного а-химотрипсина не обнаруживается. Кинетические параметры, измеренные с использованием специфического субстрата п-нитроанилида 1М-бензоил-1--тирозина мало отличаются для нативного и гликозилированного а-уимотрипсина (для нативного фермента: ккат=0.144 с-1, Км--0.77*10-4 М; для модифицированного: kKai=0.266 с-1, К„=2.0* 10"4 М). Однако, при переходе к системам обращенных мицелл в качестве среды для ферментативных реакций отличия в поведении ферментов выявляются.

н-с-« «на и,е-'

На Рис.3 а,б «Vой

представлены зависимости каталитической активности нативного

(а) и

гликозилированного

(б) а-химотрипсина от' степени гидратации Аэрозоля ОТ (АОТ), \лг0 (радиус внутренней полости мицеллы, г, линейно связан с этой величиной: г=1.5«0+4). Из рисунка За видно, что в случае нативнбго а-химотрипсина наблюдается один оптимум каталитической активности при */у0=1 1, положение которого соответствует

условиям равенства размеров белка и внутренней полости мицеллы (концепция "геометрического соответствия"). Для гликозилированного а-химотрипсина (Рис! 36), кроме первого оптимума (\"/0=12), обнаруживается еще и второй при и'о=20, что свидетельствует о функционировании в мицеллярной системе . олигомера гликозилированного а-химотрипсина. Результаты седиментационного анализа показывают, что первый оптимум соответствует функционированию мономерной формы фермента, а второй -

«но

о

Рис. 2. Схема химической модификации а-химотрипсина О-глюкозамином.

и §

8

0.8

0.5

0,5 0,4 0,3 0.2 0,1

10 )5 20

[НгОИАОТ1

Рис. 3. Згаисгмосги каталитической активности от степени гидратации АОТ для а-химотрилсинз (а), искусственно гликозилированного а-хи.мотрипсина (б,в) в обращенных мииеллах АОТ в октане. В случае (в) буфер содержал '¡М глюкозу. Субстраты: (о) М-транс-циннамоилимидагол, (•) п-нитроаиилид Ы-ацотил-Ь-П'розина.

0,1 0,2 [АОТ],М

Рис. 4. Зависимости каталитической активности а-химог;.ипсина (а) при ч/о=10 и гликозилирозаиного а-химотрипсина (я) при \н0=16 от концентрации ПАВ в системь обращенных мицалл АОТ в октане. Субстрат: М-трснс-циннамоил имидазол.

димеркой. 8 образовании димера принимают участие углеводные фрагменты

искусственно гликозилированного а-химотрипсина, поскольку введение в систему низкомолекулярного сахара -глюкозы полностью

подавляет образование димера (Рис. За).

По кинетическим проявлениям в системе обращенных мицелл все ферменты делятся на две группы: способные (благодаря наличию якоря углеводной или липидной природы) и не способные взаимодействовать с мицеллярной матрицей. Тестом на эту способность является

зависимость от концентрации поверхностно-активного вещества (ПАВ). На Рис.4 приведена зависимость каталитической активности нативного и икусственно гликозилированного а-химотрипсина от концентрации АОТ при постоянной степени гидратации (изменение концентрации АОТ приводит к изменению концентрации мицелл, размер мицелы сохраняется постоянным). Как видно из Рис.4 для нативного а-химотрипсина, неспособного взаимодействовать с мицеллярной матрицей, к^ат не зависит от концентрации АОТ, тогда как для гликозилироканного такая зависимость наблюдается. Таким образом, нами показано, что модификация а-химотрипсина Р-глюкозамином придает ферменту свойства, характерные для гяикопротеинов - способность к олигомеризации и мембранотропность.

Для подтверждения общности обнаруженных явлений нами в качестве модифицирующего агента был взят другой сахар -целлобиоза.. В данном случае модифицируются аминогруппы белка. Схема модификации представлена на Рис. 5. По данной схеме были получены препараты гликозилированного а-химотрипсина со степенями модификации 1, 3, 5 и 12. Отсутствие межмолекулярных сшивок было

с

показано методом электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях. Кинетические параметры (к,^ и Км), измеренные с использованием специфического субстрата а-химотрипсина п-нитроанилида М-сукцинил-аланил-аланил-пролил-фенилаланина, в водной среде для наиболее модифицированного препарата (аепень модификации 12) практически не отличаются от кинетических характеристик нативного а-химотрипсина (нативный а-химотрипсин: ккат=28.5 с*1, Кы=0.043 мМ; гликозилирозанный п-химотрипскн: к.0.-23 с-1, Кн=0.08 мМ). Эти результаты указывают на то, что данная химическая модификация белковой глобулы не влияет на функционирование фермента в водной системе, что позволяет сделать предположение о неизменности структуры активного центра.

ю

На Рис. 6а,б,в,г приведены зависимости каталитической активности от степени гидратации препаратов гли.козилированного а-химотрипсина со степенями модификации 1, 3, 5 и 12 соответственно. Из Рис.6 видно, что , в случае модификации целлобиозой гликозилированный а-химотрипсин также как и в случае модификации глюкозамином (Рис. 36), способен образовывать димер. Для всех степеней модификации наблюдается оптимум каталитической активности, при у.-о=20 соответствующий функционированию димера гликозилированного а-химотрипсина. Первый пик ^0=12) во всех случаях соответствует функционированию мономерной формы фермента. Однако, для малых степеней модификации - 1 и-3, между пиками мономера и димера обнаруживается пик при у/0=16 (Рис. 6а,б). Методом седиментационной анализа показано, что этот пик

п

соответствует функционированию также димерной формы гликозилированного а-химотрипсина в системе обращенных мицелл. Эти данные позволяют допустить образование различных димерных форм. В этой связи отметим, что в обращенных мицеллах существует корреляция между положением оптимума и радиусом включённого в мицеллу белка. Расчеты показывают, что оптимум при \«0=16 должен наблюдаться для фермента сферической формы с

молекулярной массой равной 50 кДа, что соответствует молекулярной массе димера й-химотрипсина. В то же время из этих расчетов следует вывод, что из двух сферических частиц в результате димеризации

образуется также сферическая частица, но большего радиуса. Для объяснения такой способности а-химотрилсина образовывать сферический димер мы предполагаем возможность

существования а-химотрипсина в яиде двух форм (конформаций) -Димеризация двух открытых форм и

30 20 10

20

10

10 1S 20 25 30

[Н2ОИАОТ1

Рис. 6. Зависимости каталитической активности а-химотрипсина (о) и глмкоэилированного а-химотрипсина (•) от степени гидратации ПАВ в системе обращенных мицелл AOT в октане. Степени модификации гликозилироаанного о -химотрипемна: (а) - 1±0.5, (б) - 3±1. (в) - 5±1, (г) - 12i1. Субстрат: п-нитроанилид N-сукцинил-аланил-аланил-пролил-<ренилаланина.

"закрытой" и "открытой" (Рис. 7). дает компактный сферический

а

в

6

"закрытая" "открытая"

конформацит конформация

о © (Ъ со

в Г. А 20.5 25.8 33.4 41.0

1Н.О) расчет 11.0 14.5 19.5 25.0

1А0Т) эхслер. 11.0 16.0 20.0

Рис. 7. Различные типы ди?/еро8 о-химотрипсина и возможный механизм их образования.

димер. На базе этого предположения находят объяснение конструкции и других типов димеров гликозилированного а-химотрипсина (Рис. 7).

В свою очередь, также как и в описанном выше случае димеризации а-химотрипсина, модифицированного О-глюкозамином, и в данном случае разумно допустить, что образоаание димера происходит за счет взаимодействия углеводного фрагмента с белком, а точнее, с углевод-саязывающим участком белка. Трудно допустить, что появление углеэод-связывающего участка индуцировано гликозилированием - на это указывает, в частности, отсутствие различий в структуре белковой части нативного и гликозилированного а-химотрипсина, на что указывает неизменность спектров собственной флуоресценции и кругового дихроизма препаратов нативного и гликозилированного а-химстрипсина в водной среде. Таким образом, следует предположить, что углевод-связывающий центр существует исходно в молекуле нативного а-химотрипсина (такой вывод кажется вполне разумным, поскольку известно, что в природе а-химогрипсин

13

функционирует е сорбированном состоянии- наь гликокаликсе, матрице углеводной природы (Рис. 1)). Если это та*с, ц*нативный а-химотрипсин имеет углевод-связывающий центр, то. он должен обладать способностью образовывать комплекс с гликозилирозанмым. Действительно, нативный а-химотрипсин обнаруживает такую способность.

25

20

& 15

10 •

II. Изучение способности нативного а-химотрипсина образовывать комплексы с участием угловод-связывающего центра

При введении избытка гликозилированного а-химотрипсина со степенью модификации целлобиозой 12 (не способного образовывать

компактный димер с оптимумом каталитической активности при \«0=16 (см. Рис. 6г)) в систему с натиЕным, оптимум,

соответствующий нативному а-химотрипсину, не наблюдается, а появляется оптимум при ^/£,=16, соотаетст ву ющий

функционированию компактного диыера (Рис. 8а). Таким образом, весь, нативный а-химотрипсин оказывается связанным в комплекс-с гликозилированным. /иСьпичный гликозилированный фермент образует гомодимер с оптимумом каталитической активности при \/уо=20 (второй оптимук. на профиле каталитической

25

15

f а

л 6

я

■ / -А

7 Ч

s , \

10

15 20 25 IHjOJ/lAOT)

Hue. в. Заеисимости каталитической активности смесей нативного и гликозилпрованного и-химотрипсина в малярном соижишении: (а) - 2:1, (б) - 1:2 от степени гидратации ПАВ в системе обращенных мицелл АОТ в октане. Субстрат: см. подпись к рис.6

активности). Именно такой димер наблюдается, когда в системе присутствует только гликозилированный а-химогрилсин со степенью модификации 1С (Рис. 6г). При избытке нативнсо а-химотрипсина по сравнению с гликозилированным на профиле каталитической активности также наблюдается оптимум, соответствующий функционированию в системе компактного гетерокомплекса натианого и гликозилированного а-химотрипсина. В данном случае уже весь гликозилированный фермент оказывается связанным в комплекс с натиеным (отсутствует оптимум гомодимера гликозилированного а-химотрипсина при «о=20), а избыток нативного а-химотрипсина проявляется в виде оптимума каталитической активности при \70=11.

Таким образом, существование углевод-связывающего участка в молекуле а-химотрипсина можно считать доказанным. Наличие углееод-связывзющэго участка должно придавать а-химотрипсину способность образовывать надмолекулярные комплексы с углевод-содержащими молекулами, в честности, гликопротеинами. В качестве такого природного объекта нами был взят природный гликопротеин -пероксидаза. На Рис.Эа представлена зависимость каталитической активности а-химотрипсина а присутствии пероксидазы (в молярном отношении 1:1) в системе обращенных мицелл от степени гидратации АОТ. Из Рис. 9а видно, что введение в мицелл;.р"ую систему, содержащую а-химотрипсин, пероксидазы приводит к смещению положения оптимума катали-ической активности фермента, что указывает на образование комплекса сх-химотрипсина с пероксидэзой. Молекулярный вес белковой компоненты з белок-содержащих мицеллах, определенный методом седиментационного анализа, находится в области 70 кДа (Рис. 96). Этот факт указывает на то, что в мицеллярной системе действительно существует прочный комплекс а-химотрипсин - пероксидаза.

Образование и функционирование комплекса напевного а-химотрилгина и пероксидазы показано нами в мицеллярной системе.

[НгОИАОТ]

Рис. 9. (а) - Зависимости каталитической активности нативного а-химотрипсика (о) и нативного а-химотрипсина в присутствии пероксидагы (•) в молярном отношении 1:1 от степени гидратации ПАВ в системе обращенных мицетл АОТ в октане. Субстрат: см. подпись к рис.6, (б) - зависимости молекулярной массы белка в белоксодсржащих мицеллах от степени гидратации ПАВ: а-химотрипсин в отсутствие - (о) и в присутствии псрсказдззы - (г).

Остается, однако, открытым вопрос о необходимости мицеллярной матрицы в поддержании целостности комплекса (не имеем ли мы дело с тройным комплексом а-химотрипсин-пероксидаза-мицелла). Для выяснения вопроса о том, способен ли комплекс существовать в отсутствие мицеллярной матрицы, методом осаждения ацетоном из мицеллярной. системы была получена белковая фракция в виде "ацетонового порошка*. При последующем перерастворении

68кДа

14 кДа

Нековзлснтный комплекс а-химотрипсин - перокс.\цаза

Рис, 10 Хроматсгрзмма белковой компоненты, выделенной из мицеллярной системы, содержащей а-химстрипсин и пероксидззу, я электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях белковой фракции, собранной в области первого пика.

"ацетонового порошка" в воде получен белковый рэстг зр, свободный от органического растворителя и ПАВ. На рис.10 приведена хроматограмма полученного белкового раствора. На хроматсграмме присутствуют два ярко выраженных пика - первый соответствует молекулярной массе белка 70 кДа, а второй - 25 кДа. а-Химотрипсиновая активность обнаруживается в обоих пиках (см. рис. 10). На рис. 10 приведена злэктрофореграмма в ПААГ в денатурирующих условиях белковой фракции, соответствующей первому пику. Видно, что обнаруживаются две полосы, молекулярные массы которых соответствуют пероксидазе и а-химотрипсину (в

денатурирующих условиях комплекс распался на составляющие его белковые компоненты). Таким образом, мы выделили из мицеллярной системы нсковалентный комплекс а-химотрипсина с пероксидазой и, тем самым, доказали, что комплекс существует 8 отсутствие мицеллярной матрицы. (Следует отметить удивительную прочность этого комплекса, не распадающегося в достаточно жестких условиях осаждения ацетоном и последующего фракционирования на колонке).

III. Регуляция каталитической активности a-химотрипсина б комплексе с пероксидазой мицеллярной матрицей

Разумно предположить, что комплексообразование нативного а-химотрипсина с пероксидазой, являющейся природным гликопрогеином, может придавать ему способность взаимодействовать с мицеллярной матрицей (мембранотропность), характерную для пероксидазы. На рис. 11а Представлена зависимость каталитической активности нативного а-химотрипсина в присутствии пероксидазы от степени гидратации ПАВ при разных концентрациях АОТ, и на рис. 116 представлена зависимость 1 /ккат от концентрации ПАВ для комплекса а-химотрипсин - пероксидаза при разных степенях гидратации. Видно, что а-химотрипсин в комплексе с гликопротеином действительно обнаруживает способность взаимодействовать с мицеллярной матрицей (каталитическая активность зависит от концентрации ПАВ при постоянной степени гидратации). Как видно из Рис. 116, каталитическая активность а-химотрипсина в комплексе с пероксидазой в изолированной мицелле (при стремлении концентрации АОТ к нулю) не зависит от степени гидратации (асе прямые на Рис. 116 сходятся в одной точке); то есть действительно комплекс а-химотрипсина с пероксидазой взаимодействует с мицеллой и формирует свою белок-содержащую мицеллу определенного типа (размера и формы). Однако, в такой жестко фиксированной мицелле а-химотрипсин оказывается (по-видимому, из-за влияния пероксидазы) не в оптимальной для

катализа конформации. Это приводит к тому, что ослабление прочности мицеллы (изменением концентрации пустых мицелл, участвующих в межмицелляркых взаимодействиях), сопровождается ослаблением фиксации конформации фермента и возможностью ее перехода в более реакционно-способную форму. Описанный механизм объясняет наблюдаемый нами (впервые в мицоллярной энзимологии) аномальный зависимости концентрации повышение наблюдаемой каталитической активности увеличении концентрации ПАВ.

характер от ПАВ:

нами

при

16 20 24

{НгОИАОЛ

0,1 0,2 [лот), м

Рис. 11 (а) - Зависимости каталитической активности натизного а-хичотоипсина в присутствии пероксидазы в молярном отношении 1:1 от степени гидратации ПАВ в системе обращенных мицелл АОТ в октане при различных концентрациях АОТ: (о) - 0.025 М, (Л) - 0.05 М, (о) - 0.1 М, (0) - 0.2 М, 'е) - 0.3 М; (б) - зависимости каталитической активности нтгизного а-химотрипсмна в присутствии пероксидазы в молярном отношении 1:1 от концентрации АОТ в системе обращенных мицелл АОТ в октане при различных степенях гидратации. Субстрат: см. подпись к рис. 6.

IV. Исследование специфичности углевод-связывзющего центра a-химотрипсинг '

Важнейшей характеристикой углевод-связывающего центра является его специфичность к моно- и олигосахаридам, то есть способность связывать углеводы различной природы и длины углеводной цепочки. Решение этой задачи требует постановки отдельного детального исследования, выходящего за рамки данной работы. Тем не менее в этом направлении нами было предпринято изучение способности а-химотрипсина образовывать нековалентный комплекс с псроксидазой в системе обращенных мицелл в присутствии Сахаров (по эффективности конкуренции низкомолекулярных сахаров (Рис.12) и углеводных фрагментов пероксидазы за связывание с а-химотрипсином).

Как следует из-результатов, представленных на Рис.13а среди изученных моносахаров наибольший эффект оказывает глюкоза. В присутствии в системе глюкозы, на зависимости каталитической активности от степени

гидратации кроме оптимума, соответствующего функционированию комплекса о-химотрипсина и пероксидазы (и'0~18), обнаруживается оптимум при \л/0=11,

н он глюкоза

н ОН

н н

манноза

галактоза

МОЧ HC« нем ион

ОМ HC«

целлобиоза

лактоза

СНгОН С И.ОН CHjOH

свидетельствующим о у\__

появлении в системе *

Н СИ

н он

он н

CKjO«

.свободного а-химотрипсина.

мальтоза

сахароза

Рис. 12 Структурные формулы используемых в работе углеводов.

Рис.136 иллюстрирует влияние дисахаридов на способность а-имотрипсина образовывать нековалентный комплекс с лероксидазой в .лстеме обращенных мицелл. Видно, что целлобиоза в концентрации ).4 М (концентрация во вносимом буфере) полностью подавляет этособность а-химотрипсина образовывать комплекс (наблюдается олько един оптимум каталитической активности 1ри \л/0=11. что соответствует гзободному а-химотрипсину). 1актоза в той же сонцентрации оказывает меньшее влияние, поскольку сонцезой фрагмент лактозы --апаетоза, а целлобиозы -■люкоза, которая и среди моносахароз обладает

наибольшей специфичностью к углевод-связывающему центру. Сахароза, имеющая концевой фрагмент глюкозу, тем не менее не препятствует образованию комплекса (Рис. 136). Отличие сахарозы -от обсужденных выше

дисахаридоз, целлобиозы и лактозы, состоит в том, что она является

невосстанавлквающим дисахаридсм, то есть не подвергается мутаротации и

10 12 14 18 1в 20 22 24 ¡КОИАОТ)

Рис. 13 Зависимости каталитической аетизности а-хчмотрипсина в присутствии перокекцазы от степени гидратации АОТ Е системе обращенных мицелл ЛОТ в октане. Вносимый в мицолляр!|ух> систему буфер содержал углеводы в концентрации 0.4 М.

(а) (л) - глюкозу, (п) - галактозу, (а) - маннозу;

(б) (о) - ЦоллоСиозу. (о) - лактозу, (1) - сахарозу.

не способна образовывать Субспрзт: см. подпись к рис. 6. основание Шиффа с

аминогруппами на поверхности а-химотрипсина.Тот факт, что сахароза не оказывает влияния на процесс образования комплекса а-химотрипсина с пероксидазой позволяет сделать предположение о том, что вводимые в систему углеводы не только связываются с углевод-связывающим центром, но и (дополнительно) обрззуют основание Шиффа с одной из аминогрупп на поверхности а-химотрипсина, расположенной вблизи этого центра.

Это обстоятельство сильно осложняет изучение сахарной специфичности углевод-связывающего участка. а-химотрипсина в конкурентном режиме, поскольку мы имеем дело с двумя независимыми процессами, каждый из которых способен подавить взаимодействие а-химотрипсина с пероксидазой: 1. Нековалентное связывание низкомолекулярного сахара с углевод-связывающим участком молекулы а-химотрипсина; 2. Ковалентная модификация поверхности фермента. В том, что модификация поверхности а-химотрипсина действительно может приводить к стерическим затруднениям при образовании комплекса, мы убедились, использовав в качестве эффектора глицериновый альдегид. Нами было показано, что введение в мицеллярную систему глицериного альдегида (не имеющего в своей структуре сахарного кольца и не способного взаимодействовать с углевод-связывающим центром в молекуле а-химотрипсина, но способного образовывать основание Шиффа с аминогруппами белка) даже в небольшой концентрации (50 мМ во вносимом буфере) приводит к значительному подавлению способности а-хймотрипсина образовывать комплекс с пероксидазой. В этой связи корректным оказывается сравнительный анализ Сахаров сходной структуры, как, например, пары целлобиоза-лактоза, отличающихся лишь структурой концевого фрагмента, или пары целлобиоза-мальтоза, отличающихся типом связи 1->4. Нами обнаружено, что целлобиоза (р-тип связи 1—>4) способна в большей степени подавлять образование комплекса а-химотрилсин-пероксидаза, чем мальтоза (а-тип связи

•п

-*4). Таким образом, о данной работе сделаны лишь первые шаги в изучении специфичности углевод-сеязывающего центрз молекулы а-:имотрипсина. По нашему мнению, этот вопрос, безусловно шслуживает дальнейшего детального исследования.

В свою очередь, отметим, что целлобиоза не только эффективно юдазляет комплексообразовапие а-химотрипсина с углевод-¡одержащей матрицей, но и способствует димеризации нативного а-:имотрилсина в системе обращенных мицелл (выступает здесь в сачестве модифицирующего реагента). Инкубация а-химотрипсина в лицеллярной системе, содержащей целлобиозу, приводит к обратимому гликозилирозакию фермента, и такой гликози.пированный х-химотрипсин образует компактный димер (на зависимости саталитической активности (Рис.14) появляется оптимум <аталитическог -зктивкссти при у/0=1б).

25

ь

^ 20

л §

о 15

х

&

га в

5 10

т

[¡1 Ц^ * Л г \ \ / VII / у, N

. „1..... .1 ..... 1 ... . 1. . -. 1 1 ..1...

8 10 12 14 16 18 20 22 [НгО]Д'АОТ]

Рис. 14 Зависимости каталитической активности а-хпмотрилсина от степени гидратация ПАВ в системе обращенных мицелл АОТ в сктано. Перед измерение:.! каталитической активности фермент инкубирозали 30 мин. 8 мицелляр.чой система о различной концентрацией целлобиозы во вносимом буфере: (о) - 0.1 М, (Л) - 0.2 М, (о) - 0.3 М, (о) - 0.4 М. Субстрат: см. подписи к рис. 6.

выводы:

1. Получены и охарактеризованы препараты а-химотрипсина, модифицированного О-глюкозамином (ст.мод.7) и 0(+)-целлобиозой (ст.мод.1,3,5 и 12).

2. Обнаружена способность гликозилированного а-химотрипсина к димеризации в системе обращенных мицелл. Выявлено, что в зависимости от степени модификации гликозилированный а-химотрипсик способен образовывать димеры различной формы. Обнаруженные эффекты объяснены с точки зрения предположения о существовании двух форм (конформаций) молекулы а-химотрипсина (открытой и закрытой) и наличия углевод-связывающего участка в молекуле а-химотрипспна.

3. Наличие углевод-связывающего центра в молекуле а-химотрипсина было подтверждено выявленной способностью нативного а-химотрипсина образовывать прочный комплекс с искусственно гликозилирозанным а-химотрипсином и природным гликопротеином -пероксидазой в системе обращенных ' мицелл. Нековалентный комплекс а-химотрипсин-пероксидаза был выделен из мицелпярной системы в водную фазу и охарактеризован по молекулярному весу и составу входящих в него белков.

4. Показано, что комплексообразование а-химотрипсина с гликопротеинами придает ему способность взаимодействовать с мицеллярной матрицей (мембранотропмость), тестом на которую в мчцеллярной системе является наличие зависимости каталитической константы от концентрации ПАВ. Обнаружено, что наблюдаемая для а-химотрипсина в комплексе с гликопротеином зависимость каталитической константы от концентрации ПАВ является аномальной по сравнению с ранее изученными мембранотропными ферментами вследствие того, что геометрически оптимальная мицелла стабилизирует не оптимальную с точки зрения катализа

конформацию а-химотрипсина в комплексе (для всех ранее изученных мембранотропных ферментов было показано, что геометрически оптимальная мицелла стабилизирует наиболее каталитически активную конформацию).

5. Методом конкурентного подавления комплексообразования нативного а-химотрипсина и пероксидазы в системе обращенных мицелл ДОТ в октане изучена специфичность углевод-связывающего центра в молекуле а-химотрипсина. Обнаружено, что у.з изученных углеводов различной природы целлобиоза (концевой фрагмент -глюкоза, р-тип связи 1->4) наиболее эффективно подавляет образование комплекса а-химотрипсина с пероксидазой.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Р.В.Г.рий, Н.Л.Клпчко, А.В.Лееашов. Гликозилированный а-химотрипсин, как модель гликопротеинов, в системе обращенных мицелл. /Материалы III Симпозиума "Химия протеолитических ферментов". Москва, апрель 1993. с. 120.

2. A.V.Levashov, R.V.Rany, K.Martinek, N.L.KIyachko. Artificially glycosylated u-chymotrypsin in reversed micelles of Aerosol ОТ in octane. A new approach to elucidation cf the role of carbohydrate moieties in glycoproteins. //FEBS Lett, v.336. p.385-388.

3. Р.В.Рарий, Н.Л.Клячко, К.Мартинек, А.В.Левашов. Гликозилированный u-химотрипсин в системах обращенных мицелл Аэрозоля ОТ в октане как модель в изучении рпи углеводных фрагментов е гликопротеинах. /'/Биоорганическая химия 1994. т.20. С.249-256.

4. R.V.Rariy, N.L.KIyachko, E.A.Borisova, C.J.Cortes Penagos, A.V.Levashov. Leciin-like center in the molecule of a-chymotrypsin: formation of complexes with peroxidase and artificially glycosylated a-chymotrypsin. //Biochemistry and Molecular Biology International. 1995. v.36. p.31-37.