Обратные реакции никтроксильных радикалов в исследовании химических и биохимических процессов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ
|
Храмцов, Валерий Владимирович
АВТОР
|
||||
|
доктора химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Новосибирск
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
1993
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.15
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
Г Г 3 Ь
"О ; ■
РОССИЙСКАЯ МОДЕШЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ КАТАЛИЗА
йа правах ругайся
ХР2ЩОВ Валерий Владимирович
УДК 541.127
ОБРАТКЖ ШКШ НШЮКСШЬШХ РАДИКАЛОВ В ИССЛЕДОВАНИИ ХИМИЧЕСКИХ И БИОХШЧЕСШ ПРОЦЕССОВ
02,00,15 -шическая кинетика и катализ
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора хитесхих наук
Новосибирск - 1992
Работа выполнена в Икституте химической кинетики и горения СО РАН
Официальные оппонента: доктор физихо-иатемзтических наук, профессор Г.М.Еидоииров доктор физико-математических наук, профессор Э.К.Рууге доктор химических наук О.А.Анисииов
Ведуцая организация:
Ордена Ленина Институт хиаическсй фшки РАН
Зашта состоится "Л' Марта 19ЭЗ г. в 14 час. на заседании специализированного совета Д 002.13.01 в Институте катализа СО РАН по адресу: 630050, Новосибирск, . пр.Ах.Лаврентьева, 5.
С диссертацией коено ознакошгься в библиотеке Института катализа СО РАН.
Автореферат разослан срс&рдля 1993 Г.
Ученый секретарь Специализированного совета доктор гакичесш наук
Г.И.Пакоз
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Ащалъност проблема. Синтез стабильно китрокснлькых радикалов (НР) в началэ 60-х годов послрил основой создания и самого ш-рокого применения ыетодз ашнових штох и зовдов в хши, биохшш, технике л технологии. Два ключевых тин? а обусловливает столь эффективные а разнообразные прагеяегаи НР в качества спиновых зондов: во-первых, чрезвычайная стабильность НР; во-вторнх, еысокзя чувствительность спектров электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) НР к характеристикам его блюмйгего окружения (вязкости, полярности, локальный электрически и магнитным полян и др.), В своя очередь пралогензя ызтсда спинсна кэток и зондов слузат важна стгшулои рггглтия срггшческой гпиа НР.
Яяааческяе розгога ЕР до настоящего Ераяш рассматривались в двух основных аспектах: зо-пзрка, как фактор ограничиваем стабильность парамагнитного фрагееита; во-вторнх, как инструмент для синтеза новых стгоовых зоэдов и иеток. Самостоятельны?! :ктерсс представляй реакции НР, 'протекскзм без затрагивания радахашюго центра н использует? для направленного синтеза. В последнее Ере ил появились сксперииент альте данз-зэ, показывайте слабые изменения з дэлокалагацин сшнозоЭ плотности на перпфзра колекулы в результате такнх химических реакций, регистрируете методами электронного сш>.-нового аза, двойного электрон-ядерного резонанса, ЯМР. Отличие маг-катно-резоканснях параметров нитрохсялыш радикалов НР1 л НР2, участвуют в яиическса реакции, НР1 + А1 КР£ + А2, открывает принцяиаяьну» вогмошость получения ррвюй информация о кинетических и териодииаагсеска характеристиках этой реакции, а такте позволяет использовать НР как специфические сшковив зонда для определения концентрата создкнанзя . Указание применения реализовав для спинового сагана с участием НР (Д1 вНР ала другая парамагнитная молекула), которна истат рассматриваться в качестве модельной нш-чзскса реакции. Проявления спинового обмена в спектрах ЭПР хорсзо изучанн я зКЕэктавяо используются в аюгочясленных фигиколшических
и бзохкшческих исследованиях, в тда часлз для определения кокет акт спинового оЗизна, концентрации, локализации и геоизтрии радикальных центров, измерения трансляционной подаетости ста-неченых молекул и др. ,
Систематических исследований влияния реакций НР, ко затрагивают! парамагнитного центра, на их спектры ЗПР до начала 80-2 годов не проводилось, так как случаи зааеткых изменений спектральных параметров сяабшьшх НР в результата пшчэской реакции практически ограничивались реакциям! коваленткого связнвашя К? с какроиолеку-ла5ш. .В то же вреия использование НР для .исследования химических и биотических реакций и связанных с ш процессов представляется чрезвычайно перспективный, т.к. позволило бы получить пряаую икфор-цацаю об исследуекои процессе по спектральные игивкеннш паранаг-шгтного зовда-реагента. При . эта представляется наиболее целесообразна рассмотрение обратных резкий НР, вознущвдее влияние которых на изучаемую систему или процесс (кодификация соединения А1) цеано свести к ыиишуыу или полностью обратить, что особенно актуально для биолохвческнх объектов.
Цель роУсш состояла в исследовании обратишх шичесгак реакций НР и в их использовании ври изучении шичесхих и биохимических систеа ызтодои ЭПР.
В задачи исследования входило: экспериментальное и теоретическое исследование проявлений реакций протонного обмена с участием НР в спектрах ЗПР;
- изучение юшэтики и терыоданааихн реакций протонного обкзна в НР различной структуры изтодоа ЗПР;
- на основе изученных проявлений реащгй протонного обкена с участием НР в спектрах • ЗПР обоснование и разработка катода спиновых рН-зондов для измерения локальных величин рН, изучения процессов трансмекбранного транспорта протонов, физико-хшических характеристик белков и кеибран;
- экспериментальное • исследование. проявлений реакций тиол-дасуль-Скдного обиена с участиеы НР в спектрах ЭПР и определение их кинетических характеристик;
- на основании исследования реакций ткол-дасульфидного обмана в НР разработка иетода измерения концентрации низко- и сысокоиоле-куляряых тяолов и использование его для аналитических измерений ■ тиолов в крови ивах оргашшов и в ткано, вхлэтая изучение ферментативных систем;
- экспериментальное исследование проявления спинового обыена с учгсткец НР в спектрах переноса насвдегая • ЭПР и разработка на его основа нового подхода к определению коэффициентов локальней. трансляционной даЭДузаи белков;
Научная новизна. Впервые обнаружено проявление реакций протонного обивна с участаеи ЕР, содержав кислотно-основные группы, в их спектрах ЭПР. Получена количественная информация (константы скоростей, энергии актавцни, величина изотопного гКэкта) для рзакциЗ протонного обаэна в некоторых НР. рН-чувствятэлькыэ НР использованы для изучения изханизаез трансаеы5ранного транспорта протонов через ыодзльннэ фосфошгаднкэ неабранн. С пмюцью спиновых рБ-зондоз измерен электрический поверхностный потенциал и полярность заряшшсЗ поверхности фосфолкпвдшх менбраня-белка.
Впервые обнаружено проявление реакции ткол-дисульфидного обивна ыэаду ютрокишшн барадикалоа с дисульфидной связью и рядои тиолов в спектрах ЭПР. Иатодон ЭПР измерены константы скоростей соответствуй^ рэакций. Еирадакал с дисульфидной связью использован для определения глутатжона и других яизкоаолекулярянх тиолов в крова гивотшх. С певдью бирадикзла с дисульфздной связью определялась активность ацэгидхоллнэстеразы в индивидуальных инсектах, что поззо/вмо провести анализ распределения ферментативной активности в данксЗ популяш.
Экспериментально впервые наЗдана зависимость интегральной интенсивности спектра переноса насщения ЭПР от концентрации стш-иеченого белка вследствие спинового обшна. В результате с использованием спектроскопа переноса насыщения ЗПР были определены коэффициенты трансляционной диффузии для сывороточного альбумина человека в воде я водно-глицериновых сиесях.
- Э -
Ьйтодоц ЭПР обнаружено превращение . некоторых КР З-юедазолин-3-окскда в шгтрокшшитрокс&шше радикалы (ННР) и. изучен иехакш этоа новой зиашескоЭ реакции. На основа проведенных исследований совместно ■ с ' Новосибирский институтом органической хвош (НйОХ) СО Р4Н предложен принципиально новый ■ подход к с влезу НР З-выадазотш-3-оксцда, ННР и ининонитроксильных радикалов (ИКР).
Яацчно-щаитесюя ценность. На основе изучения реакций протонного обиека в НР в, работе разработан ыэтод спиновых рН-зоядов и исток, позволяхвдй проводить измерения рН в водка раствора! в диапазона О -14 ед. рН, точность изазреий 0,05 ед. рН. 1'зтод представляется особенно полезши при исследовании биологических объектов и был успеано апробирован при исслздоваша транашбраккого перекоса протоков, да изучения сойств поверхностей белков и кекбрзи. ■
На основе изучешя реакций таол-дисульфидного обиена в КР в работе разработал коей аналитический кзтод определения концектра-шк низко- и внеокоиолекулярвых тиолоз. йвгод обладает высокой чувствнтельностьв (до Ю"7И ЗН-груш), позволяет работать в погло-взх£за и окрзквяш растворах, Разрвботанкий гаод ногзт бать использован для определения БН-содзрза^и соединений в крови и тканях; для анализа активности ряда ферцентов, субстраты или продукты которшс являются, тислаш. Осуществленная в рзботэ обратимая ыодаф:!-кацшг некоторых фвриентов бирадакальной спиновой иеткой представляется перспективной для регуляции ферментативной активности.
Наблюдение зависимости интегральной интенсивности спектра
переноса насвдвкия ЭП? от концентрации спхн-цвченого белка вследствие спинового обыенз позволило предложить ноеый подход к измерения козЯйациектог локальной трансляционной МФУзан сшнчзчэша белков
С О р
в диапазоне 10 - 10 аг/с. Особенно перспективна представляется использование зтого подхода для изучения латеральной подашюстк белков в изйран8х.
Предложенный в работе новый подход к синтезу КР Э-юедазшшн-
Э-окскда, КНР и ПНР используется' в ЕНОХ СО РАН для получеши
- 4 -
стЕбялшп НР, синтез потери нзвэстшш до настоящего врекени цетодгня нэ представляется возыахкыи.
Апробация рабски. Результаты диссертации дологена на Всесоюзной коЕфорещи "Магнитный рэзонанс в биология и шдашше" (г.Черно-головха, 1581, г, Звенигород, 1983, 1985, 1989, г.Одесса, 1987),на Всесоюзной конференца но нитрошмыш радихалаы (Черноголовка, 1982), на I Всесоюзном биофизическом съезде (!.!осква,1932), на Всесоюзной коафореици "Магнитка резонанс в исследовании яшческих злекеятарнл актов" (Новосибирск, 1984), на 14 Международном конгрессе по биояпои (Чехословакия, Прага, 1983), на Международной ко'г;врени1 по вироксильнкы радикалам (Новосибирск, 1989), на 19 Ношрессе европейского биохимического общества (Италия, Рим, 1989), на II Свшозауиэ "Канатика процессов пэрвкоса заряда в гомогенка и гатерсгзшш систенахя (Батута?, 1939), на X съеэдо Всесоюзного Ентоаолоппзского обществ? (Ленинград, 1989), на IV Цгадународной еколэ по биофизике (Югославия, Дубровник, 1990), на 14 ¡йздународ-нсй ккфаревдш Чйпгтгнй резонанс в биологичесхих систеаах" (Англия, Варвик, 1990), ыэядународноЗ конференции "Спектроскопия ЗПР в исследовании биологических иеабран в клиничесхой ыэдицине" (Герата, враякфурт на Найне, 1992)
Публикации. Основные результаты диссертации изложена в 38 публикациях, в том числев 2 обзорах и I авторской свидетельстве.
ОСъед и сщкщрх диссертщи. Диссертация излохенна на 237 страницах иашнописяого текста, состоит из введения, 4-х глав, выводов, списка хзшчесхих структур и обозначений используегш радикалов и за гналогоз, списка литература кз 296 наименований, включает 53 рисунка и 17 табящ.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОМ
Диссертация не содерзат единого литературного обзора, каждая глава диссертации содарзит анализ литературных данных по исследуе-йоЗ проблеме, списание особенностей методов регистрации и анализа.
Деление дассертащи на 4 главы соответствует результатам исследований 4-х классов хшпеских реакций в НР: 1) - реакций протонного обмана; 2) реакций тяол-дасульфвдного обмена; 3) реакций взашяре-вразеккя НР в НИР и ШР; 4) спинового обкена, рассматриваемого в качестве недельной ввдчэской реакции.
ГЛАВА I. РЕАКЦИИ ПРОТОННОГО ОШЕНА В НЙТРОКШШЙ РАДИКАЛАХ. Я. Проявление щшшо&о ойкэна 6 спещха ЭПР ющхжсшьньа
радианов. -
Реакция протонного обиена кевд сопрякенныы основанием (рада-кал(Н') и кислотой (ВН*) списывается уравнением:
КГ
и- + ВН+ < НГ1" + В (I)
«г
Необходима условней применения изтода ЭПР для наблюдения за ходом реакции (I) является различие иагнитно-резонанскых параметров радикала в формах Е и Ей. В зтои случае реакция (I) долкна приводить к частотному обмену цэкду. соответствуиэши кошокентакп спектров ЭПР радикалов в фориах Я и Ш. Анализ форы линии сигнала ЭПР позволяет, в общей ■ случав, определить константу равновесия реакции (I), Как^к^, а в случав проиекуточкого частотного обшна и константы скоростей и Кр. Особо следует выделить реакции протонного обизна с протоноы растворителя (БН*
в ^ео1у* т.е. сольватированнай протон), для которых уравнение (I) связывает измеряема иегодои ЭПР концентрация радикальных фор« с концентрацией протонов, [Ндд^ЬЫЕН^/Ш, что открывает прзнцкпнальну» возможность использования радикалов в качестве спиновых рН-зондов.
Влияние рН на спектр ЭПР радикала Й1, вступающего в реакции протонного обазна, показано на ркс.1. Анализ спектров ЭПР одаазнач-ко свидетельствует о налички двух форм радикала, протонкровакной и непротоннровакно2, отличаются кокстакташ! СТВ и ё-фзкторгыц (да^з
у»'
I
О'
Н1 .
йгс.1, Спектр ЭПР НР Н1 при раэличяых гначежш рЯ в Х-дигпазонэ (А), (¡-диапазона (В) и 2-ьз диапазоне (С). рК радикала, нгЗлзююе кз заваспностеЗ э,,(рН) и рН-заетснаосга функция 1=1^/(1^+1^+), равно 4,7 ± 0,1. Диапазон рН, доступна измерению с псиозью данного ЙР, составляет 3,2 - 6,2.
а 1.2 Гс, ¿5 а 0.0002). Било доказано, что наблюдаем Еф^зкт связан с протоикрованиет атсш азота КЗ в радикале И. Этот бкзод подтверадаи квантозо-впачесш расчэгы величин кторов я
ксястант СТВ протонирозанкоа и нгпротокированной фора ряда '.гл'дазо-ляяшска и кядазоланоЕах радикалов нэтодага ограниченного и неограниченного Хартря-Фоха в пргйляхении ШБО?
Расчет проводился Бзльченко О.И. и Счэстневьш П.В. (КХКиГ СО РАН).
Проведенные наш: исследования влияния рН ка спектры ЭПР НР ряде ишдазолина, юшдазодидина, пипередана, пирролина, ациклического дитреталшшитроксильного радикала позволили установить связь иежду структурой НР и чувствительностью его спектра ЭПР к рН, а именно: НР является рН-чувствительныш, если в иг структуре на расстоянии не более 3-2, 4-х ст-связей от нигрошшшого фрашзнта игзются способные протошроваться (депротонироваться) группы, такиз как -СООН, -ОН, -Н< , =!Г, КОК, =Н-Ш" и другие. Во всех - изученных случаях (оката 40 радикалов) при лротояироваяаи НР наблэдается уиеньвекие константы СТВ и увеличение 2-$ахтс-рз, при зтоа величина спектральных изменений опрэделкется удаленностью* протонирувдзйся группа от нитррясильнэго фрашзнта и достигает иаксикалыш величин лг(р1,2 Гс и (2-3) • Ю-4 при протонкровашш атоиа КЗ в ишдазо-
лидкновах радикалах.
§2. Ивучтиз кинетических и равновесных щхищюб ресщий протонного оОхена жюдоя ЭПР.
Экспериментально была обнаружена взаимосвязь кежду значением рК НР и характером частотного обмена в спектрах ЭПР иеаду Н к Ю* формам: кэдлзкнкй обмен набладается да радикалов с 3<рЕ<11, быстрый - для радикалов с рК<3 и рК>11. Наблюдаемая закономерность была объяснена на основа рассмотрения двух основных кехгкизыов
, V . ,
Й -ь ИГ и ШГ+ ОН" ¡1 + Н20 (2)
протонного обмана в водных растворах, при этой было получено следующее условие кедлекного обызна:
1е { Ы < рй < 14 - 12 ( М (3),
где ди - изменение зеешкоБсксЁ частота вксокоподьной коиюненш спектра ЭП? НР при его протонзроваккл. Условие изданного обмена (Э) хорошо сплсызгзт большинство собствекшх и ииешихся в литературе экспержктальщх данных в предположении дайузнмшо-
- В -
контролируемого характера реакций (2) (кц+, к^- а ю10 М-1с-1), трансформируясь при этой для радикалов имидазолинового типа в условие 3<рК<11.
Для ряда реадай протонного обыена в НР, содровоадавдшся промежуточным частотный обиаиоы в спектрах ЗЛР, были измерены константы скоростей, а из температурных зависимостей - энергии активации соответствуют реакций (Табл.1). Отметим, что промежуточный характер частотного обмена в спектрах. ЗПР вследствие реакции (I) достигался: а) для случая обыена с акватарованныы протоном подбором
Табмщ 1. Константа скоростей, кг и к^ и энергии активации дБ для некоторое реакций протонного обмена (I) в НР при Т=21°С.
НР X (У) ЕН+ кГ й"1<5 1 V и Г° 1
(лЕ, ккал/моль) (дВ, ккал/иоль)
X уЛС сн=н-ш2 нэ0+ 8,5-Ю9 (5,8) 2,4-Ю7 с'1 (8,9)
\ / в30+ 3,1-Ю9 (6,1) 4,0-Ю6с~1(Ю,0)
1 О' нн2 2,0-103 2,0*10®
гч X РЛ (Мэ) ¥+ 5-Ю8 5-105С_1 (13)
К / ЙЭ (Н) СН3С00Н 2,0-10® 5.3-10®
V 1 0' !,!3 (Ш) СНдСООН 9,3-Ю7 9,3-Ю7
- 9 -
радикалов в соответствии с условней (3) (рК*3 и рК*И) и варьированию температуры; б) для случая обкена. с сопряженной кислотой ВН+ варьированием концентрации кислоты Ей+ при постоянной концентраций протонов. Приведенные в Тгбл.1 данные били получены машшм модз-лированиеы спектров ЭПР согласно формуле для частотного обмана по двум положениям (Н.йгёоязку et. а!., 1953) с учетш каргзрзвэкноЗ суперсверхтонкой структура, при атш варьируеида параметрами являлись времена поперечной релаксации и ' времена газни радикала (определяемые константами скоростей и кГ) в протонироваяной и депро-тонированной формах.
Как видно из таблица I наблюдается корреляция между бимолекулярной константой протонировашя и стераческой дхтупностьв атома азота ГО. Отметим также наличие термодинамического (рК(П20) -рК(Н20) = 0,4 при Т=2Э4°К) и кинетического изотопного эффекта (отнесение констант скоростей для прямей реакции к^/кц^ = 2,6 ± 0,2; для обратной = 6,9 * 0,4 при Т=294°К) при сравнении скоростей дзйтрон-ного обмена в 020 и протонного обмена в Н20 для шшдазолинового радикала (Х= СН=Н-НН2).Величина изотопного эффекта является обычной для реакций такого типа и да ее объяснения не требуется привлечения эффекта туннеяирования.
§3. Разбшие летода ептовъх рН-зондов и рН-яеяюк.
Проявление реакций протонного обмена (I) в спектрах ЗПР НР позволяет использовать НР для измерения концентрации протонов. В общем случае диапазон рН-чувствителыгости НР определяется величиной рК реакции протонного обмена в данном НР (рК радикала) и легат между рН^рК-1,5 и рН^арК+Г.б. Точность измерения рН определяется величиной аффекта в спектрах ЭПР при протонировании НР и достигает максимальной величины для радикалов ишдазолинового типа (0,05 ед.рН). В связи с этим НР инидазолинового типа оказались наиболее перспективными для использования в качестве спиновых рН-эондов и рН-меток. Изученные в работе НР в совокупности позволяют измерять рН в диапазоне 0-14.
-10 -
КспользоЕакйв рН-чувствительннх сшшоня зондов и, в особенности, :''тск требует определенного молекулярного дизайна этих сое-язганий, в таэгаю: гти соединения обязана объединять в одноз молекула нзтрохсдшяа радика лькЯ центр и индикаторную группировку, способную к обратимому протонирования. Проблей такого дазайна связан! с гса, что для проявления регистрируемой чувствительноста спектра ЕПР к рЯ индикаторная группировка долана быть максимально пркблкгенз к гатрокснльиону радиальному центру, который является сильной з.кктрокоэхцепторноа группировкой и значительно (ка 3-5 порядков) пошаэт основность индикаторных групп. Поэтому гаэлся весьма сгркачэингй ассортимент рН-чувствателыш спиновых зондов, прмгодих дтя изиерес-я з Сзгиологачэскси диапазоне рН 6 - 8.
7. » (СЯ^ (СХ12)4> (СВ^
и IV.
О ОСП-Х-Н О /
о ! о
? " ^ ^ 2 "
о Н ОС5И-Х-КН
ОН"
\ /
' «I
\, ОСМ-НСО ч\, Н3=Дэкстран,
О Холестерин а др.
П / А\ Н /Ч О |! О (4)
и ^ \ _ II
' п. а^иснз-х-н о лэ:шскн-х-кн
V/ \,
X ^ )( X
и / \ н /
КЗ^Позказян, СИ-СО-ОН и до. ' '
& 2 • 0, 0.
Специфика решаемое задачи предъявляет дополнительные требования . на молекулярную структуру спиновых рН-зондов: наличие функциональны! групп для химической модификации биологически активных молекул и макромолекул, наличие гидрофильных или гидрофобных групп и т.д.
В настоящей работе совместно с И502 СО РАН был разработан общий подход к синтезу амидкнов -производных НР кмидазолина. Этот подход обеспечивает получение набора соединений, различаюсихся по величине рК, и позволяет легко вводить их в определенные химические и биологические иолекуды, как это продемонстрировано на. схеме (4). Модифицированный данный способом декстран был использован для изучения транспорта протонов через фосфолшвдные мембраны.
¡4.Изучение щжслехбршого транспорта праноноб.
Одной из актуальных задач биоэнергетики, при решении которой было предложено использовать спиновые рй-зонда, являет''« изучение трансмембранного переноса протонов. Аля решения этой ¡задачи кь-и были лучены спин-меченый трипептнд глутатион (ИЧЛи^, рК=3,0) и спин-меченый декстран (Е-Гех<, рК=6,0), не проникание через фосфолипидные мембраны вследствие • своей гидрофильности и перекркващие диапазон чувствительности к рН от 1,5 до 7,5. Изменения спектроб ЭПР радикалов {ЮШ и Я-Юэхг, включенных во внутренний объем лило-сои, позволяй . регистрировать' кинетику изменения внутрилипосомаль-ного рН при создании градиента протонов через .мембрану. Было обнаружено, что кинетики . внугрилиюсоиального закисления в области кислых (рН=*3) и щелочных рН (рй*7) существенно отличаются: пра нейтральных рН происходит сохранение остаточного трансыеабранного градиента рН (рис.2) I в кислой области трансиембранный градиент рН полностью релаксирует.
- 12 -
Д6.8
Л
6.3
-1—г—1—|—1—г—г—1—|—I—г—I—I—г~1 I I I 1 г-
5 10 15 20
t, МИН
1—I—I—г~г-
25 I
Рис; 2. Кикэгша незнания рН внутри фосфатидилхолиновых лнпосои, регистрируете с псжщэ Бдлэченного во внутренний водный объем липосоа стш-иеченого декстрана: а) начальный градиент, лрН=0,7б (в); б) дрН=1,1Э (о); в) дрМ.ГЗ, добавлен 0,1 Ы КС1 (й).
Анализ экспериментальных кянетик свидетельствует -о реализации разных механизмов пзренсса протона в кислой и нейтральной средах. Основной иеханизиоц трансыеибранного переноса протона в изученных случаях в кислой среде болыга5 буферной еисоста (0,1 М К-цитраткый буфэр) является транспорт кислот в недиссоциированной форме, в то врегш как электрически нескомпенсировашшй транспорт протонов не-возчозен вследстЕяе установления трансиеибранного электрического потенцгшз. В соответствия с этна внводоа величина потоков протонов через шмбрану, возникащзе при создании градиента рН разный кислотами, значительно отличаются. В нейтральной среде бастрая стадия
кинет-ихи внутршпшоссмаяьного закислешш КЕН-> в присутст-
вии солей (КС1, Т1С1) сопроЕОХдазтся водленной стадией (*1/2*10 шш да 0,1 М КС!) вследствие релаксации транаахбракного электрического потенциала при транспорте конов (пТ С1") (рис.2в). Б то се время в отсутствии солей трансьгеиЗракньй потенциал и трансмекбргн-шй градаент протонов сохраняется дательное вреая I час) (рис. 2а,б). В работе определены коэффициента проницаемости фосфатидилхо-ликовой иеибраш для ионов Н+(5-10"4О1/с), СГ(Ю~госи/с), Т1+(Ю*^ см/с) (при р5Ь7) и кислот НС1 (Еоь'с), НН03 (1,4-Ю~4ск/с), НС104 (2,2 си/с) при рН*Э.
§5 .Измерение элещтесюго тютщиала и псияркосяи т поберхноспи яеябрт и белШ.
Применение сшнока рН-зондов для изучэния свойств поверхностей . в принципе позволяет определить изменение параметров реакций протонного обмена на поверхности по сравнении с гомогенный раство-роц. Зто представляет интерес для довшания каталитической роли поверхности, выяснения роли поверхностного потенциала и полярности в химических и биологических процессах. Б работе спиновые рН-зонды использованы , для определения повехностного электрического потенциала и полярности фосфэлкпвдних изыбран и белка - сывороточного альбукина человека (САЧ).
На рис.Э показано влияние рН на спектр ЭПР иаидазолиданового радакала локализованного на поверхности доиристсия фосфатн-
далхолиновой иекбраш лшюсда. Кокпьюгеркй анализ (ркс.З, пунктирные линии) дазт хорссае согласие с эксперишнтои при представления сигнала ЭПР суперпозицией двух спектров: при рН=2,0 (протоннрован-кый радикал) и рН 5,0 (непротонирозанкай радикал). Отличие спэктров ЭПР двух форы радикала, эашчавдевся в больной степени шоюОшвза-циа для протонаровакного радикала, проистекает из их различного взаимодействия с мембраной. Определенная из анализа спектров зависимость дает протокироваиной фрр^ы от рН косит тишгака вид крипсЗ титрования и позволяет определить рКА радакала на поверхности мек5-раи.
лкпосомах при различных значениях рй. Сплошные линии представляют эксперинвнтаяьнне спектра. Пунктирные ■ лики: а) спектр при рН=Э,Э динус 43% спектра непротонированного радикала при рН=5,0; б) 681 спектра протонированного радикала при рН=2,0 тихх 32* спектра не-протснированного радикала при рН=5,0; в) 525 спектра протонированного радикала при рН=2,0 гиюс 48% спектра непротонированного рада-кала при рН=5,0; г) 35% спектра протонированного радикала при рН=2,0 тиюс 65!? спектра непротокированного радакала при рН=5,0; д) спектр при рН=3,3 ¿туе 52? спектра протонированного радакала при рН=2,0. Спектра были нормированы по величине их двойного интеграла при выполнении операций сложения и вычитания спектров, но на рис.3 нормированы к одинаковой пиковой интенсивности центральной компоненту.
В общей случав
рК1 - рК0 + лрК01 + аРКро1 (4),
где рК0 - рК радикала в буферной растворе, лрКв1- сдвиг рК вследствие поверхностного электрического потенциала, у,
лрК01 = -е-7/1л(Ю)кТ (5)
(е-эаряд электрона, к-постоянная Больциана, Т-абсолютная тешерату-ра), сдвиг рК вследствие изменения полярности на поверхнос-
ти мембраны по . сравнения с раствором, который был отквлиброван для данного радикала титрованием в водно-спиртовых смесях с известкой диэлектрической пронадааюстьв, е.
Измерения р!^ на поверхности нейтральной димиристоил фосфати-дилхолиновой и отр!щателько заряженной даирнстоил фосфатидалпшце-риновой мембраны липосом позволили разделить вклады дрКе1 и ' ¿рКро1 в рК1 и определить полярность (с ^37) и потенциал поверхности. Оттек, ч;с Э5г::ашоста ' ч> от дсиш заряженного липида и от концентрации соли находятся в соответствии с уравнением (кшу-СЬарпап (рис.4).
Рис.4. Зависимость поверхностного влекгрического потенциала димиристоилфосфатидилглицериновых липосоц от концентрации соли KCl. Непрерывная кривая представляет расчет- с использованием уравнения Gouy-Chapman.
Описаний ее:9 подход к определению поверхностного потенциала а полярности бал пркиенекен та км к поверхности белка - сывороточного альбумина человека. При рИ кве изоэлоктрическсЗ точки белка (рН1во=4,9) был обнарузен сдвиг рК радикала, козалентно связанного с БН-гругаой Ш, по сравнения с рК радикала в раствора. Это позволило оценить поверхностей электрический потенциал белка (+33 ыВ при 0,01 и КС1 и рй*3), при этом зависимость ч от концентрации соли . описывалась уравнением Ро1ввоп-Во1Лгтат для потенциала изолированной сфэрачзскоЗ поверхности.
ГЛАВА 2. ГЕШШ ШЛ-ДЙШШДН0Г0 ОБМЕНА С УЧАСТИЛ.! ДИСУЛЫИДНОЯ ГРУППЫ КШКШШ РАДОЛОВ.
§1. Проявление тол-^Шулъ$идного овает б спещш ЭПР нхщюксилъкых раЗиаиов.
Присутствие в структуре НР («¡¡радикал К-Эй, где Я-кядазолиноЕЫй фрагмент) дисульфадкой связи позволяет ему вступать в раахиа тиол-дасульфадного обмен» с пилами В-5Н;
НЗ-ЗН + В-5.Ч Я-ЗН + ВЗ-ЗН (б)
Езяо показано, что спзктра ЗНР' исходного бирадикала (рс. 5а)
и мозсрадихалыш продуктоз К-ЗН н Б3-5Я (рис. 5в) существенно отличаются, что позволяет изучать данную реакцию методом ЭПР. Отметим, что наблэдаеике на рис.5 спектральные изменения рроисходят с сохранением интегральной интенсивности спектра ЭПР и, следовательно, не сопровождается возможным восстановлением нитроксильного {рагкентэ ЗН-хрушсй июла. На рас. 6 представлены зависимости относительного уменьшения пиковой интенсивности компоненты 4 и соотватствукзэго увеличения пиковой интенсивности компонента I (¿1^/1^) от отношения концентрация тиола и бирадикала. Поскольку в случае низксмолекуляргаа тиолов В-5Н (дастеин, цистеашн, глута-тион) спектра ЭПР монорадаалов КЗ-ЭБ практически идентичны, то представленное на рис. 6 зависимости мозно использовать в качестве калибровочшх для определения концентрации кизкоаолекулярных тиолов в раствора.
Рис.5. .Спектры ЗПР радикала НБ-5Й (100 икУ в 10 Й На-фосфатнои буфере, рН=7,5): ~ а) исходный спектр, усиление^ 5-Ю4); б) посла добавлэгал 15 ихй цистеаижна, усилекле 2,5-Ю4: в) после добавления I [¿3 щстзагина, усиление 3,2-Ю3.
Рис.6. Зависимость относительного увеличения пиковой интенсивности компонента 1 (^/ф и уиеныгекия пиковой интенсивности шлокакты 4 (14/1?) от отношения шщентраШ цистаашна и бирадккзла.
- 18 -
В области низких величин рН рззкция (6) существенно заиздляе-тся в становятся возиоша регистрация ое кинетики изтодси ЗП?. В табл.2 приведены кокетакта скорости ¡^ для ряда рэакцкЗ тиол-дисульфидного обкома, определенные кэтодоы ЗПР.
Таблица 2. Бяшэхулярназ константа скорости (fy) реакций тнол-дисуяьЗэдного обкена (6) бирадикала с цястекнои, цястеаыиноа,
глутэтионоч и СЛЯ при раздгшх значениях рБ.
ЗН-соедкнешз Константы скорости S^, ífV1
рН 4,00' рН 4,67 рН 5,34
Цистеaran 61 ±6 S2±I0 290*30
Цистеин 41±5 7Ш 240±30
Глутзтиол 14*2 32±4 150*20
СДЧ — 0,2±0,0i 0,7±0,1
Сильная рН-заЕйсшость констант fy свидетельствует о той, что основам изхаштаои тнол-дасульфидного обиена бирадаала с исследуе-!сля тааши является реахшя с керкатационои.
52. Кохтвтветое определение сулъфгиприльюа: групп низко- и Внсоаомолеиулщлтх соединений а&юдоя 317?.
В работ® предложен аналитический ыетод количественного определения SH-групп, обладакзлй высокой чувствительностью по концентрации тиола (ID"7 Н) и работагзга в оптически непрозрачных растворах. Катод представляется весша перс пекгивнш при исследовании биодога-чвекях объект оз, вхлзчая tkskji и клетки еивых организмов, где со-дгртягае шзкомлекуляркд теолов определяет окислителько-восстенозительное равновесие организма. Предлзгаешй метод был приаекзн да определения назконолекулярныд тиолов, в первую очередь глугзтоока, в плэзие и эритроцитах щзгей и крыс (табл.З).
Таблица 3. Концентрации ннзкоиолекулярянх тиолов в плазме и глутатиона в эритроцитах крови ишей линии СВА и крыс линии Еистар, определений различили иетодаьа
ЗН-сседанениэ
Титрование Использование Использован:;« ПНЗ реагента Эллмана бирадахала
Линия
Глутатион в 1,£±0,3 1,85±0,2
эритроцитах, 1£! 1,4±0,2 1,5±0,2
БН-соэданэнзш 40±5 50±5
в плазш, 85*10 75д7
2,0±0,2 Еистар
1,5+0,2 СЕН
4?±5 Еистар
80±3 СВА
Иатод бал такхе прщ:бкен для опрздзлзаия доступна ■ БН-група белкоз: сывороточного адьбук-иа человека (11=1) и гекячюбина (п=2).
§3. Регистрация атВноат феряеню5 Ш БШ леяюЗая ■ ШР.
Представляется перспективным использование бирадакальной спа-ново2 метки для рогастрацив активности ряда фзр«знтов, субстратами или продуктами которггх являются гаолы, таких как гяутатнонзаыкааые фэриентк. Развитый в работе иэтод бал пришод для определения активности ацетилхашэстераэы. {•ерцэнтагивяая реакция фермента с ацетилтнохоляноа (АГХ) приводит к образовав БН-содэрггщего продукта таохолина (ТХ), концентрация которого кжрялась изтодои ЭПР (рис.7). Огшсакньй иэтсд нкеет ряд прзвгущзств по сравнен® со стандартны иэтодоа Эллнанз. 1. Он обладает более васоксЗ чувствительность». Так, катодом ЭПР доступно кзаереше количеств ТХ, образованных при гидролиза АТХ за I шш в образца 200 «кл пра концентрации белка 1,3-Ю"2иг/1М, в то грсая как катод Зл-шана требует концентрации белка 1,2 иг/ил при объгыз образца I и и той ез времени реакции. 2, Определение активности иогю проводить в окрагген-нах, светорассеизашах и погясщащнх растворах, используя грубыа неочищенные гшогенатн. Э. Вреи, необходимое для оцзкхи активности ацепшолянэстеразн, составляет 1-3 юн. 4. Кетод позволяет проводить непрерывную регистрации кинетика фераентатавного процесса.
- 20 -
Рис,7. Кинетики изменения пиковой интенсивности компоненты 1 (рис. 5) бирадикэла: 1- исходный бирадякал; 2- после добавления гомогената о концентрацией белка 0,15 иг/ш; 3- после добавления ацетилтиохолина (0,4 иМ); 4-6- 10 иин преинкубации с икгибитороа ацетилхолинэстеразы даизопропилфторфосфатои (0,3 кМ, 0,56 2 ыМ,
соответственно).
Рис.Э. Распределение удельной активности ацепшолинастерззы в популяции из 98 гусениц хлопковой совки, полученное иетодом ЗЛР. Активность выражал! в ныолъ/юн нз I иг веса головы гусеници.
- 21 -
Перечкслвкнза характеристики метода сделали возможный проведение анализа распределения индивидуальной ферментативной активности в популяции гусениц хлопковой совки. Оказалось (рис.8), что распределение насекошх по активности ааетапхолиазстераза носит асимметричная характер, что указывает на гетерогенность популяции по этому признаку.
§4. Обратят людифщщж и регуляция ат&ноат феряеююв с использованием Ощиъфиднса стюбсй яеяш.
Разработка подходов, позволяют проводить обратимую кодификацию 5Н-групп активного центра ферментов, мозет быть кличоы к регуляции их феризнтативной активности. В силу обратимости реакция тиол-дисул14эдного , обмена (6) бирадикала с белками, содержаеими ЭН-группы, датаа приводить к обратимой модификации белков спиновой ыаткой. Действительно, бирадикал бнл ковалентно связан с САЧ (рис. 9а), гемоглобине«, Р-450 радуктазой.
Рис.9. Спектр ЭПР иодафщированного бирадикалом САЧ: (а) степень модифихащш белка 0,9б±0,2, концентрация белка 17,4 (б) спектр
ЭПР после добавления I iäl глутатиона к образцу (а).
а
6
В сооте-отствйя с (6) ДОбаЗЛЗЙЕЭ ЯИЗШ£0Я9КуЛЯрН0Г0 ТА ОЛЗ К рЗСТБОру
белкз правая» к расвобоздакш рздакзлз в раствор, что проявляется в изцекзэя сигнала SÎP (ряс.96). В случае ШИ1-цстохрш Р-450 рэдуктазы цодифпвди бирадаалом приводила к 03%-ншу ингибирова-нию Q3 активности, последующее se добавление глутаткояа восстанавливало активность фэртакта на 91%. Продеионстркрованкнй пригер регуляция активности фериекта представляется особенно актуальным, так как тает пршое отнесение к регулвдя срока действия, а соот-вотствешо я дозы лэкарств а адохкакетоз, иетаболизирукщися в ио-ноокекгеназной сястеиэ, содерзацей ШРН-цэтохрш Р-450 рздуктазу.
ГЛАВА 7. КСПОЛЬЗОВШЗ СШНОВОГО ОБКЕНА В ШРОКС'ЛЛЬНЫХ РЩКШХ ДЛЯ KSSPHEM СКОРОСТИ ЛОКАЛЬНОЙ ТРАНСЛЯЦИОННОЙ ДИШЗЕ1 аин-
ЬЗЧЕЕЕИ качшл.
П.ПроШш¡в спинового обхена 6 спекяраг ЭИР и переноса насащета Ш.
Рассмотрена шгогочясленкне случаи проявления спинового обыена в HP в спектроскопии ЭПР и его приетзюм в рагаах кетода спиновых зоадов. Особое вишавпе уделено использованию спинового обызна для определения козКзднентоз диффузия ешм-нэчегшх молекул, в основе которого лежат два факта. Во-перкп, скорость сгашового обмена в разбавленных растворах представляется в обычной для бимолекулярных рэакцй! форкэ с константой обм зва, K0Ï, связанной с соотзэтствугсч-
Ш КОЗффЗДЕЭНТСЫЯ ДИФФУЗИЯ СТаЛКИВаГСИХСЯ Партнеров, D, И Dg!
R0I= ^!.(Di+Da).r0.p ■ (3),
гдэ г0- расстоязкэ коку партера--î, на которой происходит роадяя сшяюеого обшяа, р- гффектвтсть обигпз -щм одком ешхнозеияя, определяемая сшя-спгяоски взаккодействкеи (для HP з растворз р=1/2). Во-вторт, csEEosuâ оСпая оказавззт вевеод на релаксацзсн-
- 23 -
кые процессы сгпшоеой системы, приводя в Т1,Т2 модели к изменению ¡эффективных времен спин-спиновой, Т2(к), а в условиях насыщения и спин-решеточной, Т^к), релаксации спинов данной компоненты спектра. Так в случае медленного обмена между одинаковыми партнерами
1/Т11а<кМ1/?112)0+Цх.с.<1-г(к)) (9),
где с - концентрация спин-меченых молекул; фактор г (к) учитывает долю столкновений спинов данной компоненты спектра ЭПР.
Регистрация концентрационных зависимостей эффективных времен спин-сгошовой релаксации методом. ЗПР, а спин-решеточной релаксации - методом переноса насыщения ЗПР делает возаохныа измерение коэффициентов диффузии сгин-мечекых нитроксилънша радикалами молекул в диапазоне Ю-5 - Ю"6 си^/с.
§2. Измерение скоростей, щхжшщтой диррузии спин-мечениг лолекцл тетдоя ЗПР.
Влияние спинового обмена на эффективное время спин-спиновой релаксации приводит к изменению лоренцовой вирины линии спектра ЗПР. На рис. 11 показаны концентрационные зависимости полной, дНд, и лоренцовой, йНл, гармн линий низкопольной компоненты спектра ЗПР иадазоликового радикала с гидрофобной цепочкой из 6 метилановых групп, Нб. Для определения ¿Нл форма линии сигнала ЗПР рассчитывалась в Еиде свертки лоренцовой и гауссовой функций. Найденная из линейной зависимости дНл(с) величина константы скорости спинового обмена, кот, дает согласно (8) езличину ¿.Э-КГ^см^с да коэф&ци-ента диффузии Яд в воде при 23 С.
Указанный подход был пргаензн для спредэлэння коэффициента диффузии рэднхада ЕГб с длинной ¡¿этиленовой цепочкой, использованный ранее для изучения фосфоятвдных мембран (см. стр.15). Для работы в области нкхэ критической концентрации ыицеллообразовакия
- 24 -
Рис.11. Концентрационные зависимости полной, дНп (•), и лоренцовой, дНд (о), Шф!га линий кизкопольной коипоненты спектра ЭПР ииидазоли-нового радикала Н^ в воде при 23°С.
колекул измерения проводила в водно-спиртовах сиесях. Коэффи-
циент диффузии в водэ был рассчитан из соотношения вязкостей
воды и соответствующей сиэси вода-зтанол по формуле Стокса-Эйкэтейна и оказался равен З.г-Ю^с^/с. Отиетиа, что изучение диффузии ащ-ыечэного радахала Н1е с данной углеводородной цепочкой и других спин-ыэчегш аналогов липидов представляет интерес для понимания процессов переноса лищов иеаду биологические иеыбрана-иа и бвлох-лящнына шшэкс8!я через водную фазу.
§3. йа«зрение скоростей локальней щххнелщитей би#узии белков яеиоОсш переноса насщяш ЗПР.
Кгиеревга локальной транелгщгонкой диффузии белков киоет принципиальное значение в связи с функциональной и пространственной кжротетерогенностья биологических структур, включая биоаембракн и клеточные органе дш. Однако традшиошай is-тод 33? недостаточно чувствителен к цадокга! скорости спинового обмана, что кэ позволяет определять коэ$$ицвенты диффуапи иенэе 10"° са^/с. Б то иэ время характеров для шгтвхрзлыак балков в идах кзкбршх kos§-фаиента дафйгзаи находятся в диапазона (2-4)-10~sca2/c.
Б связи с зтаг та бал разки коой поезд к спр»здэлэж;с иедлеишх коэффициентов даИузж бэлжоз (до 10 оГ/с), осшюкшй на регистрации спектрсз перенос« насадим ЗПР. Б осксзо подхода полоззш два факта: во-первых, вишие станового обйзнз спан-иечешп балков на а*фсшивное врш спнн-реаеточной ролакеащи I, в условиях наске:шя (да KP Т;»ТЙ); ю-Бторах, иодзльннз расчеты (D.Thotras, L.Baiton, J.Hyfls, 1S76), предсказывание лаюйную зависимость нормированной клтограягкел ияеккшюсти спектра переноса насщзння ЭПР от вроаэни шш-реито'вюЗ релаксецая. На р:;сЛ2 приведена зависимости нормированного шлегралэ спэктра переноса насацания ЗПР от концентрации сшгн-ютансго сывороточного альбумина человека, анализ которых подтгерадгет теоретические прадсказакая и возвоиет определить йозйавэта яЗфуэаа САЧ: МПО^сз^/с, Э,3»10"®<з?/с и '6,6-10~7о?/с для бежа б № водкой растворе глицерина прз I8°C, ЗЗС? и для балка в водз при 1£°С, соответственно.
Особенно парспекгивкыа разработанный подход представляется для измерения коэффициентов дкффуззш белков в гс:йранлас системах, поскольку понкззнне размерности енстекы приводит к увеличен® скорости оптового сбизна при тех es значащих дайузиоаш коэффа-щентов вследствие увеличения как эффективной концентрации бзлка так и константы скорости баюлёкуляршх столкновений.
- 2S -
Рис. 12. Зависимости нормированной интегральной интенсивности, .1зт, спектра переноса насисегаи ЗПР (2-ая гармоника сигнала поглсэдния ЭГЕР регастрзфуеиая с фазой 80° по отноазнив к фазе модуляции) от концентрации спш-мвченого Ш. Степень шдификации иалеизадной спиновой цеткоЗ составляла *7.5. Непрерывные линии представляют расчет.
ГЛАВА III. РЕАКЦИЯ ПРЕВРАЩЕНИЯ НИТРОКСИЛЬНЫХ РАДИКАЛОВ В
НЯГРОНШЙТРОКСИЛЬШг И ШНОНИТРОКСШШЕ. 51. Обпщхекиз новой шшеской реакции ггребродения НР 6 ННР и ИНР шюдаа ЗПР.
При изучении влияния рН на спектры ЗПР стабильных радикалов Э-ишдазолин-З-оксида с оксиалкильной группой в положении 2 гетеро-цикла было неожиданно обнаружено что при рНг12 спектры водных растворов этих радикалов необратимо трансформируются в более сложные иультиплетныэ спектра (рис.10).С использованием машинной симуляции
- 27 -
л
I тТ
С
О
Рис.10. Спектр ЭПР нитроксиглого радикала с оксиалкильной группой при углероде С2 в воде в различные ионенты времени после добавления 10 КОН: (=1 ит №), 1=10 шш (В), *=40 ви (С), 1=300 ши (О.
данных спектров ЭПР было показано, что они могут бать объяснены наличием двух близких констант СТВ с ядраии атсшов азота (8,67 Гс и 8,28 Гс для рис.105) и дополнительным сверхтонким взаимодействием с эквивалентными протонам (ай=3,13 Гс для 3-х эквивалентных протоков, рас.1 Об). Использование радикалов с изотопааа атоаа азота в третьем полояении гетероцикла ('^Н и 15Ю, а такхе заместителей при атоиа углерода С2 с различным количеством эквивалентных протонов
Т1ГЛ л|шл"аиаиил /чфиолчч! ивй-пачтлта или/мвоити Г'"ГО • о _И Г.1 Рл
ко, что нзбладаеыая делокалязация спиновой плотности связана с пре-
врасеккем КР в КНР (рис. 10). Этот вывод, подтвзргдается появлекш при списываемой трансформации спектров HP цалиновой окраски раствора и полос поглощения в У$-спектрах, хгрэктерких да КНР. Наличае ОН-группа при атоаэ углерода С2 гетерсцикла подтверждается обратимой трансформацией ыультиплэтного спектра ЗПР в диапазоне рН 8-11 вследствие обратимого дапротонировакия ОН-группы. §2. Изучение яатшзла превращения HP в ННР
Для установления кеханизыа превращения ЯР в НКР данная реакция изучалась в присутствии ряда окислителей при варьировании растворителя ц структуру радикала кетода&и ЗПР, ШР, КК и УФ-спектроскопии. В результате исследований совместно с НИОХ СО РАН бал предложен ноейй подход к синтезу ННР, КНР и HP с отлачвы от гякила зарастите лги при С2 (R-Ku), в основе которого легат схеиа (7) (стр. 30).
На основе предлсгенкого подходз s КЙОХ СО РАН был синтозиро-ван ряд. ношх стзбалыш КНР, ЮТ, и HP R-Hu, синтез которых в рамках юсевдпкя в литература катодов ке представляется boeuozkels.
§3. Изучение ¿изшаксишчесшс сбойсяб ■ новых HP, ННР и ПНР ras.сват ЗПР и 'Я-ЯКР.
HK?, ЕК? и К? K-lîu, К!ваз;э в своэй структуре в качестве заместителя Bu способно Еротоянроваться ISig-rpyxmy или способную) де-протонзрозаться ОН-группу, йржшиает участие в соответствукзх реакциях протонного обагна, что проявляется в их спектрах ЗПР. Так спектр ЗПР ННР, приведенного на pac.IOi», .асагмзаэт обратило трансформация в диапазоне рН 8-11, обусловленную двпротонировакиеа СН-группы при С4 и соответствуя®« увеличением азотных констант СХВ при депротоифовакзн (дэ^=0,67 Гс, ¿8^=0,23 Гс). Иаизнной симуляцией спектров ЗПР было найдзно знзчекш рХ=9,2 да ОН-группн в' указанном радакзла.
Для ШР с ¡Яд-группса при С4 и радахалоз R-Hu с ^-группой при С2 рИ-завзскне изкенекия спектров ЗПР набладзлись в кислой области püs3, при этом протокфовгию КН^-группы сопровождалось нз.чзкзкиеа констант С'ГВ с 3-кя кеэквкваяентЕдга ядрам! атскоз азота N1, НЗ и аякогрупи.
Схет превращения ИР в Ш, ШР и ИР З-шшдаэоиш-З-оксида.
X Ш О X Ни
/ р<№>3 У-И
Х,Х1,72 -заместители \/ / р(р^)Г1 V
Ни
>у \\„—-У \\
Ю1
X О X О Н НИР Н ИНР
\ / \ / I I
;=и ;=к о о
№>( Ь \ '
N Х Н ' ,\= Н
I
О'
о '"ТНгХнХ^
Ки-нуклвф1л
(онт гаэ,. 0СН3 и др.)
НР '
О* И-Ки
Было обнвруязЕО, что последовательное ззазценкз кэтияьгах групп при С2 в радикалах а-Ки (си. схему (7)) на электроноакцептор-ныв ОСНд-группы привода к делохализащш спиновой плотности на периферийные фрапотта молекулы, что проявляется в увеличении констант СТВ с фенильЕ2Л! протонами в 3-5 раз. В то же время наблэдаэт-ся постепенное рэньЕэшэ азотной кскстгнта СТВ и увеличение £-фахтора. Для одного из радикалов Н-Ни (Х=РЬ, Х1=(СН2)4СООСН3, 1(Ц=ОСНд) било обяаругэко проявление в спектрах 8ПР заторксгенного вранэнид метнленозой группа при С2 при комнатки температурах. При увеличении температура набладалась спектральные изменения, характеризуете разцоравгаакаэ врадательшх степеней свобода с внергаей активации заторвдхенного вращения (7,2 ккал/моль).
ОСЕОВШЕ ШВОШ
1. Впервые дм ряда стабильна КР, содержала кнслотно-основше группа, обнаружено проявление реакций протонного обиена в их спектрах ЗПР. Получана количественная инфораация (костанты скоростей, энергии актквщш, ьевичиш изотопного эффекта) для реакций протонного обизна с участнеи ряда КР.
3. Разработан ¡¡зтод спкзосн рН-зондоз и кеток, позволяющий проведать измерения рН в водных растворах в диапазоне 0-14 ед.рН, точность иигерошга 0,05 ед.рН. Получен ряд шдафшированка спино-сая рН-и-зткаш биологически активных колекул (глутатион, дэкстран, пол&газзн, СЕвороточккй альбугош человека и др.). Спиновые рН-зонда кспользовгки для изучения транешдбранного переноса протона. Показано отгачиз изхакхгаов перекоса протона ' через фосфолипидага иеаб-раны в кислой и нейтральней - средах. Определена коэффициенты прони-цагиости протона, ряда конов и кислот через фосфолипвдкне неибраш.
3. Сгнношз рН-зонда предложено использовать для изучения свойств поверхностей. Для рН-чувствительных НР, локализованных на поверхности фосфолппвдш кеибран н белка - сывороточного альбумина человека, обнаружена в объяснены отличая спектров ЗПР протонярован-кой и кепротокнрованноа форц радикалов. Данные радикалы использована для измерения электрического потенциала и полярности изучавши поверхностей.
4. ВпгрЕаэ обнаружено проявление роакцки тиол-дасуяьфадного обмана кеаду штрокеялькш бкралдолоц с , дисульфадной связно и рядоа тколов в спектрах ЗПР. йетодоа ЗПР кглзрекн константы скорос-той соответствуют реакций. На основе изучения реакций таол-дисульфядного об! к па в КР в работа, разработан новь& аналитический цзтод определения концентрации низко- и васокетолзкулярных тколов. ¡.'зтод обладает высокой чувствительность!) (до Ю"7И БН-групп), позволяет работать в ' поглезапцях и окргненна растворах.
5. Разработанный метод определения концентрации ЗН-содераащих соединенна приманен для определения глутатнона и других низкомоле-кулярннх тиолов в крови зизотннх. С попадью данного метода определялась активность ацетилхолинзстерази в индивидуальных инсехтах, проведен анализ распредэлекяя ферментативной активности в популяции гусениц хлопковой совки.
Осуществленная в работе обратимая кодификация некоторых белков и фермантоз бирадакзльной спиновой каткой представляется перспективной для регуляции ферментативной активности.
6. Экспериментально подтверядена зависимость нормированной интегральной интенсивности спектра переноса насыщения ЭПР от концентрации спин-азчекого белка вследствие спинового обмена. В результате был предказн новый подход к изучению локальной трансляционной диффуаи балков в диапазоне 10"6-10"бсм2/с и определены коэффициенты трансляционной дай7зии сывороточного альбумина человека в воде и водно-глицериновых сиесях.
7. йервые ютодсш ЭПР обнаружено превращение некоторых НР З-юидазолин-З-оксида в нитрошшштроксильные радакэлы и изучен механизм новой химической реакции. На основе проведенных исследований соваестно с Новосибирским ннститутои органической хиши СО РАН предлозен принципиально новый подход к синтезу ЕР З-иьвдгзолкн-З-оксида, ННР и шиношгароксилывд радикалов . Кэтодаш ЭПР и НИР изучена спектральные характеристики впервые синтезированных нитрок-сильных, нитроналнатроксилькых и гааноиитрохсильных радикалов.
Оновное содержание диссертации кзлоаено в следущих опубликованных работах:
I. Храыцов В.В., Вгйнер Л.М., Григорьев И.А., Резников В.А., Щукин
Г.И., Володарский Л.Б. Проявление з|фекта протонировакня атома КЗ в спехтрах ЭПР катроксилышх- радикалов иащазолина и икидазо-лидияа. Тез. докл. Всесоюзной кокферешш по китроксильнам радикалам - Черноголовка, 1932, - с,45.
2. Khraffitsov,V.7, Rainer, L.H, Grigar'ev, I.A. and Volodarsky.L.B. Proton exchange In stable nitrozyl radicals. ZPR study oi the pH of aqueous solutions, - Cken.Phya.Iett.,1932, 91, 69-72,
3. Храццоз B.3., BsSiisp Л.М., Будхер В.Г., Груздэв А.Д. Изучение взаимодействия бяшолшяров с иеибранаш методоа ЗПР. Тез.докл. Всесоюзной конференции "Нагнвтий резонанс в биологии а ыедиця-не - Черноголовка, 1981, с.ИО-Ш.
4. Хрвздов В.В., Всй™ш, Еа2нер Л.И., Будкер В.Г.' Изучение взаи-иодействня поланукяэотвдов с неибргнам. Тез.докл. I Всесоюзного биофизического съезда - Kocksз, 1932, - с.1.
5. Хрзщоз В.В., Вгйнар' Л.й., Григорьев И. А., Володарский Л.Б. Изучение кинегаческях и равновесных паракетроз реакций протонного обэдка з сгабильшпс нитрохсилькзи рзджалзх. Тзз.докл. Всесо-гл::сЗ коррекции "Магнитика , резонанс в исследовании химических элеиеитгрпа отсз* - Новосибирск, IS34, с.96.
6. Zhrestsov, V.V., ïïeirnr, L.H., Егеяэпко, S.I., Belcbenko, 0.1., Scbastnev.P.V., Grigcr'ev.I.A., Resnikov, Т.Д. , Proton exchange in stable nitroiyl radical:; ci imidazoline and iEidnzolidine series, - J. Ездл. Ren. ,1535 , 61, 39T-403.
7. Храыцоз B.B., Ва2нэр Л.И., Григорьев И.А., Резников В.А., ISyram Г.И., Володарский Л.Б. Влияяа протезирования а депротонирозания функцкозалшя групп ннтроксилькых радикалов ка их спектры электронного парсиаглетного резонанса. -йш.фазика, 1985, с.637-643.
8. Gruzdev.A.G., ExantsoT.V.V., Seiner, Ь.Ы. and Budker.V.G. Fluorescence polarization stuiy oi the Interaction of biopoltors eith liposor.es, - Ш5 letters, 1S52, 137 , 227-230.
9. Григорьев И.А., ¡Syran Г.!?,, Хракцов В.В., Вайнэр Л.H., старичен-ко В.О., Володарсккй Л.Б. Пресраэдкае гатроксшыпи радакалов 3-Еядазолйя-З-оксйда в трогзкзатрсксальщэ радикалы.- Изв. АН СССР, сер.хш., IS85, с.2342-2351.
10.Ebrantsov, V.7. and deiner, L.H. pH-Sensitive spin probes: ESR study of proton transport across phospholipid vesicles, in
- 33 -
Abstr. 12th. Int. Confer. Kagn. Resonance In Biological Systems -TodtEoos (Germany), 1986, p.133.
11 Khraatsov, V.V., Weiner, L.ii., Gogolev, A.Z., Grigor'ev, I. A., Starlchenko, V.P. and VolodarBfcy, L.B. ESR and PKR studies of a new class of nitroxyl, nltronylnltroxyl and imlnonltroxyl radicals,- Hagn.Res.Chea. 1936, 24, 199-207.
12.Храмцов B.B., ВаИнер Л.В. Изучение кинетики переноса протона в растворах методом сшжовах рН-зовдов. Тез. дохл. Извдународаой иколы по магнитному резонансу - Новхибирск, 1537, с.84,
13.Хравдов В.В., Вайнер Л.М. Кинетически параметра протонного обмена в стабильных нитроксильшх радикалах. - Улш. физика, 1987, с.499-505.
14.Kbraatsov,V.V. and Reiner,L.M. Proton exchange In stable nitroxyl radicals: pH-sensitlve spin probes. In: Mdaaollns Nitroxi-des (ed. Volodareliy, L.B.), 1988. 7,2, pp.37-80, CRC Press, Boca Baton.
15.KhrantB0v,V.V. and Wainer.lX Study of mechanlsnB of transneab-razie proton transport, In Abstr. 14th International Congress of Biochemistry - Prague, 1983, р.бб.
16.Храмцов В.В., Вайнер Л.И. Использование спикоемх рН-меток для определения электростатических характеристик белков и мембран. Тез. докл. VII Всессвзной конкуренции "ИагнитиыЗ резонанс в биологии и медицине" - Звенигород, 1989, с.74.
17.Храмцов В.В., Вайнер Л.Ы. Реакции переноса протона в свободных радикалах. Спшшэ рН-зовды, Успехи хеши, 1988, t.LVII, с.ШО-1466.
18.Kfcrantsov,V.V., Weiner,Ь.Ы., Ysllnova.V.I. and Gorjunova.T.E. A novel method for deteralng SH-groups In lo«- and high-nolecular «eight compounds using stable bir&dical ES-SR.ln Abstr, International Conference on lUtrozlde Radicals, -Uovoslblrek,1989, p8c.
19.Mapria B.B., Березина T.A., Володарский Л.Б., Храмцсв В.В., Вай-нер Л.М. Производные 4-гн:ш<>-Э-зшидазолин-1-оксила в качестве
спиновых "рЯ-эовдов и способ их получения. -Положительное решение по заявке на изобретение й 4330347/04 от I4.07.IS38.
20.Khramteov,V.V., ranteloev.H.V. and Welner.L.U. ESR study of proton transport across phospholipid vesicle trercbranee,- J. Bioch. Biophys. Ifathods, 1989, 18 , 237-246.
21.Хр£5£цов В.В., Блинова В.Й.,Ва2нер Л.Ы. НоЕые подхода к количественному определении SH-rpyim в низкоиолзкулярных и высокомолекулярных соединениях методой ЭПР. Использование бирадикала для обратимой модификации ферментов. Тез .докл. VII Всесоюзной конференции "Магнитный резонанс в биологии и медицине" - Звенигород, 1989, с.70.
22.Хрэд>з В.В., Бгйнер Л.М. Перенос протона в нитроксилькых радикалах на поверхности сывороточного альбумина чалоЕека. Тез.докл. II Симпозиума "Кинетика процессов переноса заряда в гомогенна и гетерогенных системах" - Батуми, IS89, с.22.
23.EhrasrtDovt V.V, Yelinova, 7.1, Bataer.L.H, Berezina, Т. A, Martin, V.V.,and Volodarsky.L.B. Quantitative Determination oi SH Groups in Iovs-aad High-L'olecular-iMght Compounds by an Electron Spin Resonance Hethod,- Analytical Biochemistry, 1939, 182, 53-63.
24.Khraatsov,VX and Weiner.L.H. pH-Sensitive epin labels: deter. mination of electrostatic characteristic of proteins and biological raercbranes, in Abstr. International Conference on Nitroride Radicals, - Kovosibirek, 1939, pi3c.
SS.KhrantEov, V.V., Seiner, L.Li., Yelinova, V.I. and GorJunova.T.E.
A пая tecimiqua for quantitative determination of SH-groups in low- and high-molecular woight compounds by ESR method, in Abstr. 19th FEBS tie sting, Roma (Italy), 1989, p.FR 505.
26.Горвнова Т.Е., Храицов B.B., Вайнер Л.М. Новый метод определения активности ацеяшолинэстеразы насекошх. Тез. докл. X Съезда Всесоюзного энтомологического общества, - Ленинград," 1939, с.28.
27.Хргщов В.В., Вайкзр Л.М., Рар В. А., Березина Т.А., Мартин,Л.Б., Володарский Л.В. Махрсяюлекулярные сянновые рН-зонды на основе
- 35 -
сывороточного альбумина человека, - Биохимия, 1990, 55, с.1014 --1017.
28.Eirantsov, V.V., Balnar, 1.И., Yelinova, 7.1. and GorJunova.T.E. Quantitative determination and reversible Ecdlficatlon oi SH-groups in lo* and high twlecular «reigfct compounds by biradlcal spin label, In Abstr. of Fourth International Sumer School on Biophysics, - Dubrovnik (Yugoslavia), 19S0,p.S5.
29.Берекша T.A., Мартин,Л.Б., Володарский Л.Б., Храадов В.В., Байкер Л.И., Синтез аидановнх производи. китроксильннх радикалов ищяззолина - новой серии рН-чувствителькых спиновых зондов 4 и маток, - Бноорга5Ш8сх2я uses, I9S0, 16, c.2S2-269.
30.Etaatsov,7.V., b'arsh.D., Welncr.L.la., BalaMrav, U.Yu. Applications ol spin pH-probes lor studies o'l transssnbrsne proton transport and curface electric potential oi asrnbranes and proteins, In Atstr.of iourth International Suiaar School on Biophysics, - Dubrovnik (Yugoslavia), 1990, p. P2T.
31.Ssinar L.ti. aid Kbraatsov V.V. Ke® possibilities oi ESR In biological eyetoss: SH groups titration and pH determination, In Abstr. ol 14th. Intern. Conference on ¡¿agnatic Resonance in Biological Systems, Ko.P15-44, Warwick, England, 1S50.
32.ShraBtsov,V., Coryunova,!?. aid Eeinor.L. Uonitoring oi enzymatic activity IN SITU by Ш - Biocb.Bioph.Bes.CoESi., 1991, 179, 520 - 527.
ЗЗ.Хргздов В.В., Блинова В.И., Горжаа.Т.Е., Вайнер Л.М. Количественное опрздзлэниэ и обратимая модификация сульфглдрильшх групп шшоыолэкуляркых и шсскоыолгкуляршх соедакений с использованием бнрадккальной спиновой мгтхи.-Биох^щ, 1991, 56, 1567-1577 , 34.Khran>tsov,7.V. and Uarsii.D. Ibsasurement of the local traslatio-onal diffusion rate3 of proteins by saturation transfer ETR spectroscopy, - BiocU.Blcpb.Acta, 1991, 1063, 257 - 260
35.Khraatsov, 7.7., Harsh, D., ielner, L.U., and Reailkov, 7.A. Tie application of pH-seiisitive spin labels to studies of surface
- 36 -
potential and polarity of phospholipid тегеЬгапез and proteins, -Bioch.Bioph.ücta, 1932, 1104, 317-324.
36.V.Kfcranteov and M.Balaklrev, Applications of spin pH-probes ior Btudlee of traaemeatorene proton transport, In: Abstr.
X7 International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems, Jerusalem P245, 124, 1992.
37.V.Khramtsov and D.Karsh, Application of pH-sensitive spin labels to studies of surface potential and polarity of phospholipid membranes and proteins, In: Abstr. XV International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems, Jerusalem, P244, 123, 1992.
33.BalaMrey,H., Khraratsov.V., Berezina,!., Martin,V., Volodarsky L., The synthesis of anidlne derivatives of Imidazoline nitroiifes- а near series of pH-sensitive spin probes and labels, Synthesis, Ко 12, 1992.
ч I '
1
Подписано к печати 27.01.93 Бумага 60x64/16
Печ.л. 2.2 Тираж 120 Заказ К? 15
Р отапринт Института катализа СО РАН г.Новосибирск
